High and Low Throughput Schermen met wortelknobbelaaltjes Meloidogyne spp.

Het algemene doel van deze procedure is het screenen van planten die zijn aangetast door wortelknobbelaaltjes. Kweek eerst gezonde zaailingen in zandgrond of kweekzakken. Produceer vervolgens een inoculum van sterk geïnfecteerde juvenielen in het tweede stadium van wortelknobbelaaltjes.

Inoculeer en infecteer vervolgens de zaailingen op de juiste wijze. Evalueer tot slot de ontwikkeling van nematode-eimassa's op het wortelsysteem van de gastheer. We zullen een high-throughput en low-throughput screening van planten met wortels demonstreren, niet van nematoden.

De belangrijkste voordelen van het high-throughput systeem zijn de beperkte ruimte die nodig is voor de plantengroei en het gemak waarmee de infectie kan worden geëvalueerd. Deze benaderingen leiden tot een reproduceerbare en uniforme infectie van plantenwortels met nematoden, en daarmee tot een betere evaluatie van de gastheerstatus van de plant. Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn in het evalueren van planten op nematodeninfecties in de wortels vaak moeite omdat ze niet het juiste ontwikkelingsstadium gebruiken om de wortels met nematoden te infecteren.

En ook door gebruik te maken van juvenielen in het infectieuze stadium van enkele dagen oud, die doorgaans een lage infectiviteit hebben. De procedure zal worden gedemonstreerd door een promovendus en een masterstudent. In mijn laboratorium zal ik de procedure demonstreren voor screening in kweekzakjes voor potproeven. Plant tomatenzaden in een enkele pot gevuld met organisch rijke grond, zoals sunshine mix, en houd de kas na kieming op 22 tot 28 °C.

Bemest eenmaal per week met Miracle-Gro. Ongeveer twee weken na de kieming, in het stadium van de twee echte bladeren, worden individuele zaailingen overgeplant in potten gevuld met steriele zandgrond, bestaande uit 90% zand en 10% organisch materiaal. Voeg OsmoCoat vertraagde afgifte meststof toe en houd de planten gedurende twee weken in een kas bij 22 tot 28 °C. Ga door met het eenmaal per week bemesten met Miracle-Gro.

Voor high-throughput screens worden plantzaden direct in trays in zanderige grond geplant. Bedek deze met plastic folie tot aan de kieming en houd ze zoals eerder beschreven in stand. Voeg na de kieming Osmo coats vertraagde afgifte meststof toe en bemest eens per week met miracle grow; laat zaden kiemen in een Petrischaal bekleed met meerdere lagen Kim White-papier in een incubator bij 25 tot 28 °C, en transfer de zaailingen vervolgens naar individuele zakjes.

Als alternatief kunnen de zaden in de papieren groef worden geplaatst om direct in individuele zakjes te kiemen. Plaats de zakjes in een plastic hangmap per map en arrangeer de mappen in een verticale positie op een rek.

Plaats het rek in een gecontroleerde klimaatkamer bij een temperatuur van 25 tot 28 °C en een lichtperiode van 16 uur. Bewater de zakjes één of twee keer per dag met omgekeerd osmosewater tijdens de donkerperiode van acht uur, ongeveer 10 tot 14 dagen na het zaaien. Wanneer er een adequaat wortelstelsel met tertiaire worteltips is ontwikkeld, zijn de zaailingen klaar voor inoculatie. Was vóór aanvang van de extractie van de eitjes het werkvlak en alle instrumenten grondig met warm water om contaminatie te voorkomen.

Plaats een emmer in een gootsteen om het op te vangen, laat de oplossing erdoorheen lopen en positioneer een steun van metaalgaas bovenop. Stapel drie zeven van boven naar beneden in volgorde van afnemende maaswijdte, zodat de eitjes in de zeef van 25 micron worden opgevangen. Snijd de toppen van de geïnfecteerde planten af en voer deze voorzichtig af.

Verwijder de plant uit de pot en was de wortels door ze in een plastic emmer met water te dopen. Spoel de wortels verder af onder stromend water totdat de bodemdeeltjes zijn weggespoeld. Extraheer vervolgens wortelknuttenematode-eieren uit de geïnfecteerde tomatenwortels.

Knip eerst de wortels met een schaar in kleine stukjes en gooi de penwortel weg. Doe de gehakte wortels van één plant in een grote plastic pot met een deksel en voeg net genoeg 10% bleekoplossing toe om de wortels te bedekken. Sluit het deksel en schud de pot gedurende twee minuten.

Open de pot en giet de wortels op de bovenste zeef en was deze met een slang die is voorzien van een vernevelingskop. Was grondig totdat de geur van bleek volledig is verdwenen. Gebruik een hamer om tegen de zijkanten van de zeven te tikken om verstoppingen van de zeef te voorkomen.

Pauzeer, verwijder de bovenste zeef en spoel het residu af. Doe hetzelfde met de tweede zeef. Verwijder de tweede zeef en verzamel het fijne residu, waaronder de eieren van de vorige zeef, met een zachte straal uit een waterfles.

Schuif het residu naar één zijde van de zeef. Verzamel het residu en de eitjes in een schoon bekerglas met een minimale hoeveelheid water. Giet het water dat in de emmer is opgevangen door de 25 micron zeef om eventueel ontsnapte eitjes op te vangen.

Spoel goed na met water en verzamel dit in hetzelfde bekerglas. Bekleed een schone metalen mand met een paar lagen Kim. Wipe-papier en plaats deze op een glazen petrischaal, waarbij een afstand van één centimeter wordt gelaten tussen de onderkant van de mand en de schaal.

Giet de geëxtraheerde nematode-eieren op het papier in de draadmand. Voeg voldoende vloeistof toe zodat de bodem van de draadmand het wateroppervlak raakt, maar niet in het water is ondergedompeld.

Dek de bovenkant elke dag af met een plastic deksel. Controleer op waterverdamping en voeg wat water toe aan de Petrischaal, zodat de bodem van het mandje het water raakt. Om te voorkomen dat de eieren uitdrogen, verzamelt u om de dag gedurende zes tot acht dagen het water dat de juvenielen in het tweede stadium of J2's bevat uit de Petrischaal in een bekerglas.

Indien niet direct gebruikt, belucht het verzamelde inoculum onmiddellijk bij kamertemperatuur met behulp van een laboratoriumluchttoevoer of lucht gegenereerd door een aquariumpomp. Begin de volgende stap door het inoculum op een magnetische roerplaat op lage snelheid te roeren. Gebruik drie aliquots van de verzamelde nematoden.

Om het aantal J twos te tellen bij de boekhouding. Dia of schaal, bereken het gemiddelde en bepaal het gewenste volume voor inoculatie. Dit zijn J twos zoals gezien onder een microscoop.

Gewoonlijk worden er 3000 J twos per plant in potten gebruikt en 500 J twos voor planten die in zaaikassen zijn gekweekt. Controleer vóór de inoculatie van de planten of de bodem vochtig is, maar niet te nat. Maak voor inoculatie in potten drie gaten van ongeveer een halve potdiepte in het zand rondom elk wortelstelsel van de tomaat.

Inoculeer elke plant met een potlood door de J twos met een pipet in de drie gaten aan te brengen. Bedek vervolgens de gaten voor de high-throughput screens in trays. Gebruik hiervoor een aangepaste, afgedichte naaldtip met zijdelingse openingen die is vastgelijmd aan een pipet van 5 mL.

Kantel een pipette om de J twos in de bodem aan te brengen. Houd de planten zes tot acht weken lang in een kas bij 24 tot 27 °C. Ga door met het twee keer per maand bemesten met Miracle-Gro.

Voor de evaluatie van de infectie. Knip de toppen af, verwijder voorzichtig de planten uit de potten en was de wortels. Kleur vervolgens de eimassa's blauw door de wortels onder te dompelen in één milligram per liter.

15 minuten lang Aerio-glossering uitvoeren. Spoel de wortels af met water en evalueer door de gekleurde eimassa's op individuele wortelsystemen te tellen. Een verlichte dissectiescoop kan worden gebruikt om de eimassa's beter te kunnen visualiseren, de nematoden te tellen, het inoculum voor te bereiden en te roeren op een magnetische roerplaat zoals eerder beschreven.

Verwijder de zakjes uit de hangmappen en plaats deze op een horizontaal oppervlak. Inoculeer elk zakje met 1.500 J2's in vijf milliliter. Til de plastic afdekking van het zakje op en verdeel de nematoden gelijkmatig over het oppervlak van de wortels.

Houd de zakjes na inoculatie 24 uur lang in een horizontale positie, afgedekt met donker papier om licht uit te sluiten. Plaats de zakjes daarna terug in de hangmappen in het water van de groeikamer. De planten moeten één of twee keer per dag gedurende ongeveer drie dagen worden bewaterd met halfsterkte Hoagland-oplossing totdat er een respons op de meststof wordt waargenomen.

Doorgaans een verbeterde vergroening van het loof en een krachtigere scheutgroei. Houd de zakjes na drie dagen vochtig met water. Ongeveer 30 dagen na inoculatie wordt elk zakje geïnfuseerd met ongeveer 10 tot 20 milliliters van 75 milligrams liter.

Luchtblazen. Houd de zakjes gedurende de nacht in horizontale positie ondergedompeld in de kleurstof. Laat de zakjes de volgende dag uitlekken en evalueer de wortelstelsels door de eimassa's te tellen onder een verlichte werktafel.

Hier zijn vergroot de wortels van een sterk geïnfecteerde tomatenplant te zien, waarbij de wijdverspreide eimassa's blauw zijn gekleurd. Het gebruik van trays maakt het mogelijk om honderden planten te screenen in een kleine groeiruimte. Groeipockets maken bovendien een snelle en efficiënte niet-destructieve evaluatie van wortel- en nematodeninfecties mogelijk, zonder dat de wortels gewassen hoeven te worden.

Deze methode maakt ook high-throughput screening mogelijk van duizenden planten in een kleine kweekruimte. Hier is het wortelstelsel te zien van een cow P plant die in een pouch is gekweekt, met blauw gekleurde eimassa's na inoculatie. De timing van de infectie is zeer kritiek bij plantassays met nematoden.

Het uitstellen van de infectie, zelfs met slechts enkele dagen, kan dus leiden tot zeer lage infectieniveaus. Na het bekijken van deze video zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe u planten infecteert met wortelknutjesnematoden en deze evalueert. Vergeet niet dat nematode-geïnfecteerde wortels zorgvuldig behandeld moeten worden.

Het autoclaveren van de wortels vóór de afvoer zal de verspreiding van de nematode beperken. Wees daarnaast voorzichtig bij het gebruik van aerial glysine vanwege de hoge doses. Het is carcinogeen.

Gebruik daarom handschoenen bij het hanteren van wortels die met deze stof zijn geïnfecteerd, evenals bij de bereiding van deze stof.