Name: Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer hoe progressieve kolonisatie van kiemvrije muizen de levermetabolisme beïnvloedt met NMR-spectroscopie. Deze methode monitort microbiële co-metabolieten in urine en analyseert leverbiopten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alle NMR spectra gebruikt als illustratieve voorbeelden zijn ontleend aan een eerder gepubliceerde studie 7, die financieel werd ondersteund door Nestle.

1. Kolonisatie van kiemvrije dieren en monsters verzamelen van <ol><li> Verwijder kiemvrije dieren uit isolatoren en onderbrengen in een conventionele veehouderij kamer in kooien zijn uitgerust met een filter in de voorkant van de gebruikelijke dieren, die zal dienen als controles (figuur 1). </li><li> Meng de helft van het nest (3 dagen oud) uit de controle-conventionele kooi met het nest van de kiem-vrije dieren. Altijd 1 / 3 van de vuile conventionele nest elke keer is het nodig om het te vernieuwen met het oog op een niveau van bacteriën (houd het in ieder geval voor 3 dagen) te handhaven. </li><li> Verzamel urine in een 1,5 ml microbuisjes door het hanteren van de muis over de buis en helpen bij mictie door zachtjes masseren de darmen. Snap-vries onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bewaar in ieder geval bij -40 ° C tot NMR-analyse. Een minimaal volume van 20 ul is vereist voor het verwerven met een 5 mm NMR probe, maar het wordt aanbevolen om 30 pi te gebruiken om de kwaliteit van het metabool profiel te verbeteren. </li><li> Dieren moet be gedood zonder gebruik van enig verdoving om confounding NMR resonanties te wijten aan het levermetabolisme van verdoving verbindingen (bijvoorbeeld gebruik cervicale dislocatie gevolgd door een bevestiging van de dood door verbloeding) te vermijden </li></ol> 2. Aanbeveling voor de inzameling van leverbiopsie <ol><li> Gebruik geen producten die alcohol bevatten om besmetting te voorkomen. Was de tools met behulp van water of alleen zoutoplossing. </li><li> Niet perforeren galblaas. In het geval van gal lekken, onmiddellijk tissue met water of zoutoplossing. </li><li> Verzamel lever biopten (Ongeveer 15-50 mg) van de linker kwab, zoals aangegeven in figuur 2. Voor reproduceerbare biopten, consequent te verzamelen in het midden van de linker kwab het vermijden van de perifere gebieden waar weefsel wordt dunner. </li><li> Snap bevriezen biopten in vloeibare stikstof onmiddellijk en bewaar ze bij -80 ° C tot NMR-analyse. </li></ol> 3. 1H NMR overname van urine microvolume </p&gt; <ol><li> Bereid 0,2 M natriumfosfaat buffer oplossing in D2O (99,8%), pH 7,4 met 1 mM 3 - (trimethylsilyl) propionzuur-d 4 (TSP). </li><li> Meng 30 pi van de urine met 30 pi van natrium fosfaat buffer. </li><li> Overdracht 50 ul van gemengde oplossing in 1,7 mm NMR-capillair (Figuur 3 (2)) met behulp van een 50 il glazen injectiespuit met een metalen naald (OD 0.5 mm). Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. </li><li> Monteer de capillaire adapter (Figuur 3 (3)) op de top van de capillaire met urine monster en plaats deze in een 2,5 mm NMR microbuisjes voor 5 mm NMR probe (Figuur 3 (1)). Gebruik deze combinatie van buizen als een gewone 5 mm NMR-buis voor spectrale acquisitie. </li><li> Gebruik de winning stang (Figuur 3 (4)) om capillair te verwijderen vanaf 2,5 mm NMR-buis door schroeven van de capillaire adapter voorzichtig om het eruit te trekken. </li></ol> . 4 1 H-HR-MAS NMR van leverweefsel biopsie: monstervoorbereiding <ol><li> MAS rotor componenten en tools zijnzoals beschreven in figuur 4. </li><li> Plaats biopsie (Ongeveer 15-50 mg) in zirkonium rotor (figuur 4) (1) en vul de rest van het volume met zuivere D 2 O voor NMR slot. Wees voorzichtig om geen enkele belletjes, omdat dit de kwaliteit van de latere vulplaten en de kwaliteit van de data-acquisitie veranderen. </li><li> Plaats 50 pi Teflon spacer (Figuur 4 (2)) met de cilindervormige schroef (Figuur 4 (5)). Schroef het en kalibreren met behulp van de dieptemeter op de korte zijde (Figuur 4 (8)). In deze stap, is het belangrijk om een ​​specifieke aandacht te besteden aan de steekproef omdat een deel daarvan kan lekken door de spacer gat. Als dit het geval is, dan is een deel van de biopsie wordt vernietigd en het gewicht monster is niet meer betrouwbaar. Het is dus noodzakelijk om opnieuw te beginnen vanaf het begin de voorbereiding van het monster. </li><li> Plaats de thead pin (Figuur 4 (3)) en voorzichtig schroef met de schroevendraaier (Figuur 4 (6)). Uitdrogen eventueel resterend water met een stukje weefsel. </li><li> Plaats de dop (Figuur 4 (4)) op detop van de rotor en steek deze in de rotor verpakker (Figuur 4 (6)). Druk stevig totdat de dop op zijn plaats. Er mag geen ruimte tussen de rotor en de dop. </li><li> Markeer de helft van de onderkant van de rotor met een zwarte marker pen optische spin detectie mogelijk te maken. </li><li> Plaats de rotor in de NMR-spectrometer en beginnen draaien op 5 kHz. Verwerven een H-NMR-spectrum met behulp van CPMG pulssequentie 13 volgens de richtlijnen van de fabrikant. </li><li> Gebruik α anomere glucose resonantie op 5,22 ppm (doublet) om NMR-spectra te kalibreren. </li><li> Om de rotor uit te pakken, ga dan verder door het verwijderen van de kap met behulp van de dop remover (Figuur 4 (9)). Schroef thead pin en verwijder de Teflon spacer met behulp van de cilindrische schroef. Grondig wassen met water en afwasmiddel. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Gut microbiële activiteit kan worden gecontroleerd met behulp van urine-metabool profiel. Een groot aantal van urine-microbiëleco-metabolieten te herkennen aan een H-NMR zijn beschreven in de literatuur 7,14-17. Deze microbiële co-metabolieten zijn vooral nuttig om de kolonisatie proces te volgen als zij een snelle en niet-invasieve manier om te schatten wanneer de nieuw opgerichte ecosysteem is stabiel. Figuur 5A illustreert duidelijk de verschijning van darm microbiële co-metabolieten over de kolonisatie proces. Deze figuur toont een urine-metabool profiel verkregen door het volgen van de procedure beschreven in stap 2 voor een dier gekoloniseerd 20 dagen met behulp van de procedure beschreven in Stap 1. Dit dier niet uitscheiden geen indoxyl sulfaat en zeer kleine hoeveelheden van phenylacetylglycine (PAG) en p-cresol sulfaat in de kiem-vrije staat (dag 0-blauw). Als kolonisatie vordert, deze 3 markers van proteïne metabolisme door de darmflora aanzienlijk te verhogen tot een evenwicht te bereiken op dag 20 (rood). Dit is gemakkelijk te volgen voor een groep van dieren, zoals geïllustreerd in Figuur 5B het gebruik van de PAGresonantie. Dit diagram werd verkregen door de integratie van de oppervlakte onder de resonanties grijs gemarkeerd in figuur 5A (δ 7.40 tot 7.43), wat overeenkomt met een specifieke resonantie (triplet) van PAG voor een groep van zeven dieren. Een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR spectroscopie is een niet-destructieve techniek die een snelle en reproduceerbare overnames van metabolische profielen van elke vorm van biopsie 18 mogelijk maakt. In dit protocol, gebruikten we deze krachtige techniek om een ​​hepatische metabole profiel van twee muizen te verkrijgen voor (blauw) en na (rood) kolonisatie (Figuur 6). Dit cijfer illustreert goed de informatie die kan worden afgeleid uit een MAS NMR-based metabole profiel. Tal van aminozuren als metabolieten afgeleid van energetische stofwisseling, zoals glucose, glycogeen, lactaat, triglyceriden, (D)-3-hydroxybutyraat en nicotinurate kunnen worden gevisualiseerd. Deze profielen bevatten ook informatie met betrekking tot oxidatieve stress (dat wil zeggen ascorbinezuur eencid, glutathion), nucleotide metabolisme (dat wil zeggen inosine, uridine) en methylamine metabolisme (dat wil zeggen choline, trimethylamine-N-oxide). In dit voorbeeld is het zeer duidelijk dat de kiem-vrije muis bijna geen glycogeen en een zeer lage hoeveelheden glucose en triglyceriden zo is eerder gepubliceerd 7 weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig1.jpg" alt="Figuur 1."/> Figuur 1. Overzicht van de kolonisatie protocol. Kiemvrije en conventionele dieren zijn gehuisvest in kooien zijn uitgerust met filters naast elkaar en hun nesten worden uitgewisseld om progressieve kolonisatie toestaan ​​van de conventionele darmflora (1). Gut microbiële activiteit wordt gecontroleerd met behulp van een H-NMR-based metabool profiel (2-3). Metabolisme in de lever wordt beoordeeld door een H-HR MAS NMR-based metabool profiel (4-5). <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig2.jpg" alt="Figuur 2."/> Figuur 2. Muis levenr anatomie. De lever wordt weergegeven, zoals de platte kant van het orgel kijkt uit op de tafel. Voor reproduceerbare biopten, wordt geadviseerd om altijd monsters van het centrum van de linker kwab, zoals aangegeven door de gestippelde rechthoek. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig3.jpg" alt="Figuur 3."/> Figuur 3 1.7 mm NMR capillaire kit om te werken met microvolumes Key:.. 1: 2,5 mm NMR microbuisjes, 2: 1,7 mm NMR capillaire buis, 3: Capillaire adapter, 4: Extraction staaf. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig4.jpg" alt="Figuur 4."/> . Figuur 4 MAS rotor apparatuur Key: 1.: MAS rotor, 2: 50 uL Teflon spacer, 3: thead pin, 4: cap, 5: cilindrische schroef, 6: schroevendraaier, 7: rotor packer, 8: dieptemeter. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig5.jpg" alt="Figuur 5."/> Figuur 5. Evolutie van de urine tijdens de metabole profielen colonization. <ol class="ualpha"><li> Zoom in op de aromatische gebied van de spectra tussen 6.8-7.8 ppm, waar microbiële co-metabolieten kan worden gevisualiseerd. 1 H-NMR-spectra werden afgeleid uit een enkel individu op dag 0 (blauw), 4 (groen), 15 (oranje) en 20 (rood) post-kolonisatie. De grijze zone komt overeen met het gebied dat werd geïntegreerd in het schema te maken in B. Key: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: Indoxyl sulfaat; Zijn: Histidine, p-cresol-S: p-Kresol sulfaat; PAG : Phenylacetylglycine. </li><li> Gemiddelde PAG concentratie tijdens kolonisatie (n = 7). Student&#39;s t-test werd gebruikt om het verschil in concentratie PAG te vergelijken op verschillende tijdstippen: a: p &lt;0,05 ten opzichte van dag 0, b: p &lt;0,01 ten opzichte van dag 10. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig6.jpg" alt="Figuur 6."/> Figuur 6. Typische 600 MHz 1 H HR-MAS NMR-spectra van de lever biopten uit kiemvrije (blauw) en ex-kiem-vrije (red) muizen. Vet protonen zijn verantwoordelijk voor de triglyceride resonantie Key:. 3-HB: 3-hydroxybutyraat, GSH: gereduceerd glutathion, TG: Triglyceriden, TMAO: Trimethylamine-N-oxide.

<ol><li>Cani, P. D., Delzenne, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microflora+as+a+target+for+energy+and+metabolic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Clin.+Nutr.+Metab.+Care%22%5BJournal%5D)">Gut microflora as a target for energy and metabolic.</a> Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).</li>
<li>Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology%3A+human+gut+microbes+associated+with+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity.</a> Nature. 444, 1022-1023 (2006).</li>
<li>Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+pandemics+and+the+modification+of+digestive+bacterial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+is+linked+to+marked+but+reversible+alterations+in+the+mouse+distal+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Host.+Microbe%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome.</a> Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).</li>
<li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+routines+cause+animal+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).</li>
<li>Muyzer, G., Smalla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+%28DGGE%29+and+temperature+gradient+gel+electrophoresis+%28TGGE%29+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).</li>
<li>Claus, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization-induced+host-gut+microbial+metabolic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Waters, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+magic+angle+spinning+1H+NMR+spectroscopy+of+intact+liver+and+kidney%3A+optimization+of+sample+preparation+procedures+and+biochemical+stability+of+tissue+during+spectral+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition.</a> Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).</li>
<li>Bollard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1H+and+1H-13C+magic+angle+spinning+NMR+spectroscopy+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver.</a> Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).</li>
<li>Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+methods+and+applications+in+biomedical+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).</li>
<li>Tate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+normal+and+renal+cell+carcinoma+kidney+cortical+biopsy+samples+using+pattern+recognition+of+%281%29H+magic+angle+spinning+%28MAS%29+NMR+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22NMR.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra.</a> NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+variation+in+metabolic+signatures+of+human+gastrointestinal+biopsies+revealed+by+high-resolution+magic-angle+spinning+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy.</a> Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22The+review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microorganisms%2C+mammalian+metabolism+and+personalized+health+care%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).</li>
<li>Martin, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+probiotic+Lactobacillus+paracasei+treatment+on+the+host+gut+tissue+metabolic+profiles+probed+via+magic-angle-spinning+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy.</a> Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).</li>
<li>Swann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+Antibiotic-Induced+Microbial+Recolonization+Impacts+on+the+Host+Metabolic+Phenotypes+of+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats.</a> J. Proteome. Res. , (2011).</li>
<li>Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-digestible+food+ingredients%2C+colonic+microbiota+and+the+impact+on+gut+health+and+immunity%3A+a+role+for+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Metab%22%5BJournal%5D)">Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics.</a> Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+magic-angle-spinning+NMR+spectroscopy+for+metabolic+profiling+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues.</a> Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHooper%2C+LV+%22Methods+in+microbiology%22">Methods in microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. 31, Academic Press. 559-589 (2002).</li>
<li>Rahija, R. J. Ch. 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRahija%2C+RJ+%22The+mouse+in+biomedical+research%22">The mouse in biomedical research</a>. Fox, J. G. , Academic Press. 217-234 (2007).</li>
<li>Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+flora+and+the+origin+of+some+urinary+aromatic+phenolic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds.</a> Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).</li>
<li>Koopman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Normalization%27+of+germfree+mice+after+direct+and+indirect+contact+with+mice+having+a+%27normal%27+intestinal+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">'Normalization' of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a 'normal' intestinal microflora.</a> Lab Anim. 20, 286-290 (1986).</li>
<li>Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+lipid-dependent+regulation+of+de+novo+lipogenesis+and+lipid+partitioning+by+ketogenic+essential+amino+acids+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+and+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice.</a> Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).</li>
<li>Spagou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GC-MS+metabolic+profiling+study+of+plasma+samples+from+mice+on+low-+and+high-fat+diets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets.</a> J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).</li>
<li>Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microbial+phenolic+acids+in+human+faeces+by+UPLC-ESI-TQ+MS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS.</a> J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).</li>
<li>Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry-based+metabolomics+in+clinical+chemistry+and+toxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review.</a> Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).</li>
<li>Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+and+potential+developments+in+the+analysis+of+urine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent and potential developments in the analysis of urine: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+spectroscopy.+Application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).</li>
<li>Bodenhausen, G., Ruben, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+abundance+15N+NMR+by+enhanced+heteronuclear+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical.+Physics.+Letters%22%5BJournal%5D)">Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy.</a> Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).</li>
<li>Fan, T. W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two-dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Fan, T., Lane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+profiling+of+metabolites+and+isotopomers+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).</li>
<li>Fonville, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+partial+least+squares+models+and+related+chemometric+approaches+in+metabonomics+and+metabolic+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemometrics%22%5BJournal%5D)">The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping.</a> Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).</li>
<li>Merrifield, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+system-wide+characterisation+of+the+pig%3A+a+model+for+human+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology.</a> Mol. Biosyst. , (2011).</li>
<li>Tugnoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+gastric+mucosa+by+HR-MAS+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Sitter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HR+MAS+MR+spectroscopic+profiles+of+breast+cancer+tissue+with+clinical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters.</a> NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschreven we een progressieve kolonisatie procedure in een open omgeving om verder te onderzoeken de impact van de darmflora op levermetabolisme beoordeeld door een H-HR-MAS NMR profilering van intacte biopsie. Verschillende methoden van kolonisatie zijn beschreven in de literatuur. De meest voorkomende methoden om dieren te koloniseren met een gedefinieerde microbiota zijn orale sondevoeding of verontreinigd drinkwater 19,20. Fecale inoculatie kan ook gebruikt worden zoals hiervoo...

Tabel van specifieke reagentia en apparatuur: <table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 2,5 mm microbuisjes </td><td> New Era </td><td> NE-H5/2.5-V-Br </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 mm capillair </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NORS175001 </td><td></td></tr><tr><td> Capillaire adapter </td><td> New Era </td><td> NE-325-5/1.7 </td><td></td></tr><tr><td> Extractie staaf </td><td> New Era </td><td> NE-341-5 </td><td></td></tr><tr><td> HR-MAS rotor BL4 met 50 ui sferische Teflon spacer kit </td><td> Bruker </td><td> HZ07213 </td><td></td></tr><tr><td> Toolkit voor 50 uL inserts </td><td> Bruker </td><td> B2950 </td><td></td></tr><tr><td> Advance III 600MHz NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 H HR-MAS NMR solide probe </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deuteriumoxide 99,9% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 530867-1L </td><td></td></tr><tr><td> 3 - (trimethylsilyl) propionzuur zuur-d 4 (TSP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 269913 </td><td></td></tr></tbody></table>

het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens progressieve kolonisatie van kiemvrije mouse door 1 h nmr-spectroscopie

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Het is bekend dat darmbacteriën belangrijke bijdrage leveren aan de host-homeostase en biedt een scala aan voordelen, zoals bescherming van het immuunsysteem en vitamine synthese. Zij verzorgen ook de gastheer met een aanzienlijke hoeveelheid aan voedingsstoffen, waardoor dit ecosysteem een ​​essentiële metabolische orgaan. In de context van steeds meer bewijs van het verband tussen de darmflora en het metabool syndroom, het begrip van de metabole interactie tussen de gastheer en zijn darmflora is steeds een belangrijke uitdaging van de moderne biologie. 1-4 Kolonisatie (ook wel aangeduid als normalisatie proces) wijst het opzetten van micro-organismen in een voormalige kiem-vrije dieren. Hoewel het een natuurlijk proces optreedt bij de geboorte, wordt het ook gebruikt bij volwassen kiemvrije dieren naar de darm bloemen ecosysteem-controle en verder bepalen de impact ervan op de host stofwisseling. Een gemeenschappelijke procedure om de kolonisatie procesbeheersing is om de maagsonde methode te gebruiken met een single of een mengsel van micro-organismen. Deze methode resulteert in een zeer snelle kolonisatie en presenteert het nadeel van de uiterst stressvolle 5. Daarom is het nuttig om de stress te minimaliseren en een tragere kolonisatie proces te krijgen geleidelijk houden aan de invloed van bacteriële vestiging op de host stofwisseling. In dit manuscript beschrijven we een procedure om de wijziging van metabolisme in de lever te beoordelen tijdens een geleidelijke kolonisatie proces met behulp van een niet-destructieve metabool profiel techniek. Wij stellen voor om darm microbiële kolonisatie monitor aan door het beoordelen van de darm microbiële metabolische activiteit weerspiegeld door de urinaire excretie van microbiële co-metabolieten door een H NMR-based metabool profiel. Hierdoor kan een appreciatie van de stabiliteit van de darm microbiële activiteit buiten de stal oprichting van de darm microbiële ecosysteem meestal bepaald door het bewaken van fecale bacteriën door DGGE (denaturerende gradiënt gel elektroforese). 6 Dekolonisatie vindt plaats in een conventionele open omgeving en wordt geïnitieerd door een vuile nest bevuild door middel van conventionele dieren, die zal dienen als controle. Knaagdieren worden coprophagous dieren, dit zorgt voor een homogene kolonisatie zoals eerder beschreven. 7 Hepatische metabool profiel wordt direct gemeten vanaf een intacte lever biopsie met behulp van een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning NMR spectroscopie. Deze semi-kwantitatieve techniek biedt een snelle manier om te beoordelen, zonder beschadiging van de celstructuur, de belangrijkste metabolieten zoals triglyceriden, glucose en glycogeen om verdere raming van de complexe interactie tussen de kolonisatie proces en het levermetabolisme 7-10. Deze methode kan ook worden toegepast op elk weefsel biopsie 11,12.

Een progressieve kolonisatie procedure wordt beschreven om nader te beoordelen de impact ervan op de host levermetabolisme. Colonization is gecontroleerd non invasief door het evalueren van de urinaire excretie van microbiële metabolieten door co-NMR-based metabool profiel, terwijl levermetabolisme wordt beoordeeld door de hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering van intact biopsie.

Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie

Het is algemeen bekend dat darmbacteriën aanzienlijk bijdragen aan de homeostase van de gastheer door een reeks voordelen te bieden, zoals immuunbescherming en vitaminen ...

Het doel van deze procedure is om de impact van een progressieve kolonisatie op het hepatische metabolisme van de gastheer te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst kiemvrije muizen progressief te koloniseren. Het kolonisatieproces wordt gemonitord door de urinaire uitscheiding van microbiële co-metabolieten te evalueren via NMR-spectroscopie.Na het monitoren van het kolonisatieproces wordt er een leverbiopt van de muis afgenomen en voorbereid voor metabolische profilering. Het hepatische metabole profiel kan vervolgens worden verkregen uit het intacte biopt met behulp van niet-destructieve high-resolution magic angle spinning NMR-spectroscopie. Uiteindelijk onthult dit gebruik van proton-NMR-spectroscopie diverse metabolieten die betrokken zijn bij metabole routes, zoals energie- en oxidatieve stressroutes.Zo kan dit experiment inzicht bieden in de leverfuncties tijdens kolonisatie. Het kan ook worden toegepast op systemen zoals de nieren. Om de dieren te koloniseren, worden kiemvrije muizen uit de isolatoren gehaald en gehuisvest in een conventionele opstalgruimte in kooien, voorzien van een filter vóór de conventionele dieren die als controles dienen.Meng vervolgens de helft v

assessing-hepatic-metabolic-changes-during-progressive-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Stabiel isotopische profilering door middel van gaschromatografie massaspectrometrische analyse van intermediaire metabole flux wordt beschreven in de...

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Monstervoorbereiding van<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming

De neurochemie van het zoogdierbrein verandert bij vele neurologische en systemische ziekten. Karakteristieke profielen van cerebrale metabolieten kunnen efficiënt worden verkregen op basis van ruwe extracten van hersenweefsel. Hiervoor wordt hoge-resolutie NMR-spectroscopie gebruikt, wat een gedetailleerde kwantitatieve analyse van metabolietenconcentraties (metabolomics) mogelijk maakt.

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Hier worden geoptimaliseerde methoden beschreven om in vivo en in vitro modellen van hepatische steatose te genereren en om de steatotische fenotypes en gerelateerde fysiologische parameters te analyseren.

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Het protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het resectie van een intacte muizenlever voor metabolische studies door middel van poortaderperfusie.

Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis

Met behulp van een dieet-geïnduceerde niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muismodel, beschrijven we het gebruik van nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling.

Nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken voor het beoordelen van de progressie van niet-alcoholische leververvetting

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie wordt gebruikt om ontregeling in de metabolieten te identificeren bij patiënten met verschillende ziekten. Deze techniek maakt het mogelijk om de gestoorde metabolieten te kwantificeren, waardoor de pathofysiologische inzichten worden ontrafeld. Hier beschrijven we de stap-voor-stap procedure van de NMR-gebaseerde benadering voor de metabole karakterisering van de patiënten.

Identificatie en kwantificering van gestoorde metabolieten bij ernstig zieke patiënten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics

Muismodel van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) met metabole disfunctie, veranderingen in levergenexpressie en histopathologische veranderingen in de lever die lijken op menselijke MASLD, waaronder fibrose die evolueert naar gevorderd fibrose stadium 3. Dit model kan worden gebruikt in studies naar de pathofysiologie van MASLD en in preklinische studies van nieuwe therapieën.

Muismodel van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte met fibrose

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

De methode beschrijft de procedure waarmee de Hawaiiaanse bobtail...

Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri</em

Leer hoe progressieve kolonisatie van kiemvrije muizen de levermetabolisme beïnvloedt met NMR-spectroscopie. Deze methode monitort microbiële co-metabolieten in urine en analyseert leverbiopten.

Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie (Video) | JoVE Journal

Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door¹ H NMR-spectroscopie

Meer video's verkennen