Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door ¹ H NMR-spectroscopie

Het doel van deze procedure is om de impact van een progressieve kolonisatie op het levermetabolisme van de gastheer te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst geleidelijk kiemloze muizen te koloniseren. Het kolonisatieproces wordt gecontroleerd door de urinaire uitscheiding van microbiële co-metabolieten te evalueren via NMR-spectroscopie.

Na het monitoren van het kolonisatieproces wordt er een leverbiopsie uit de muis genomen en voorbereid voor metabolisch profilering. Het levermetabolische profiel kan vervolgens worden verkregen uit de intacte biopsie met behulp van niet-destructieve hoge resolutie magische hoek roterende NMR-spectroscopie. Uiteindelijk onthult dit gebruik van proton NMR-spectroscopie verschillende metabolieten die betrokken zijn bij metabolische routes zoals energie- en oxidatieve stressroutes.

Dus dit experiment kan inzicht geven in de leverfuncties tijdens kolonisatie. Het kan ook worden toegepast via het systeem zoals nier. Om de dieren te koloniseren, verwijdert u de gekiemlooze muizen uit de isolatoren en plaatst u ze in een conventionele stal in kooien, uitgerust met een filter voor de conventionele dieren die als controle dienen.

Meng vervolgens de helft van een drie dagen oude worp genomen uit de controleconventionele kooi met de worp van de kiemloze dieren, verzamel urine in een 1,5 milliliter microbuis door de muis over de buis te houden en hulp door de darm voorzichtig te masseren. Een minimum van 20 microliters is vereist voor acquisitie met een vijf millimeter NMR-sonde, maar het wordt aanbevolen om 30 microliters te gebruiken om de kwaliteit van metabolische profilering te verbeteren. Bevries de urine onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar deze op ten minste min 40 graden Celsius tot NMR-analyse.

Voor de NMR-acquisitie, bereid 0,2 molaire natriumfosfaatbufferoplossing in zwaar water. pH 7,4 bevattende een millimolair TSP, meng 30 microliters van de urine met 30 microliters natriumfosfaatbuffer. Breng 50 microliters van de gemengde oplossing over in een 1,7 millimeter NMR-capillairbuis met behulp van een 50 microliter glasinjectiespuit voorzien van een metalen naald.

Zorg ervoor dat u geen luchtbellen krijgt. Plaats de capillairadadapter op de capillair die de urinemonster bevat en plaats deze in een 2,5 millimeter NMR-microbuis voor een vijf millimeter NMR-sonde. Deze combinatie van buizen kan worden gebruikt als een standaard vijf millimeter NMR-buis voor spectraal acquisitie.

In deze demonstratie wordt een Bruer Advanced Three 700 megahertz NMR-spectrometer gebruikt om de gegevens te verzamelen. Verkrijg eendimensionele proton NMR-spectra met behulp van de parameters die in het schriftelijke protocol worden besproken. Na de NMR-acquisitie, gebruik de extractiestaf om de capillair uit de 2,5 millimeter NMR-buis te verwijderen door de capillairadadapter voorzichtig uit te schroeven om deze eruit te trekken na euthanasie van dieren zoals besproken in het schriftelijke protocol.

Bereid voor op de leverbiopsie. Gebruik geen product dat alcohol bevat om besmetting te voorkomen en was gereedschappen met water of zoutoplossing. Verzamel leverbiopsies uit de linker lob voor reproduceerbare biopsies.

Verzamel consistent in het midden van de linker lob, vermijd de perifere gebieden waar het weefsel dunner is. Zorg ervoor dat u de galblaas niet perforeert in geval van gallek.

Bevries de biopsies onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 80 graden Celsius tot NMR-analyse. Om op te zetten voor H-R-M-A-S-N-M-R, plaats de derde biopsie in een zirkonium rotor en vul de rest van het volume met zuiver zwaar water voor NMR-lock. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te maken, omdat deze de kwaliteit van de daaropvolgende shimming en data-acquisitie kunnen veranderen. Plaats een 50 microliter Teflon-afstandsstuk met behulp van de cilindrische schroef.

Schroef het los en kalibreer het met behulp van de dieptemeter aan de korte kant. Plaats de draadpin op de afstandhouder en schroef hem voorzichtig vast met de schroevendraaier. Droog, eventueel overgebleven water met een stukje tissue.

Plaats vervolgens de dop bovenop de rotor en plaats deze in de rotorverpakker. Druk stevig aan tot de dop op zijn plaats zit. Er mag geen ruimte meer zijn tussen de rotor en de dop. Markeer de helft van de bodem van de rotor met een zwarte stift om optische spin-snelheidsdetectie mogelijk te maken.

Zodra de rotor voldoende is gevuld, plaats deze in de NMR-spectrometer en begin met het opstarten van vijf kilohertz. Hierbij wordt een Bruer Advanced Three 500 megahertz spectrometer gebruikt. Verkrijg proton NMR-spectrum met behulp van een CP MG pulssequentie.

Volgens de richtlijnen van de fabrikant kan de abundantie van alfa en numerieke glucose-doublet-piek bij 5,22 delen per miljoen worden gebruikt om de resulterende NMR-spectra te kalibreren. Om de rotor te ontpakken, verwijder de dop met behulp van de dopverwijderaar, schroef de draadpin los en verwijder het Teflon-afstandsstuk. Met behulp van de cilindrische schroef kan het apparaat grondig worden gewassen met water en detergent.

De verschijning van darmmicrobiële co-metabolieten gedurende het kolonisatieproces wordt duidelijk geïllustreerd in dit protonenspectrum van een urinaire metabolische profiel voor een dier dat 20 dagen gekoloniseerd is. Dit dier heeft geen indocilsulfaat uitgescheiden en zeer kleine hoeveelheden fenylacetylglycine, afgekort PAG en que-celsulfaat in de kiemloze toestand. Naarmate de kolonisatie vordert, nemen deze drie markers van eiwitmetabolisme door de darmmicrobiota aanzienlijk toe en bereiken ze op dag 20 een evenwicht.

Door de specifieke PAG-triplet-piek te integreren, was het mogelijk om de toename van deze specifieke marker in de loop van de tijd te kwantificeren. Dit diagram vertegenwoordigt de gemiddelde PAG-concentratie tijdens kolonisatie voor een groep van zeven dieren met behulp van proton H-R-M-A-S-N-M-R-spectroscopie, het levermetabolische profiel van twee muizen voor en na kolonisatie werd verkregen. Deze figuur illustreert goed de informatie die kan worden afgeleid uit A-M-A-S-N-M-R gebaseerde metabolische profielen.