Name: Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer een nieuwe techniek voor vampirische isolatie van extracellulaire vloeistof uit Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt directe analyse van pseudocoelomische vloeistof mogelijk voor onderzoek naar RNAi-signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de collaboratieve aard van de Hunter lab te erkennen, en dank hen voor de nuttige discussie en hulp dat maakte de ontwikkeling van deze techniek mogelijk en plezier. We willen graag Nigel Delaney en de Caenorhabditis Genetics Centrum voor worm en bacteriestammen bedanken. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health GM089795 subsidie ​​aan CPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben hier gepresenteerd een nieuwe methode die de isolatie en karakterisering van extracellulair vocht kan het modelorganisme C. elegans. De techniek begint met de genetische of fysieke manipulatie van donor wormen tot het totale volume van de extracellulaire vloeistof verhogen. Extracellulaire vloeistof wordt vervolgens geïsoleerd met een gemodificeerde micro-injectie techniek. De wormen zijn gemonteerd voor micro-injectie met behulp van droge agarose pads om stil te houden de wormen in de loop van de pro...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Dag</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Materiaal Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Of vóór</td&gt;<td&gt; Houd schoon, goed gevoed<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; En N2 wormen</td&gt;<td&gt; Maak injectie pads, NGM platen, NGM + Carburator / IPTG platen, OP50 LB voorraad</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak uit RNAi eten op LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Inoculeer 3 ml &#39;s nachts met RNAi voedsel</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Verplaats embryo&#39;s RNAi plaat</td&gt;<td&gt; Zaad RNAi plaat</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Shift wormen tot 25 gedurende 4 uur</td&gt;<td&gt; Maak assayplaten</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Verplaats wormen aan NGM platen schoon te maken</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric overdracht</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Recover ontvanger</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Verwijder de overdracht ontvanger</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Score Nakomelingen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabel 1.</strong&gt; Materiaal voorbereiding tijdlijn.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Apparatuur</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogusnummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter Pressure Injector</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown micropipet Puller</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagentia</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mineral Oil</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 geen 1 ½ Glazen</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borosilicaatglas Haarvaten</td&gt;<td&gt; Wereld Verduidelijking Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumhypochlorietoplossing (5% beschikbaar chloor)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; En bacteriestammen</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; De Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Glp-1</em&gt; RNAi vector<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Bron Bioscience (Ahringer Feeding Library)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Pal-1</em&gt; RNAi vector<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; De Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabel 2.</strong&gt; Specifieke reagentia en apparatuur.</p

vampiric isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

De genetisch soepel model organisme C. elegans heeft inzicht in een groot aantal biologische vragen, mogelijk gemaakt door de korte generatietijd, gemakkelijke groei en kleine omvang. Deze kleine afmetingen, maar is afgewezen voor een aantal technische benaderingen in andere modelsystemen. Bijvoorbeeld, schakelt u bloedtransfusies in zoogdiersystemen en enten technieken in planten vragen te stellen aan de bloedsomloop samenstelling en signalering. De bloedsomloop van de worm, de pseudocoelom, Tot voor kort was het onmogelijk om direct assay. Om vragen van intercellulaire signalering en de bloedsomloop samenstelling C. beantwoorden elegans onderzoekers hebben van oudsher zich tot genetische analyse, cel / weefsel-specifieke redding, en mozaïek analyse. Deze technieken leveren een middel om duidelijk wat er gebeurt tussen cellen, maar niet universeel toepasbaar bij de identificatie en karakterisering van extracellulaire moleculen. Hier presenteren we een newly ontwikkelde techniek direct assay pseudocoelomic de vloeistof van C. elegans. De techniek begint met hetzij genetische of fysieke manipulatie het volume van de extracellulaire vloeistof. Daarna worden de dieren onderworpen aan een reverse vampiric micro-injectie waarbij gebruik wordt microinjectie rig die fijne balans drukregeling toelaat. Na isolatie van extracellulaire vloeistof, kan de verzamelde vloeistof worden getest door overdracht in andere dieren of door moleculaire middelen. Om de effectiviteit van deze techniek zien we een gedetailleerde benadering assay een specifiek voorbeeld van extracellulaire signaalmoleculen, lang dsRNA tijdens een systemische respons RNAi. Hoewel karakterisering van systemische RNAi is een proof of principle voorbeeld zien we deze techniek als aan te passen aan een verscheidenheid van vragen van bloedsomloop samenstelling en signalering te beantwoorden.

Het model organisme<em&gt; C. elegans</em&gt; Gebruikt pseudocoelomic vloeistof als een passieve bloedsomloop. Directe bepaling van deze vloeistof niet eerder mogelijk. Hier presenteren we een nieuwe techniek om direct test de extracellulaire ruimte, en het gebruik van systemische silencing signalen tijdens een RNAi respons als een proof of principle voorbeeld.

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Het genetisch hanteerbare modelorganisme C. elegans heeft inzichten verschaft in een scala aan biologische vraagstukken, mogelijk gemaakt door de korte generatietijd, ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van extracellulaire vloeistof om vragen over de samenstelling en functie van pseudovloeistof te beantwoorden, zoals vragen over RNAi-signalering. Dit wordt bereikt door wormen eerst te voeden met bacteriën die dsRNA tot expressie brengen, wat resulteert in een gemakkelijk scorebaar RNAi-fenotype. Vervolgens krijgen de wormen de tijd om RNAi-silencing-signalen door het hele lichaam te verspreiden.Vervolgens wordt het totale volume aan beschikbaar extracellulair vocht verhoogd. Ten slotte wordt een micro-injectienaald gebruikt om het extracellulaire vocht te verwijderen en in een RNAi-naïef wormpje te injecteren. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van RNAi-silencing-signalen worden aangetoond door het scoren van de nakomelingen van de geïnjecteerde wormen.Met deze methode kunnen we de samenstelling van de extracellulaire vloeistof analyseren om inzicht te krijgen in niet alleen systemische RNAi, maar ook in diverse intercellulaire signaleringspaden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben vanwege de snelheid waarmee men moet werken. Om donorwormen voor te bereiden, worden bacteriën die DS RNA

vampiric-isolation-of-extracellular-fluid-from-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft een methode om hele wormen te dissocieren in een eencellige suspensie die geschikt is voor FACS of immunoprecipitatie van intacte cellen.

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: Een methode om levende cellen te isoleren

Source: Petersen, C. et. al., Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the isolation and cultivation of bacterial species associated with Caenorhabditis elegans. A bead-based lysis of C. elegans, followed by selective culturing, enables the isolation of diverse microbial strains for further analysis.

Isolation and Cultivation of Caenorhabditis elegans-Associated Bacteria

This video demonstrates the isolation of fluorescently labeled neurons from Caenorhabditis elegans. A cell suspension is obtained from transgenic worms engineered to express fluorescent protein-fused vesicular transmembrane transporters in cholinergic neurons. The fluorescently labeled neurons are then isolated using fluorescence-activated cell sorting (FACS) and maintained in culture.

Isolation of Neurons from Caenorhabditis elegans via Fluorescence-Activated Cell Sorting

Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.

Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.

Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer een nieuwe techniek voor vampirische isolatie van extracellulaire vloeistof uit Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt directe analyse van pseudocoelomische vloeistof mogelijk voor onderzoek naar RNAi-signalering.

Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit

Meer video's verkennen