Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer
4 mei 2012
De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescent gelabelde kleine moleculen of eiwitten in het cytoplasma van een gekweekte zoogdiercel te introduceren, en de geïnduceerde morfologische veranderingen van micrometer tot multi nanometer resolutie te observeren. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen te kweken op gerasterde glazen deksels en ze micro-injecteren met een fluorescent gelabelde kleine molecuul of eiwit van belang. Vervolgens worden de cellen gefixeerd in formaldehyde en geobserveerd en geïmaged met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Daarna worden de cellen gefixeerd met glutaraldehyde, gesneden, gekleurd en geïmaged met behulp van elektronenmicroscopie. Ten slotte worden beelden die zijn genomen tijdens helderveldfluorescentie en elektronenmicroscopie gecombineerd en uitgelijnd. Uiteindelijk maakt de correlatie van deze beelden het mogelijk voor de onderzoeker om hoge resolutie verstoringen geïnduceerd door de kleine molecuul of het eiwit van belang te beeldvormen.
Hallo, ik ben Dr. Evan Reddick in het laboratorium van Dr. Neil Alto in de afdeling microbiologie van het University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas. Vandaag ga ik het hebben over de M Clem procedure of de microinjectie correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van deze procedure ten opzichte van stand-alone technieken zoals micro-injectie of microscopie, is dat deze hier samen worden uitgevoerd en ondersteund door het gebruik van een gerasterd glazen deksel.
Het is dit gerasterde deksel dat onderzoekers in staat stelt om terug te keren naar dezelfde cel tijdens verschillende delen van het protocol. Bovendien biedt deze techniek de onderzoeker de mogelijkheid om geïnduceerde subcellulaire architecturale veranderingen te observeren vanuit een breed scala aan injecteerbare kleine moleculen of eiwitten van belang, en dit te doen van micrometer tot multi nanometer resolutie. Om je voor te bereiden op micro-injectie, kweek cellen zoals normale rattennier of geïmmortaliseerde baarmoederkankercellen op foto-geëtste glazen gerasterde deksels die zijn bevestigd aan twee live celschalen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% CO2.
Afhankelijk van de experimentele tijdlijn die zal worden gebruikt, pas de confluiteit van de cellen aan. Een volledig confluente plaat zal identificatie van micro-geïnjecteerde cellen in de elektronenmicroscoop erg moeilijk maken. Zaai daarom cellen zodat ze ongeveer 50% confluiteit bereiken op de dag van een korte experiment en ongeveer 25% confluiteit.
Op de dag van een langer experiment, bereid fluorescent gelabeld eiwit DNA of kleine moleculen voor in de geschikte buffer tot een eindvolume van 50 microliter. Afhankelijk van de gekozen fluor, voeg een traceerbare kleurstof toe zoals Texas rood of cascade blauw. Voeg een concentratie toe van 0,5 tot één milligram per milliliter.
Filter de oplossing door een 0,22 micron centrifugaalfilter. Na het trekken van micro-injectienaalden volgens de richtlijnen van de fabrikant, pipetteer voorzichtig microliters oplossing in het achtereinde van een naald. Laad de naald in de micro manipulator arm van een commercieel micro-injectieapparaat dat is bevestigd aan een omgekeerde microscoop.
Plaats een schaal met gekweekte cellen in de schaalhouder van de omgekeerde microscoop. Zoek cellen die groeien binnen een foto-geëtst raster en noteer de alfanumerieke identificatie van het raster. Dit zal in alle volgende stappen worden gebruikt.
Het is belangrijk om cellen voor micro-injectie te kiezen die dicht bij het centrum van het deksel zijn gehecht, en om degenen in de buurt van de periferie te vermijden. Dit is belangrijk omdat het een efficiënte overdracht van uw cellen van belang zal garanderen naar de epon hars middelpunt die later wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie. Laat de injectiearm handmatig zakken over het deksel en gebruik de micro manipulator om de naald te laten zakken tot de punt voorzichtig het oppervlak van de cellen raakt. Micro-injecteer elke tweede cel binnen het gekozen raster voor cellen die zijn gekweekt bij ongeveer 50% confluiteit. Verwacht ongeveer 80 cellen per 600 vierkante micrometer raster, wat een N geeft van ongeveer 30 tot 40 experimentele en gecontroleerde cellen.
Na het injecteren, plaats de schaal terug in de incubator voor een gewenste tijdsduur om fluorescentiemicroscopie uit te voeren. Gooi het groeimedium weg en fixeer de cellen met formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Vervang de fixeervloeistof met één XPBS.
Documenteer vervolgens de rangschikking van de cellen door vijf tot tien helderveldbeelden van het gekozen raster bij lage en hoge vergroting te maken. Om de micro-geïnjecteerde cellen te identificeren, maak fluorescente beelden bij de excitatie- en emissiegolflengtes van de inerte injectiekleurstof. Gebruik een confocale microscoop om een Zack van beelden van micro-geïnjecteerde cellen bij hoge vergroting binnen hetzelfde eerder geïmageerde raster te verzamelen.
Hoge vergroting is nodig om fluorescente beelden te correleren met subcellulaire structuren die zullen worden geïdentificeerd met behulp van elektronenmicroscopie. Na confocale beeldvorming, gebruik een dekselverwijderingsvloeistof om het deksel van de schaal te scheiden en plaats het cellaafzijde omhoog in een verse kweekschaal met één XPBS. Ga verder met verwerking voor elektronenmicroscopie.
Volg hierna standaard EM protocollen. Om de monsters te fixeren, kleuren en dehydrateren, bereid epon hars voor en plaats het deksel cellaafzijde omlaag op een epon hars gevulde buis. Laat de hars polymeriseren bij 60 graden Celsius gedurende 24 uur.
Om het deksel uit de epon hars te verwijderen. Dompel het snel in vloeibare stikstof. De temperatuurshock van 60 graden Celsius naar min 196 graden Celsius.
Ontkoppelt het deksel van de harsbuis. Wacht vijf tot tien minuten, haal vervolgens de buis, die nu vrij is van het deksel. Inspecteer onder een dissecterend microscoop het oppervlak van de hars om het raster van belang te lokaliseren.
Gebruik een steriele scheermesje of scalpel om de epon blok te trimmen zodat alleen het raster van belang zich op de top van het blok bevindt met een ultra
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De CLEM-techniek maakt de analyse van ultrastructurele morfologie van membranen en organellen mogelijk die zijn aangetast door microgeïnjecteerde moleculen. Door micromanipulatie, confocale fluorescente microscopie en elektronenmicroscopie te combineren, bereikt deze methode beeldvorming met hoge resolutie van millimeter tot multi-nanometer schalen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- De studie richt zich op de effecten van kleine moleculen of eiwitten op gekweekte zoogdiercellen.
- Fluorescente markering maakt het mogelijk om deze moleculen in cellen te volgen.
- Het combineren van verschillende microscopietechnieken verbetert de resolutie van waargenomen veranderingen.
- Het begrijpen van cellulaire reacties op verschillende resoluties is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om fluorescent gelabelde moleculen in zoogdiercellen te introduceren.
- Om morfologische veranderingen waargenomen door deze moleculen te observeren.
- Om beelden van verschillende microscopietechnieken te correleren voor gedetailleerde analyse.
Gebruikte methoden
- Kweek van zoogdiercellen op beglaasde glazen dekglasjes.
- Micro-injectie van cellen met fluorescent gelabelde kleine moleculen of eiwitten.
- Fixeren van cellen met formaldehyde voor beeldvorming met fluorescentiemicroscopie.
- Fixeren met glutaaraldehyde, sneden, kleuren en beeldvorming met behulp van elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Beelden met hoge resolutie tonen verstoringen veroorzaakt door de geïnjecteerde moleculen.
- Succesvolle uitlijning van beelden van zowel fluorescentie- als elektronenmicroscopie.
- Aangetoonde mogelijkheid van CLEM om subcellulaire structuren te analyseren.
- Inzichten geboden in de morfologische veranderingen op verschillende schalen.
Conclusies
- De CLEM-techniek is effectief voor het bestuderen van cellulaire reacties op microgeïnjecteerde moleculen.
- Het combineren van beeldvormingstechnieken maakt een uitgebreide analyse van cellulaire morfologie mogelijk.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden in neurowetenschappen en celbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) enables biopharma teams to visualize the precise subcellular localization and morphological impact of microinjected molecules in eukaryotic cells. This dual-modality approach bridges the gap between dynamic fluorescent imaging and ultrastructural electron microscopy, supporting mechanistic de-risking and target validation. Integrating CLEM into discovery workflows enhances predictive confidence in early-stage compound and biologic evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular perturbations at subcellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by correlating molecular localization with ultrastructural changes.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of protein or small molecule effects within disease-relevant cellular compartments.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and screening workflows.
- Ensures reproducibility and standardization by leveraging gridded coverslips for precise cell tracking.
- Delivers quantitative and spatially resolved data to inform compound selection and prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular morphological readouts with translational biomarker strategies when relevant.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling high-resolution mechanistic insights.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
CLEM integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution, correlative imaging of microinjected molecules and their cellular effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking molecular localization to ultrastructural outcomes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables direct comparison of experimental and control conditions through aligned fluorescence and EM images.
- Translational Research: Offers mechanistic insights that inform biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse molecular and cellular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on direct cellular evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both fluorescence and electron microscopy techniques.
- Demands access to specialized instrumentation, including microinjection systems and high-resolution microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and image alignment.
- Adaptation may be needed for different cell types or molecular classes.
- Throughput is limited by manual microinjection and imaging steps.
