Name: Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer CLEM-technieken voor subcellulaire beeldvorming in zoogdiercellen met fluorescerende micro-injectie. Deze methode combineert licht- en elektronenmicroscopie voor nanometerresolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de Alto laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook de moleculaire en cellulaire beeldvorming Facility aan de UT Southwestern Medical Center, in het bijzonder Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, en Laurie Mueller voor technische expertise en advies. We danken ook Dr Xionan Dong voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​AI083359 naar NMA

1. Mammalian Cell Culture <ol><li> Normale Rat Kidney (NRK), onsterfelijk baarmoederhalskanker (HeLa) of andere geschikte zoogdiercellijnen worden gekweekt bij 37 ° C, 5% CO2 op Photoetched glazen dekglaasjes grid aangebracht cel schotels leven (zie tabel 1 voor reagens of inrichting in dit protocol) in DMEM + 10% FBS en 1% Pen / Strep. Er dienen voorzorgsmaatregelen te worden genomen om een ​​steriele omgeving te houden bij het werken met gekweekte zoogdiercellen. </li><li> Let op experimentele tijdlijn (0-5 uur vs 1-2 dagen na injectie) de confluentie van cellen moet worden aangepast aan ~ ~ 50% of 25%, respectievelijk. </li></ol> 2. Micro-injectie <ol><li> Bereid gewenste eiwit, DNA of kleine moleculen in het kiezen van buffer, afhankelijk van de ontvankelijkheid voor cellulaire cultuur, een eindvolume van 50 pi ~. Inert fluorescerende kleurstoffen zoals Texas Red of Blue Cascadeopgenomen om de microgeïnjecteerde cellen markeren, keuze van injectie kleurstof en fluorescente probe zou niet overlappende excitatie en emissie golflengtes. De concentratie van de molecule plaats nodig voor micro-injectie moet empirisch worden bepaald en het fluorescerende kleurstoffen volgen vaak gebruikt op 0,5-1,0 mg / ml. Kenmerkend wordt rhodamine of andere fluorescerende covalent aan een molecuul van belang met een commerciële kit, maar andere methoden van detectie kan worden gebruikt afhankelijk van gevoeligheid. Voor meer informatie, zie onderstaande kritische beschouwingen. </li><li> Filter de geïnjecteerde (~ 50 pi) door een 0,22 urn filter centrifugale. Centrifugale filters de voorkeur boven vacuüm en / of spuit filtratie die verbonden dode volumes. </li><li> Om de micro-injectie naald te genereren, zijn borosilicaatglas pipetten getrokken met behulp van een Flaming-Brown Micropipet Puller volgende fabrikanten richtlijnen. Als alternatief, micro-injectienaalden kunnen worden gekocht bij leveranciers waaronder Eppendorf die femtotip micro-injectie naalden maakt. </li><li> Zorgvuldig pipetteer 4 pl van geïnjecteerde in de ongehinderd einde van de micro-injectie naald met behulp van Eppendorf 20 Femtotips. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen de getrokken micro-injectie naald. Plaats micro-injectie naald in de arm van de micromanipulator Eppendorf FemptoJet Injectman aan een omgekeerde microscoop. Voor een goede evaluatie van de micro-injectie procedure wordt de lezer gericht op een eerdere Journal of Experiments Gevisualiseerde artikel 8. </li><li> Plaats levende cellen schotel met gerasterde dekglaasje en gekweekte cellen in de schotel houder van de omgekeerde Zeiss microscoop. Zoek cellen groeien binnen een Photoetched rooster en let op de roosters alfanumerieke identificator, wordt deze gebruikt worden in alle volgende stappen. Idealiter lokaliseren cellen in het midden van het dekglaasje als volgende stappen sample overdracht beperken tot de randen van het dekglaasje. </li><li> Handmatig lagere injectie arm op zijn plaats over het dekglaasje en het gebruik van de micromanipulator joystick en controles, lagere injectienaald naar beneden totdat de punt zachtjes raakt het oppervlak van de gekweekte cellen en druk op &#39;Beperk tot verplaatsing van de naald voorbij dit punt te voorkomen en dus het breken van de breekbare getrokken borosilicaat glas. Alle andere aspecten van cel microinjectie worden uitgevoerd volgens Eppendorf FemtoJet InjectMan handleiding. De micro-injectie techniek werd onlangs gebruikt om individuele uitgescheiden virulentie eiwitten begrijpen van bacteriën 9. </li><li> Microinject iedere andere cel binnen de gekozen raster. Met cellen gekweekt bij ~ 50% confluentie, kan men verwachten ~ 80 cellen per 600 pm2 rooster (voorbeeld getoond in Fig. 3A). Derhalve op fluorescentie en elektronenmicroscopie inspectie zal er een n van ~ 30-40 experimentele en controle cellen. </li><li> Terug te plaatsen live-cell gerecht in zoogdiercelculturen incubator voor de gewenstetijd bepaald door de experimentele opzet. Als alternatief kan men direct doorgaan van micro-injectie naar time-lapse microscopie analyse om het uiterlijk van bepaalde subcellulaire structuren plaats wachten voor fixatie. </li></ol> 3. Fluorescentiemicroscopie <ol><li> Desgewenst live-cell time-lapse fluorescentie metingen van microgeïnjecteerde cellen, waarna de media vervangen met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat buffer (pH 7,4) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Echter, als levende cellen niet zijn vereist, ontdoen celgroei media en vast de cellen met 5 ml 3,7% formaldehyde in 1xPBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi fixatief en te vervangen door 5 ml 1xPBS, gaat u verder met stap 3.2. Opmerking: het is niet essentieel glutaraldehyde voegen nadat fluorescentiemicroscopie is voltooid. </li><li> Plaats de live-cell schaal met Photoetched gerasterde dekglas in een fluorescentiemicroscoop (confocale is niet vereist voor this stap) en verzamel 5-10 helderveld en fluorescerende beelden van het betreffende raster de rangschikking van de cellen (Fig. 4A) documenteren. Identificeren die cellen die zijn microgeïnjecteerd met de excitatie-en emissiegolflengten van de kleurstof inerte injectie (Fig. 4B). Het is belangrijk om beelden te verkrijgen bij verschillende vergrotingen (bijvoorbeeld 10x en 65x) om identificatie van microgeïnjecteerde cellen vergemakkelijken gepaard gaat elektronenmicroscopie. </li><li> Met een confocale fluorescentiemicroscoop, verzamel een Z-stapel microgeïnjecteerde cellen in het raster bepaald in stap 2.5 hierboven. Hoge vergroting (100x) nodig om fluorescerende beelden correleren met subcellulaire structuren die worden omschreven in elektronenmicroscopie. </li><li> De dekglaasjes worden verwijderd uit de onderkant van het cel gerechten handel verkrijgbare vloeibare en verwijdering dekglaasje geplaatst cel naar boven in een maagdelijk celkweekschaal met 5 ml1xPBS. Het dekglaasje wordt dan verwerkt voor elektronenmicroscopie zoals hieronder uiteengezet. </li></ol> 4. Transmissie Elektronen Microscopie <ol><li> 1xPBS buffer vervangen met 2 ml 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat buffer (pH 7,4) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Langere incubatietijd, hoewel niet noodzakelijk, zal helpen bij behoud van subcellulaire structuren. Opmerking: formaldehyde alleen is niet voldoende fixeermiddel voor EM analyse. </li><li> Verwijder fixatief en vlek cellen met de toevoeging van 2 ml 1% osmiumtetroxide in 0,1 M cacodylaat buffer gedurende 30 minuten gevolgd door drie wassingen met cacodylaat buffer en uiteindelijk alle buffer vervangen ddH 2 O. </li><li> Na standaard EM-protocollen, gedehydreerd het monster in een gegradeerde (70% tot 100%) reeks van ethanol. Bereid EPON hars en plaats dekglaasje cel-kant naar beneden op de top van een Epon hars gevulde buis. Toestaan ​​polymerisatie gedurende 24 uur bij 60 ° C. Door het plaatsen van de Photoetched gerasterde dekglaasje cel-kant te doenwn op de EPON hars wordt zowel de cellen van belang en het rasterpatroon naar de EPON hars tijdens de polymerisatie (in Fig. 3B). </li><li> Verwijderen dekglaasjes van EPON hars door snel onderdompelen in vloeibare stikstof en / of kokend water. Controleer het oppervlak van de hars onder een binoculair dissectie ruimte om het rooster van belang (let op: het raster babbel zal overdragen als een spiegelbeeld) te vinden. Met behulp van een steriele scheermesje of scalpel, trim de EPON blok naar beneden, zodat alleen het rooster van belang is bij de top van de EPON hars blok. </li><li> Met een ultramicrotoom verwerven seriële secties van de afgesneden blok op de gewenste dikte (~ 70 nm dikte en conventionele TEM ~ 250 nm dikte tomografische TEM). Contrast de secties met uranylacetaat en loodcitraat volgens standaard protocollen. </li></ol> 5. Correlatieve Licht en Electron Microscopy <ol><li> Verplaatsen de cellen van belang inde elektronenmicroscoop gebruik van beelden uit eerdere stappen. Zodra gemicroinjecteerd cellen van belang zijn gevestigd, gebruik maken van de hoge-resolutie confocale fluorescente beelden naar regio&#39;s te identificeren binnen de cel die van belang waren. Afbeelding deze met een hoge resolutie met behulp van TEM. Gebruik bezienswaardigheden, zoals de cel periferie en de nucleaire envelop om te bepalen welke fluorescerende z-stack beeld komt overeen met de EM snijden. </li><li> Met behulp van het grafische programma van uw keuze (bijvoorbeeld Afbeelding J, Adobe Photoshop, enz.), vermindering van de opaciteit van de fluorescerende beeld tot 50% en overlay op de TEM-opname waarmee het correleert. Lijn de beelden door het aanpassen van de schaal (vergeet niet om verhoudingen) en de rotatie van de confocale afbeelding om de TEM-beeld overeenkomen. Kleine wijzigingen aanbrengen in contrast, scherpte, etc. in de fluorescerende beeld kan helpen bij de uitlijning. Opmerking: we hebben gevonden dat heterochromatin, de nucleaire envelop, en de cel periferie een uitstekende verstuurd naar steun vertegenwoordigenin de oriëntatie van de twee beelden. </li></ol> 6. Kritische beschouwingen <ol><li> Om een ​​grote hulp bij het lokaliseren van de geïnjecteerde kleine molecule, kan een fluorescerend label, zoals Rhodamine of fluoresceïne covalent worden bevestigd met behulp van in de handel verkrijgbare kits. Aanvullende informatie wordt verkregen door een fluorescerende ectopisch tot expressie subcellulaire lokalisatie merkereiwit voor micro-injectie. Vandaar keuze van fluoroforen en inert microinjectie volgen kleurstof is belangrijk. </li><li> Kiezen voor micro-injectie cellen die dicht bij het midden van het dekglaasje hechten en voorkomen kiezen van een raster dicht bij de rand. Dit zal de grootste kans dat de cellen van belang worden overgedragen aan de EPON hars voor elektronenmicroscopie. </li><li> Confluentie van cellen iis belangrijk, als volledig confluente plaat zal identificatie van microgeïnjecteerde cellen maken in de elektronenmicroscoop moeilijk. Veeleer zaad cellen zodanig dat ze bij ~ 50% confluentie op de dag van een kort experiment of -25% confluentie op de dag van een langer (1-2 dagen) experiment. Gebruik de positie en vorm van de cellen en de lege ruimte verstuurd naar het oriënteren elektronenmicroscopie beeld. </li><li> Confocale optische plakdikte moet worden afgestemd op de behoeften van het experiment en derhalve empirisch bepaald 10. </li><li> De fixatieven formaldehyde en glutaaraldehyde moet van de hoogste kwaliteit beschikbaar zijn. Formaldehyd stellen de cellen, maar behouden de fluorescentie-eigenschappen van beide eiwitten en kleine fluorescente moleculen (zoals Rhodamine of FITC). Het zal echter bewaart de structuren hoge resolutie EM toe. Glutaraldehyde behoudt membranen en subcellulaire structuren in hoge mate voor EM analysis, maar zal aanzienlijk belemmeren fluorescentie. Zijn beide stappen fixatie is essentieel voor zowel fluorescentie microscopie en EM. De formaldehyde fixatie stap kan worden weggelaten indien het uitvoeren van levende cellen metingen als definitieve fixatie kan worden uitgevoerd door behandeling glutaraldehyde. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Deze procedure biedt de mogelijkheid om een ​​molecuul van belang direct in de eukaryote cellulaire cytoplasma en toezien op de lokalisatie en / of effecten op cellulaire en organeller architectuur van millimeter tot meerdere nanometer resolutie. Een schematische weergave van de experimentele opstelling en procedure is weergegeven in figuur 2. Deze techniek berust op micro-injectie van cellen gekweekt op een laser geëtst glas gerasterde dekglaasje (Fig. 3A), die na confocale microscopie, kan zowel de cellen van belang en het rasterpatroon dragen aan de EPON hars (Fig.3B). Een typisch micro-injectie CLEM procedure levert fluorescentie beelden en electronenmicroscoop, dat wanneer gecorreleerd, toestaan ​​zowel subcellulaire lokalisatie en ultrastructurele analyse. Cellen gekweekt op een Photoetched glazen dekglaasje gerasterde worden microgeïnjecteerd met een molecuul van belang waarna helderveld beelden worden verkregen (Fig. 4A). Een inert volgen kleurstof opgenomen om microgeïnjecteerde cellen onderscheiden van niet-microgeïnjecteerde cellen (Fig. 4B). Confocale z-stacks worden verkregen met een fluorofoor of andere identificatie aan de microgeïnjecteerde kleine molecule plaats (Fig. 4C). Het monster wordt met glutaraldehyde en verwerkt voor elektronenmicroscopie. Electronenmicroscoop worden verkregen en overlay op de cellen waarop zij corresponderen (Fig. 4D). Gebieden herbergen fluorescerende signalen worden geïnspecteerd in meer detail bij hogere vergroting (Fig. 4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Chronologie van micro-injectie CLEM procedure. Afhankelijk van de experimentele opstelling kan microinjectie en fluorescentie metingen op dezelfde dag. Voorbereiding van het monster voor elektronenmicroscopie is het meest tijdrovend vanwege de lange incubatie stappen en duurt 2-3 dagen. TEM analyse correleren fluorescentiesignalen met elektronenmicroscopie beelden kan op een dag. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2 Algemeen illustratie van de micro-injectie CLEM procedure Stap 1:.. Zoek cellen groeien op laser geëtst glas gerasterde dekglaasje en microinject molecuul van belang. Stap 2:. Capture zowel helderveld beelden en confocale fluorescente z-stapels microgeïnjecteerde cellen Stap 3: bereidendekglaasje voor EM analyse en in te bedden in EPON hars. Met behulp van overgedragen rasterpatroon, trim blokkeren zodanig dat cellen van belang zijn bij de top. Stap 4: Snijd seriële secties met ultramicrotoom Stap 5:. Correleren fluorescerende beelden met EM beelden. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> . Figuur 3 Grid patroon vergemakkelijkt de identificatie van cellen van belang Panel A toont de micro-injectie van cellen gegroeid tot ~ 50% confluentie,. Let op de rooster identificatie AK. Scale bar is 100 um. Paneel B toont de overgedragen rasterpatroon van het dekglaasje op de gepolymeriseerde EPON hars blok dat serieel zal zijn coupes na het rooster van belang is geïdentificeerd in een dissectie microscoop. Paneel C toont de overgedragen rasterpatroon in voorbereiding voor het snijden . Merk op dat de overgedragen rooster babbel is in omgekeerde op de hars blok; scale bar is 1200 pm. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> .. Figuur 4 Representatieve resultaten van microinjectie gecorreleerde licht-en elektronenmicroscopie Panel A toont de helderveld microscoop van NRK cellen groeien op een laser geëtst glas gerasterde dekglaasje; pijlen twee cellen die worden gevisualiseerd door CLEM in panels CD Panel B toont de fluorescentie. volgen van de inerte kleurstof, in casu Cascade Blue, gebruikt om cellen die werden gemicroinjecteerd identificeren. Panel C toont de overlay van helderveld en de fluorescentie ondertekening van een Rhodamine-gelabeld kleine moleculen. De twee cellen hier zijn aangegeven met pijlen in panels A &amp; B. Panel D vertegenwoordigt CLEM van helderveld, fluorescerende en elektronenmicroscopie;. Pijlpunt geeft fluorescent puncta afgebeeld bij een grotere vergroting in Panel E Scale bars zijn als volgtdieptepunten: Panelen A &amp; B, 100 micrometer; C &amp; D, 50 pm, E, 100 nm.

<ol><li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li>
<li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells%2C+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Anat%22%5BJournal%5D)">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li>
<li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li>
<li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li>
<li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li>
<li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+%28FSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325(2009).</li>
<li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li>
<li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemwogerere%2C+D+%22Confocal+Microscopy+in+Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%22">Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering</a>. , Taylor and Francis. London. (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.

Werkwijze hier gepresenteerde maakt de directe levering van gezuiverde eiwitten, nucleïnezuren of kleine moleculen van de eukaryote cytoplasma en biedt ultrahoge resolutie analyse door de correlatie van fluorescerende en elektronenmicroscopie. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust en kan worden uitgevoerd in eigen huis met veel bestaande kern faciliteiten en / of op de juiste wijze voorzien van elektronenmicroscopie labs. De techniek is ontvankelijk voor levende cellen, zodat de gebruiker de dynami...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Photoetched Coverslip en Live-cell Plate </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 urn centrifugale filtereenheid </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas Pipetten </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> Model P-97 </td><td> Gebruik programma # 4 na het uitvoeren van ramp-test </td></tr><tr><td> FemtoJet Micro-injectie-systeem </td><td> Eppendorf </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasje verwijderen Fluid </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmissie Elektronen Microscoop </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (clem) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd moleculen en hun eukaryotische subcellulaire doelen visualiseer

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

De eukaryote cel steunt op complexe, sterk gereguleerd en functioneel verschillende membraan gebonden compartimenten die een biochemische polariteit noodzakelijk te bewaren voor een goede cellulaire functie. Begrijpen hoe de enzymen, eiwitten, en het cytoskelet componenten besturen en onderhouden van deze biochemische scheiding is dan ook van het grootste belang. Het gebruik van fluorescent gelabeld moleculen te lokaliseren en / of verstoren subcellulaire compartimenten heeft een schat aan kennis en ons begrip van cellulaire regelgeving. Beeldvormingstechnieken zoals fluorescente confocale microscopie en maakt bepaling van de positie van een fluorescent gelabeld kleine molecule relatief eenvoudig, is echter de resolutie van zeer kleine beperkt 1. Anderzijds heeft elektronenmicroscopie details bekend van subcellulaire morfologie bij zeer hoge resolutie, maar de statische aard is het moeilijk te meten zeer dynamische proprocessen met precisie 2,3. Dus de combinatie van lichtmicroscopie met elektronenmicroscopie van hetzelfde monster, genoemd Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) 4,5, biedt de dubbele voordelen van ultrasnelle fluorescente beeldvorming met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie 6. Deze krachtige techniek is geïmplementeerd om vele aspecten van celbiologie 5,7 bestuderen. Sinds haar oprichting heeft deze procedure vergroot ons vermogen om subcellulaire architecturen en morfologie met een hoge resolutie te onderscheiden. Hier geven we een gestroomlijnde werkwijze voor het uitvoeren snel gevolgd door micro-injectie CLEM (Fig. 1). De microinjectie CLEM procedure kan worden gebruikt om bepaalde hoeveelheden kleine moleculen en / of eiwitten rechtstreeks in de eukaryote cel cytoplasma en onderzoeken de effecten van millimeter tot meerdere nanometer resolutie (Fig. 2). De techniek is gebaseerd op microinjectingcellen gekweekt op laser geëtst glas gerasterde dekglaasjes aan de onderkant van levende cellen gerechten en imaging zowel confocale fluorescente en elektronenmicroscopie. Lokalisatie van de cel (len) plaats wordt vergemakkelijkt door het rasterpatroon, dat gemakkelijk wordt, overgebracht samen met de cellen van belang, de EPON hars gebruikt voor immobilisatie van monsters en snijden voor elektronenmicroscopie analyse (Fig. 3). Overlay van fluorescerende en EM foto laat de gebruiker toe om de subcellulaire lokalisatie alsmede morfologische en / of ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door de microgeïnjecteerde molecule plaats (Fig. 4). Deze techniek is ontvankelijk voor tijdstippen van ≤ 5 s tot enkele uren, afhankelijk van de aard van de microgeïnjecteerde monster.

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

De eukaryote cel vertrouwt op complexe, sterk gereguleerde en functioneel verschillende door membranen begrensde compartimenten die een biochemische polariteit in stand houden ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescentielabelled kleine moleculen of eiwitten in het cytoplasma van een gekweekte zoogdiercel te introduceren en de geïnduceerde morfologische veranderingen te observeren met een resolutie variërend van micrometers tot meerdere nanometers. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen te kweken op gegrideerde glazen dekglasjes en deze vervolgens te micro-injecteren met een fluorescentielabelled klein molecuul of eiwit van belang. Vervolgens worden de cellen gefixeerd in formaldehyde en geobserveerd en afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.Vervolgens worden de cellen gefixeerd met glutaraldehyde, in coupes gesneden, gekleurd en afgebeeld met behulp van elektronenmicroscopie. Ten slotte worden de beelden die tijdens veldlichtfluorescentie- en elektronenmicroscopie zijn gemaakt, gecombineerd en uitgelijnd. Uiteindelijk stelt de correlatie van deze beelden de onderzoeker in staat om met een hoge resolutie de perturbaties af te beelden die zijn geïnduceerd door het kleine molecuul of het eiwit van belang.Hallo, ik ben Dr. Evan Reddick uit het laboratorium van Dr. Neil Alto van de afdeling microbiologie aan het University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas. Vandaag ga ik u vertellen over de M Clem-procedure, oftewel de microinjectie correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van stand-alone technieken zoals microinjectie of microscopie, is dat deze hier in samenhang worden uitgevoerd en worden ondersteund door het gebruik van een gegridde glazen dekglasplaat.Het is dit gegridde dekglas dat onderzoekers in staat stelt om tijdens verschillende fasen van het protocol terug te keren naar dezelfde cel. Bovendien biedt deze techniek de onderzoeker de mogelijkheid om geïnduceerde subcellulaire architecturale veranderingen waar te nemen door een breed scala aan injecteerbare kleine moleculen of eiwitten van belang, en dit te doen met een resolutie variërend van micrometer tot multi-nanometer. Om de kweekcellen voor te bereiden voor micro-injectie, zoals normale ratenierniercellen of geïmmortaliseerde cervicale kankercellen op foto-geëtste gegridded dekglazen die in live-celkweekschaaltjes zijn bevestigd, worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2.Pas de confluentie van de cellen aan op basis van de te gebruiken experimentele tijdlijn. Een volledig confluente plaat maakt de identificatie van micro-injecteren cellen in de elektronenmicroscoop zeer moeilijk. Zaai de cellen daarom zodanig dat ze ongeveer 50% confluentie bereiken op de dag van een kort experiment en rond de 25% confluentie voor langere experimenten.Bereid op de dag van een langer experiment fluorescent gelabelde eiwitten, DNA of kleine moleculen voor in de juiste buffer tot een eindvolume van 50 µL. Voeg, afhankelijk van de gekozen fluorofoor, een tracking-kleurstof toe zoals Texas red of cascade blue. Voeg een concentratie van 0,5 tot 1 mg/mL toe.Filter de oplossing door een centrifugale filter van 0,22 micron. Nadat de microinjectienaaldjes zijn getrokken volgens de richtlijnen van de fabrikant, worden enkele microliters van de oplossing voorzichtig met een pipet in het uiteinde van een naald gepipetteerd. Plaats de naald in de arm van de micromanipulator van een commercieel microinjectieapparaat dat is bevestigd aan een omgekeerde microscoop.Plaats een schaal met gecultiveerde cellen in de schaalhouder van de omgekeerde microscoop. Zoek cellen die groeien binnen een gefotOEtste raster en noteer de alfanumerieke identificatie van het raster. Deze zal in alle volgende stappen worden gebruikt.Het is belangrijk om cellen voor micro-injectie te kiezen die dicht bij het midden van het dekglas kleven en cellen nabij de rand te vermijden. Dit is van belang om een efficiënte overdracht van de geselecteerde cellen naar het centrale deel van de eponhars te garanderen, dat later wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie. Laat de injectiearm handmatig over het dekglas zakken en gebruik de micromanipulator om de naald te laten zakken totdat de punt zachtjes het oppervlak van de cellen raakt. Injecteer elke tweede cel binnen het gekozen raster; voor cellen die groeien bij een confluentie van ongeveer 50% worden ongeveer 80 cellen per raster van 600 vierkante micrometer verwacht, wat resulteert in een N van ongeveer 30 tot 40 experimentele en controlecellen.Plaats na het injecteren de schaal voor de gewenste tijd terug in de incubator om fluorescentiemicroscopie uit te voeren. Verwijder het groeimedium en fixeer de cellen met formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het fixeermiddel door één XPBS.Documenteer vervolgens de rangschikking van de cellen door vijf tot 10 brightfield-beelden van het gekozen raster op lage en hoge vergroting te maken. Om de geïnjecteerde cellen te identificeren, worden fluorescentiebeelden gemaakt bij de excitatie- en emissiegolflengten van de inerte injectiekleurstof. Verzamel met behulp van een confocale microscoop een z-stack van beelden van de geïnjecteerde cellen op hoge vergroting binnen hetzelfde eerder gefotografeerde raster.Hoge vergroting is nodig om fluorescente beelden te correleren met subcellulaire structuren die met behulp van elektronenmicroscopie zullen worden geïdentificeerd. Gebruik na confocale beeldvorming een vloeistof voor het verwijderen van dekglasplaten om het dekglas van de schaal te scheiden en plaats het met de celzijde naar boven in een nieuwe kweekschaal met one XPBS. Ga verder met de verwerking voor elektronenmicroscopie.Volg vervolgens de standaard EM-protocollen. Om de monsters te fixeren, te kleuren en te dehydreren, bereidt u epon-hars voor en plaatst u het dekglas met de celzijde naar beneden op een buis gevuld met epon-hars. Laat de hars 24 uur polymeriseren bij 60 °C.Om het dekglas uit de eponhars te verwijderen, wordt het snel ondergedompeld in vloeibare stikstof. De temperatuurschok gaat hierbij van 60 °C naar -196 °C.Verwijder het dekglas uit de harsbuis. Wacht vijf tot 10 minuten en haal daarna de buis op, die nu vrij is van het dekglas. Inspecteer onder een dissectiescoop het oppervlak van de hars om het gewenste raster te lokaliseren.Trim het epon-blok met een steriel scheermesje of scalpel zodanig dat alleen het raster van interesse zich op de top van het blok bevindt. Maak met een ultramicrotoom serieknippen van het getrimde blok en gebruik uranylacetaat en loodcitraat om de secties te contrasteren volgens standaardprotocollen. Lokaliseer de gewenste cellen in de elektronenmicroscoop door de relatieve positie van de cellen als leidraad te gebruiken, in combinatie met de eerder gemaakte fluorescentiebeelden met hoge resolutie.Identificeer in de elektronenmicrografie de gebieden van interesse die overeenkomen met het fluorescentiesignaal. Gebruik referentiepunten, zoals de positie van heterochromatine en de kernenvelope, om te bepalen welk fluorescent Zack-beeld correspondeert met de EM-doorsnede. Open de beelden in een analyseprogramma zoals Image J of Adobe Photoshop, verminder de opaciteit van het fluorescentiebeeld tot 50% en leg dit over het overeenkomstige TEM-beeld heen.Lijn de beelden uit door de getoonde schaal aan te passen. Hier zijn de resultaten van micro-injectie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Deze afbeelding toont de brightfield-micrografie van NRK-cellen die groeien op een lasergeëtst glazen rasterdekglaasje.Let op de achtergrondletters b en m die worden gebruikt om het raster met de geïnjecteerde cellen te identificeren. De pijlen geven de twee cellen aan die zijn geïdentificeerd en met elektronenmicroscopie zijn afgebeeld. Hier wordt een fluorescentiebeeld getoond van de inerte trackingspoormerkstof cascade blue die wordt gebruikt om micro-geïnjecteerde cellen te identificeren.Hier is een overlay van de brightfield- en fluorescentiesignalen van een amine-gelabeld klein molecuul. Dit paneel representeert de correlatie van brightfield- fluorescentie- en elektronenmicroscopie van een geïnjecteerde cel. De pijl wijst naar fluorescerende puncta die in dit paneel bij een hogere vergroting zijn afgebeeld.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u een eiwit van belang kunt micro-injecteren en de daaruit voortvloeiende subcellulaire morfologische veranderingen kunt volgen met behulp van de procedure van micro-injectie Clem of correlatieve licht- en elektronenmicroscopie.

correlative-light-electron-microscopy-clem-as-tool-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Werkwijze snel scherm waardplant vluchtige door meting van de elektrofysiologische reactie van volwassen navel orangeworm...

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Leer CLEM-technieken voor subcellulaire beeldvorming in zoogdiercellen met fluorescerende micro-injectie. Deze methode combineert licht- en elektronenmicroscopie voor nanometerresolutie.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer (Video) | JoVE Journal

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

Meer video's verkennen