Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door In Vivo Elektroporatie

Jane is overgeplaatst naar de Ontwikkeling van het Binnenoor van de Muis via in Vivo electroporatie door Ling Wang, Han Jang en John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Oké. Mijn naam is John Burgandy. Mijn laboratorium bevindt zich bij het Oregon Hearing Research Center aan de Oregon Health and Science University.

Mijn naam is Ang. Ik ben een poster in het lab van John. Ik ben ook Ang in het lab van John als onderzoeksassistent.

Onze presentatie is onderverdeeld in vier delen. Het eerste deel betreft de ventrale laparotomie. We demonstreren anesthetisering op basis van natriumpentobarbital, het testen van de adequaatheid van de anesthesie, hoornvliesbescherming, voorbereiding van de chirurgische plaats, desinfectie, het datablad voor overlevingstochirurgie bij muizen, de chirurgische suite, een ventrale middenlijnincisie door de huid en de buikwand en de externalisatie van de uterine hoorns.

Deel twee betreft trans-uteriene micro-injectie. We demonstreren trans-illuminatie van het embryo, heroriëntatie van het embryo, micro-injectie, fabricage van de pipet en micro-injectie in de otis op embryonale dag 11.5 en embryonale dag 12.5. Deel drie is in vivo electroporatie.

We demonstreerden de plaatsing van elektroden in peddelstijl en de elektroporatie van de muis-occiput op embryonale dag 11.5. Deel vier bevat representatieve resultaten. We tonen de expressie van GFP in late embryonale en vroege postnatale cochlea's.

Dit was het resultaat van in vivo elektroporatie van de Otis met een expressieplasmide op embryonale dag 11,5. Deel één: ventrale laparotomie. De moeder wordt stevig vastgehouden door de huid achter de nek, de staart en het linkerachterpootje vast te pakken. Na het afvegen van de buik met 70% ethanol wordt een intraperitoneale injectie van een anestheticum op basis van natriumpentobarbital toegediend.

De muis wordt gedurende vier tot vijf minuten in de thuiskooi geplaatst om het anestheticum te laten inwerken. Met voet- en staartknijpjes wordt de adequaatheid van de anesthesie beoordeeld. Deze moeder-muis vertoont rillingen als reactie op het staartknijpje en heeft nog twee minuten nodig voordat zij niet meer reageert op nociceptieve stimuli.

Steriele oogzalf wordt op de ogen aangebracht om de hoornvliezen tegen uitdroging te beschermen. We bereiden de operatielocatie voor in een chemische zuurkast om de verspreiding van vacht en huidschilfers te minimaliseren. De vacht wordt met een fijn mesje geschoren om de huid over de buikwand bloot te leggen.

Volledige ontharing bevordert de genezing van de incisie na de operatie. Desinfectie van de buikwand wordt bereikt door afwisselende applicaties van 70%ethanol, Betadine en 70%ethanol. Veeg altijd van rostral naar caudaal en gebruik een nieuw chirurgisch wattenstaafje of een wattenstaafje met een wattenkop.

Bij elke beurt beoordelen we de diepte en kwaliteit van de ademhaling tijdens de desinfectie om er zeker van te zijn dat het moederdier geen reactie vertoont. Na de tweede beurt met 70% ethanol hebben we het dier onmiddellijk met de ventrale zijde naar beneden op een steriel laken geplaatst en op een verwarmingsmat gelegd voor twee tot drie minuten om haar op te warmen. Dit is een geschikt moment om de preoperatieve gegevens in het logboek voor de overleving van muizen bij chirurgie vast te leggen. We hebben ons gegevensblad voor de overleving van muizen bij chirurgie als aanvullende informatie toegevoegd.

Overweeg om het gegevensblad en uw protocol voor dierenwelzijn toe te voegen, zodat de institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik kan inzien hoe u de preoperatieve, operatieve en postoperatieve gegevens zult monitoren. We vullen één logblad in voor elk chirurgisch subject. Wij geven de voorkeur aan het uitvoeren van de chirurgie in een steriele omgeving, hoewel dit voor knaagdieren doorgaans niet vereist is.

Het werkoppervlak is gescheiden van de blower-motor en de plenumbehuizing, zodat er geen trillingen worden overgebracht op de gebruiker. Voor de micro-injectie hebben we als aanvullende informatie een schema toegevoegd van de aanpassingen die we aan onze laminaire flowkast hebben aangebracht om In utero genoverdracht te faciliteren; de essentiële wijzigingen zijn een lage wat challenge en uitsparingen voor trackverlichting, verborgen stopcontacten voor de voedingskabels van instrumenten en een route voor accessoire elektrische circuits. De chirurgische suite bestaat uit de elektrische lactated ringers IV-zak, een warmwaterbad, een XY, Z-manipulator, een stereofluorescentie-dissectiemicroscoop, een glasvezellichtbron en chirurgische instrumenten.

Voetpedalen worden gebruikt om de micro-injector, de elektroporator en de focus te activeren. De chirurgische instrumenten van de microscoop worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Instrumenten moeten tussen de muizen door opnieuw worden gesteriliseerd met een glaskraalsterilisator of door de naaldvoerder opnieuw in de autoclaaf te plaatsen.

Balli-scharen, ringtangetjes en vasculaire klemmen zijn de essentiële instrumenten. Maak een incisie in de ventrale middellijn, pak de huid vast met de vasculaire klemmen en exciseer het integument met de stompe schaar; breid de incisie uit tot 10 tot 14 Millimeters. Identificeer de witte avasculaire band van bindweefsel, de linea alba genoemd, en de ventrale middellijn van de abdomen; incideer de linea alba met de stompe schaar.

Zorg ervoor dat de darmen of de inguinale vetkussentjes niet worden beschadigd. Spoel de buikholte onmiddellijk door met steriele, voorverwarmde lactaatringeroplossing. Controleer de incisies in de huid en de buikwand op bloedingen.

Directe druk met stompe pincetten stelt kleine bloedingen, indien aanwezig, stelmatig; externaliseer de rechter- en linkeruterushoorn met ringpuntpincetten. Pak de rechteruterushoorn voorzichtig vast met één ringvormig uiteinde van het pincet en trek de uterus naar de incisie in de middenlijn. Gebruik de vrije hand om de laterale zijde van de moeder voorzichtig te manipuleren om het haken van de uterus te vergemakkelijken.

De pincet mag nooit worden gebruikt om de uterus samen te drukken en naar buiten te trekken. Aangezien dit de vasculaire structuur van de uterus of de embryo's kan beschadigen, wordt de procedure voor externalisatie herhaald voor de linker uterushoorn. Spoel de vers geëxternaliseerde uterushoorns onmiddellijk voorzichtig met voorverwarmde lactaat-Ringer-oplossing; plaats de abdominale vetkussentjes of de darmen voorzichtig terug indien deze samen met de uterus naar buiten zijn getreden.

Dit komt niet vaak voor. Tweede deel: micro-injectie in de baarmoeder. De moeder is onder de objectief met lange werkafstand geplaatst en een zachte glasvezelkabel is tegen de baarmoederwand geplaatst.

De uterus wordt voorzichtig ingedrukt met een vinger van de vrije hand om de oriëntatie van het embryo gemakkelijker te kunnen bepalen. Het licht van de glasvezelkabel moet op de laagst mogelijke intensiteit staan die nog steeds een nauwkeurige beoordeling van de embryo-oriëntatie toelaat.

Intens licht kan warmte overbrengen naar de baarmoeder, wat complicaties kan veroorzaken. We houden de glasvezelverlichting en de baarmoeder in één hand en gebruiken een vinger van onze vrije hand om het embryo door middel van zachte palpatie te repositioneren. In de volgende drie videofragmenten van de microscopie EC demonstreren we de veelvoorkomende oriëntaties van het embryo in de baarmoeder.

De kijker ziet het microscopische beeld dat we tijdens transilluminatie waarnemen, hoewel transilluminatie van de uterus in zwart-wit het mogelijk maakt om de oriëntatie van het embryo in vivo vast te stellen. In dit voorbeeld bevindt het embryo zich in een kopstaande positie, waarbij het ventrale oppervlak naar de kijker is gericht. Door de uterus heen en weer te bewegen, kunnen we de rechter- en linkerachterpoten, de staart en het cephalon van het linker oog detecteren.

In dit voorbeeld staat het embryo opnieuw op zijn kop, maar is het ongeveer 90 graden gedraaid ten opzichte van de anterieure-posterieure as. Door de uterus voorzichtig heen en weer te bewegen, kunnen we de peddelvormen zien die het linkerachterste ledemaat en het linker voorste ledemaat definiëren. Ook de ruitbrein is duidelijk zichtbaar.

Het embryo bevindt zich in een rechtopstaande positie met de linkerzijde naar de kijker gericht. De ontluikende vierde ventrikel is zichtbaar als een heldere vlek in de rhomencefalon. De linker oogblaas, de linker voorpot en de linker achterpotten zijn eveneens duidelijk zichtbaar.

Zachte druk op de uterus heroriënteert de embryo's licht om detectie van de hoofdstam van de primaire hoofdader en de anterieure en posterieure vertakkingen daarvan mogelijk te maken, die respectievelijk zijn gemarkeerd met een wit en een zwart asterisk. Zoals we zullen zien, bevindt de Otis zich halverwege de anterieure en posterieure vertakkingen van de primaire hoofdader. De Otis zelf kan niet door de uterus worden gezien via transilluminatie.

We demonstreren in twee opeenvolgende videomicroscopieclips hoe het embryo opnieuw georiënteerd moet worden voor micro-injectie in de otis-assist. Het doel is om de embryonale referentiepunten te identificeren die interpolatie van de locatie van de otis in het laterale hoofd mogelijk maken. In het midden is ons doel om het embryo van een dorsale naar een laterale positie te heroriënteren, zodat we de primaire hoofdadert kan identificeren.

Het mesencephalon, de vierde ventrikel en de linker voorpoot zijn zichtbaar in dorsale positie. Lichte druk op de uterus verandert de oriëntatie van het embryo van dorsaal naar lateraal. Het linker oog, het cephalon, het mesencephalon en de vierde ventrikel zijn duidelijk zichtbaar.

De primaire hoofdaders en de posterieure zijtak hiervan, aangegeven met het asterisk, zijn ook duidelijk zichtbaar. De anterieure tak van de primaire hoofdader is niet duidelijk gedetecteerd. Ons doel is opnieuw om het embryo zodanig te oriënteren dat de primaire hoofdader kan worden geïdentificeerd, maar onder een hogere vergroting die geschikt is voor uteriene micro-injectie.

De baarmoedervaten, de decidua-band en het linker oog zijn zichtbaar in dit laterale perspectief. Lichte druk op de uterus verschuift de positie van het embryo, waardoor we het vierde ventrikel en het linker oog kunnen detecteren. De primaire hoofdadder en de posterieure zijtak hiervan, gemarkeerd door het asterisk; de primaire hoofdadder en zijn zijtakken vormen de vorm van American football-doelpalen.

De otische blaas is niet zichtbaar door de baarmoeder, maar bevindt zich in het midden van de steunen. Lynn is een injectiesequentie gestart voor één embryo. Zij verlicht de baarmoeder via transilluminatie, heroriënteert het embryo voor een micro-injectie en brengt de micro-injectiepipet, gevuld met fast green, in het beeldveld.

De micro-injectiepipet is bevestigd aan een pipethouder die wordt vastgehouden door een X, Y, z-micromanipulator. De magnetische standaard van de manipulator is bevestigd aan een stalen plaat met een Teflon-basis, waardoor de micro-injectiepipet moeiteloos grof kan worden gepositioneerd. De naald wordt op passende wijze naar voren bewogen met behulp van de knop van de voorwaartse micrometerregeling op de manipulator.

Gefabriceerde pipetten zijn essentieel voor een traumatische micro-injectie in het muisembryo in het vroege Otis-stadium. We trekken dikwandige borosilicaatglas capillaire buisjes met een horizontale pipettentrekker. De resulterende pipet, getoond in A, wordt handmatig met een pincet gebroken op de positie met een buitendiameter van ongeveer 14 tot 16 micron, aangegeven door de pijl in B. De ruwe breuk van de pipet, getoond in C, is grillig en fragiel.

We schuinen de pipet onder een hoek van ongeveer 20 graden om de pipetpunt aan te scherpen, zoals te zien in Paneel D; parameters voor het trekken en schuinen van microinjectiepipetten worden in de bijbehorende tekst vermeld. In de volgende twee videomicroscopiefragmenten demonstreren we microinjectie in het otische zakje van de muis op embryonale dag 11,5 en 12,5. Ons doel is om uteriene microinjectie in de otische zakjes van muizen op embryonale dag 11,5 te demonstreren.

Eerst injecteren we de otics zonder de aanwezigheid van de uterus om onomstotelijk aan te tonen hoe een correct gerichte injectie eruitziet. Vervolgens demonstreer we een authentieke trans-uterine micro-injectie. Voor deze eerste injectie werd de uterus volledig ingesneden om het viscerale zakje naar buiten te laten treden; de decidua-band die over de viscerale dooierzak lag, werd verwijderd.

De placenta blijft gehecht aan de uterus en het embryo is in leven. Met de uterus lokaal verwijderd zien we de vierde ventrikel, de primaire hoofdadder en diens anterieure en posterieure takken, de pipet en de geschatte locatie van de cyste in het wit. Aan het begin van deze injectiesequentie wordt bloedstroom gedetecteerd in de vasculatuur van de viscerale dooierzak.

De pipet wordt door de viscerale dooierzak naar voren geschoven en dai wordt geïnjecteerd in de osis note, het endolymfatische duct dorsaal en de positie van de otics in het centrum van de rechtopstaande delen. De otics bevindt zich halverwege de anterieure en posterieure takken van de primaire hoofdader; uteriene micro-injectie in de embryonale dag 11.5 muis-otics vereist detectie van de primaire hoofdader en ten minste één van de takken ervan om de locatie van de otische assist te schatten.

In dit diagrammatische voorbeeld worden zowel de anterieure als de posterieure takken van de primaire hoofdadder gedetecteerd, waarbij het OUC-gebied in het wit is gemarkeerd. Een realistischer beeld van het embryo is een situatie waarin de hoofdstam van de primaire hoofdadder samen met slechts één van de takken wordt gedetecteerd; in het getoonde voorbeeld is alleen de posterieure tak van de primaire hoofdadder zichtbaar, maar dit is voldoende om de locatie van de otica te interpreteren. De PT wordt door de baarmoeder naar voren geschoven en er wordt kleurstof in de otica geïnjecteerd.

We wachten 30 seconden om de kleurstof uit de vruchtzak te laten wegvloeien, waarna de endolymfatische duct dorsaal en het vestibulum zichtbaar worden. We sluiten af met een overzicht bij lage vergroting van het embryo waarvan we zojuist de cyste hebben geïnjecteerd om anatomisch perspectief te bieden; in dit beeld zijn de vierde ventrikel, het linker oog en de uterusvascularisatie zichtbaar. We demonstren de trans- en micro-injectie in de otische cyste van een muis embryo op dag 12 en micro-injectie in de beginnende vierde ventrikel van de rhombencephalon.

Door middel van transilluminatie kunnen we de primaire hoofdadder in dit linker lateraal aanzicht detecteren, evenals het oog. De pipet wordt door de uterus in de otische vesikel geschoven en de kleurstof wordt geïnjecteerd om het lumen te vullen. Om het vierde ventrikel te injecteren, roteren we het embryo 90 graden voor een dorsaal aanzicht van de rhomencefalon.

De geïnjecteerde linker cyste bevindt zich nu aan de linkerzijde. De pipet wordt door de uterus voortgestuwd en fast green gemengd met lor. Geconjugeerde dextraan wordt in het vierde ventrikel geïnjecteerd.

Let op dat het geïnjecteerde volume kleurstof in vivo niet in de middenhersenen terechtkomt. De fluorescentie wordt na de injectie beoordeeld om de lokalisatie van dextran in de vierde ventrikel te valideren. Het embryo wordt vervolgens heroriëntueerd van een dorsale naar een laterale positie.

De endolymfatische duct bevindt zich in dit laterale aanzicht net ventraal van het vierde ventrikel. In vivo fluorescentie valideert de lokalisatie van de dextran in het vierde ventrikel. Bij de geboorte screenen we de pups op groene fluorescentie in het vierde ventrikel met behulp van epifluorescentie.

Met een dissectiemicroscoop wordt waargenomen dat pups met groene fluorescentie in hun achterhersenen een binnenoor hebben dat tijdens de embryogenese werd gemanipuleerd in deel drie: in vivo electroporatie. Nadat de cyste is gevuld met het expressieplasmide, wordt de uterus verspoeld met voorverwarmde lactaatringeroplossing. Transilluminatie vergemakkelijkt het centreren van de ODU-cyste in het elektrodenveld.

De metalen kop van de glasvezelverlichting wordt teruggetrokken van het oppervlak van de baarmoeder. Voordat de blokgolf-pulstrein wordt gestart, tonen we in het volgende microscopy-videoclip een volledige electroporatiecyclus in vivo. Voor electroporatie van de otische cyste van een muisembryo op dag 11.5 is het voorzichtig plaatsen van de pedelelektroden op de baarmoeder vereist.

In dit voorbeeld is de linker otische cyste gevuld met expressieplasmid en is de uterus vers gespoeld met Ringerlactaat. De kathode is lateraal ten opzichte van de gevulde otische cyste geplaatst en de anode is mediaal gepositioneerd. Aan het begin van de electroporatiereeks is de otische cyste gecentreerd in het veld van de elektroden. De uterus wordt voorzichtig gecomprimeerd en de square-wave pulstrein wordt gestart met een voetpedaalschakelaar.

Idealiter wordt per puls een stroomsterkte van 60 tot honderd milliampère toegediend. De uterus wordt vervolgens losgelaten en onmiddellijk geïrrigeerd. De vers geïrrigeerde uterus wordt met zachte druk met de ringtang teruggeplaatst in de buikholte.

Zodra de uterus is geïnternaliseerd, wordt de buikholte gespoeld met ongeveer 4 ml lactated Ringer; laat ongeveer 1 ml lactated Ringer in de buikholte achter om de hydratatie van de moederdier te ondersteunen, aangezien zij direct na een buikoperatie minder water zal drinken dan gebruikelijk. De buikwand en vervolgens de huid worden gesloten met resorbeerbaar hechtmateriaal met behulp van een naaldvoerder. Onze naaldvoerder heeft een ingebouwde schaar die het sluiten vereenvoudigt.

Wij geven de voorkeur aan een doorlopende hechting voor zowel de buikwand als de huid. We vergrendelen elke tweede steek om extra ondersteuning bij de incisieplaats te bieden. We dienen subcutaan een niet-steroïde ontstekingsremmend middel toe voordat we de moeder in de herstelkooi plaatsen.

Raadpleeg uw veterinaire staf over welke profylactische analgetica worden aanbevolen door uw institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik. De moeder is ingebed in een steriel laken en geplaatst op de bodem van de verwarmde herstelkooi. De herstelkooi bevat nestmateriaal, een rode buis als schuilplaats, laboratoriumvoeding en een waterfles.

De kooi wordt de ochtend na de operatie weer in elkaar gezet met een filterkap aan de bovenzijde. De moeder is goed verzorgd, mobiel en in staat om op haar achterpoten te balanceren om de open bovenkant van de kooi te inspecteren. De hechting in de buikwand is schoon, droog en vertoont geen tekenen van openscheuren, roodheid of zwelling.

We hebben een document bijgevoegd waarin de ontwikkeling van het protocol voor dierenverzorging bij in utero gentransfer wordt besproken. Het document bevat formuleringen die nuttig kunnen zijn bij het ontwerpen van een instellingsspecifiek protocol in overleg met uw commissie voor dierenwelzijn en -gebruik. Deel vier, representatieve resultaten.

Representatieve resultaten in panelen A en B tonen een representatieve cochlea van een pup op postnatale dag zes, waarbij op embryonale dag 11,5 een expressieplasmid voor an enhanced green fluorescent protein in de otis is geïnjecteerd en vervolgens is geëlectroporeerd. De laterale wand van de cochlea is verwijderd van het middenstuk en de apex. GFP-expressie is alleen aanwezig vanaf de basis tot het middenstuk van de cochlea en volgt de distributie van de haarcelmarker myosin seven A, zoals getoond in paneel B. Paneel C toont een confocale projectie bij lage vergroting van de embryonale dag.

18.5 muizenorganum chordae immunogekleurd met een myosin seven A antilichaam; getransfecteerde cellen zijn verspreid over het organum chordae. Paneel D toont een confocale projectie met hoge vergroting van het embryonale dag 18.5 muizenorganum chordae gekleurd met cin.Seven.

Een GFP-expressie wordt gedetecteerd in de binnenste en buitenste haarcellen, interphalangeale cellen, pijlercellen en TER-cellen. Elektroporatie-gemedieerde genoverdracht naar het otisch plaak op embryonale dag 11.5 transfecteert progenitorcellen die aanleiding geven tot alle componentceltypen binnen het Cortisch orgaan.