Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door In Vivo Elektroporatie
30 juni 2012
De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren een In de baarmoeder Genoverdracht techniek die bestaat uit drie stappen: de muis ventrale laparotomie, transuterine micro-injectie, en In vivo Elektroporatie. We maken gebruik van digitale video-microscopie om de kritische experimentele embryologische technieken te demonstreren.
Jane werd overgebracht naar de ontwikkelende muis binnenoor door in Vivo, elektroporatie Ling Wang, Han Jang en John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University.Oké. Mijn naam is John Burgandy. Mijn lab bevindt zich in het Oregon Hearing Research Center van de Oregon Health and Science University.
Mijn naam is Ang. Ik ben een poster in Johns lab. Ik ben ook Ang in het Johns lab als onderzoeksassistent.
Onze presentatie is onderverdeeld in vier delen. Het eerste is ventrale laparotomie. We demonstreren natriumpen, barbital-gebaseerde anesthesie, hoe te testen op de adequaatheid van anesthesie, corneabescherming, voorbereiding van de chirurgische plek, desinfectie muis overlevingschirurgie gegevensblad, de chirurgische suite ventrale middenlijn incisie door de huid en de buikwand en externalisatie van de baarmoederhoorns.
Deel twee is trans baarmoeder micro-injectie. We demonstreren transverlichting van de embryo, embryo, heroriëntatie, micro-injectie, pipet, fabricage en micro-injectie in de Otis op embryonale dag 11.5 en embryonale dag 12.5. Deel drie is in vivo elektroporatie.
We demonstreren paddle-stijl elektrode plaatsing en elektroporatie van de embryonale dag 11.5 muis O assist. Deel vier zijn representatieve resultaten. We tonen de expressie van GFP in late embryonale en vroege postnatale cochleas.
Dit resulteerde uit in vivo elektroporatie van de Otis met expressieplasmide op embryonale dag 11.5 deel een ventrale laparotomie. De dam wordt stevig vastgehouden door de huid achter de nek, de staart en de linker achterpoot vast te pakken. Een intraperitoneaal injectie van natriumpentobarbital gebaseerde anesthesie wordt toegediend na het afvegen van de buik met 70%ethanol.
De muis wordt vier tot vijf minuten in zijn eigen kooi geplaatst om de anesthesie te laten werken. Voet- en staartprikjes worden gebruikt om de adequaatheid van de anesthesie te beoordelen. Deze dam knippert in reactie op de staartprik en heeft nog twee minuten nodig voordat ze niet reageert op schadelijke stimuli.
Steriele oogzalf wordt op de ogen aangebracht om de hoornvliezen te beschermen tegen uitdroging. We bereiden de chirurgische plek in een chemische dampkap voor om de verspreiding van vacht en pluisjes te minimaliseren. De vacht wordt geschoren met een fijn mes om de huid bloot te leggen die de buikwand bedekt.
Complete vachtverwijdering vergemakkelijkt de genezing van de incisie postoperatief. Desinfectie van de buikhuid wordt bereikt door afwisselende passen van 70%ethanol Betadine en 70%ethanol. Veeg altijd van rostrale naar caudale en gebruik een verse chirurgische wattenbol of wattenstaafje.
Voor elke pas beoordelen we de diepte en kwaliteit van de ademhaling tijdens de desinfectie om ervoor te zorgen dat de dam niet reageert. Na de tweede 70%ethanol pas plaatsen we de dam onmiddellijk met de ventrale oppervlakte naar beneden op een steriele doek en zetten we haar op een verwarmd kussentje voor twee tot drie minuten om haar te verwarmen. Dit is een handige tijd om preoperatieve gegevens over de muis overlevingschirurgie op het logblad op te nemen. We hebben ons muis overlevingschirurgie gegevensblad als aanvullende informatie toegevoegd.
Overweeg om het gegevensblad en uw dierenverzorgingsprotocol op te nemen, zodat uw institutioneel dierenverzorgings- en gebruikscomité kan zien hoe u preoperatief, peroperatief en postoperatief gegevens zult monitoren. We voltooien één logblad voor elk chirurgisch onderwerp. We geven de voorkeur aan het uitvoeren van een operatie in een steriele omgeving, hoewel dit meestal niet vereist is voor knaagdieren.
Het werkoppervlak is gescheiden van de ventilatormotor en het plenumhuis, zodat er geen trillingen worden overgebracht naar de gebruiker. Tijdens micro-injectie hebben we als aanvullende informatie een schematisch overzicht toegevoegd van de aanpassingen die we hebben gemaakt aan onze laminaire stroomkap om in utero genoverdracht te vergemakkelijken, de essentiële wijzigingen zijn lage wateruitdaging en verlichtingsuitsparingen en verborgen recepten voor stroomkabels van instrumenten en een routeringspad voor accessoires elektrische circuits. De chirurgische suite bestaat uit de elektrische lactated ringers IV-zak, warm bad, XY, Z manipulator, stereofluorescentie, disserpeende microscoop, lichtbron met lichtgeleider en chirurgische instrumenten.
Voetpedalen worden gebruikt om de micro-injector, elektro perter enter focus te activeren. De scope chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Instrumenten moeten worden gere-steriliseerd tussen muizen met behulp van een glazen kralensterielisatie of door de naalddriver opnieuw te autoclaveren.
Balli schaar, ringtang en vasculaire tang zijn de essentiële hulpmiddelen. Ventral midline incisie, grijp de huid met een vasculaire tang en verwijder de integument met de schaar met ballenpunt, verleng de incisie 10 tot 14 millimeter. Identificeer de witte avasculaire band van verbonden weefsel, de linea alba genoemd en de ventrale middenlijn van de buik. Snijd de linea alba met de schaar met ballenpunt in.
Wees voorzichtig om het darm of de inguinale vetkussens niet te snijden. Irrigeer de buik onmiddellijk met steriele voorverwarmde lactate ringer oplossing. Beoordeel de incisieplaatsen in de huid en buikwand op bloeding.
Directe druk met stompe pincetten zal lichte bloedingen stoppen indien aanwezig, externaliseer de rechter en linker baarmoederhoorns met ringgetipeerde pincetten. Vang voorzichtig de rechter baarmoederhoorn met een ringeinde van de pincet en trek de baarmoeder naar de middenlijn incisie. Gebruik uw vrije hand om voorzichtig de laterale kant van de dam te manipuleren om het haken van de baarmoeder te vergemakkelijken.
De pincetten worden nooit gebruikt om de baarmoeder samen te persen en eruit te trekken. Omdat dit de baarmoedervaten of de embryo's zou kunnen beschadigen, herhaal de externalisatieprocedure voor de linker baarmoederhoorn. Irrigeer onmiddellijk de nieuw geëxternaliseerde baarmoederhoorns met voorverwarmde lactate ringer oplossing, herplaats voorzichtig de vetkussens of de darmen indien ze met de baarmoeder zijn uitgekomen.
Dit komt niet vaak voor. Deel twee baarmoeder micro-injectie. De dam wordt onder het objectief met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek voor gentransfer in het ontwikkelende binnenoor van de muis, waarbij in utero methoden worden gebruikt. De aanpak omvat laparotomie, micro-injectie en electroporatie, gedemonstreerd via digitale videomicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Gentherapie
Achtergrond
- Het binnenoor van de muis is een zintuiglijk orgaan dat is afgeleid van placodaal weefsel.
- Het begrijpen van de ontwikkeling ervan is cruciaal voor inzichten in hoormechanismen.
- Genoverdrachtstechnieken kunnen het onderzoek naar de ontwikkeling van het binnenoor verbeteren.
- In utero interventies maken real-time observatie van ontwikkelingsprocessen mogelijk.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een betrouwbare methode voor gentransfer in het binnenoor van de muis.
- Het faciliteren van de studie naar genfunctie tijdens de ontwikkeling van het oor.
- Het verbeteren van technieken voor embryologisch onderzoek.
Gebruikte methoden
- Ventrale laparotomie bij de muis voor toegang tot de uterus.
- Transuteriene micro-injectie van genetisch materiaal.
- In vivo elektroporatie om genexpressie te bevorderen.
- Digitale videomicroscopie voor de demonstratie van de techniek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gentransfer werd bereikt met behulp van de beschreven methode.
- Digitale videomicroscopie zorgde voor een duidelijke visualisatie van het proces.
- De techniek kan worden toegepast in diverse studies binnen de ontwikkelingsbiologie.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van mechanismen van gehoorverlies.
Conclusies
- De techniek voor gentransfer in utero is effectief voor het bestuderen van het binnenoor.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de auditieve ontwikkeling.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor therapeutische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze techniek maakt nauwkeurige genetische manipulatie mogelijk in het ontwikkelende binnenoor van de muis, wat doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie ondersteunt in pijplijnen voor auditieve neurowetenschappen en gentherapie. Door de in utero toediening van expressieplasmiden aan otische progenitorcellen mogelijk te maken, biedt het een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van haarceldifferentiatie en morfogenese van het binnenoor. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door embryonale interventies te koppelen aan postnatale fenotypische uitkomsten, wat de translationele continuïteit van ontdekking naar lead-identificatie vergemakkelijkt.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de genfunctie in vestibulaire en auditieve haarcelprogenitoren te onderzoeken tijdens kritieke ontwikkelingsfasen.
- Operationele waarde: Biedt een platform voor gain- en loss-of-function studies om therapeutische doelwitten in de ontwikkeling van het binnenoor te verduidelijken.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden om risico's te verminderen bij het selecteren van doelwitten in programma's voor gehoorverlies en balansstoornissen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief beoordeelbare transfectieresultaten via GFP-expressie in gedefinieerde compartimenten van het binnenoor.
- Operationele waarde: Standaardiseert de aflevering van genetisch materiaal aan de otische blaas met behulp van transuteriene microinjectie en in vivo elektroporatie.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare preparatie mogelijk van gevalideerde biologische systemen voor downstream screeningcampagnes van verbindingen of genetica.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt embryonale gentransfer met postnatale fenotypes van het Corti-orgaan, wat bijdraagt aan ziekterelevante systeemmodellering.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt longitudinale tracking van geëlektroporeerde embryo's via tracer-kleurstof en fluorescentielabeling voor postnatale selectie.
- Strategische waarde: Verbetert de translationele biomarker-afstemming door vroege interventie te correleren met expressiepatronen die specifiek zijn voor haarcellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in workflows voor discovery biology door gerichte genmodulatie in embryonale weefsels van het binnenoor mogelijk te maken, waarbij de resultaten direct bijdragen aan de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door ruimtelijke en temporele controle van genexpressie in progenitoren van sensorische epithelia.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve transfectie-resultaten via fluorescente reporterexpressie in cochleaire en vestibulaire regio's.
- Analytiek: Maakt vergelijking van condities mogelijk via confocale beeldvorming van haarcelmarkers en transgene distributie over verschillende ontwikkelingsstadia.
- Translationeel onderzoek: Verbindt embryonale electroporatie met postnatale functionele assays, wat de preklinische continuïteit in modellen van auditieve ontwikkeling bevordert.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor iteratieve genetische modulatie over meerdere embryonale stadia en gentargets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door directe observatie van genexpressie in ontwikkelende cellijnen van het binnenoor.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde chirurgische en electroporatieprotocollen verbeteren de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en experimentele batches.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in targets van het auditieve pad, wat het vertrouwen in go/no-go-beslissingen in vroege fasen van programma's verbetert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van data over embryonale fenotypische redding of verergering.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muisembryologie, microchirurgie en elektrofysiologische technieken voor genoverdracht.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder uterusmanipulatoren, glasvezel-transilluminatie en square-wave electroporators.
- Vereist cross-team standaardisatie van anesthesie, preparatie van de chirurgische plek en protocollen voor de oriëntatie van embryo's.
- Adaptatie naar verschillende modelsystemen vereist validatie van de toegankelijkheid van de otische vesikel en de efficiëntie van de electroporatie in verschillende genetische achtergronden.
- Praktische beperkingen omvatten de overlevingspercentages van embryo's na de chirurgie en technische uitdagingen met betrekking tot de nauwkeurigheid van de targeting van het otocyst.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:58
Part 1: Ventral Laparotomy
8:32
Common Embryo Orientations Observed by Transillumination of the Uterus
10:19
Embryo Reorientation for Otocyst Injections
13:48
Transuterine Microinjection
16:31
Part 3: In vivo Electroporation
5:23
Ventral Midline Incision
7:46
Part 2: Transuterine Microinjection
17:37
Postnatal Selection of a Pup whose Otocyst was Injected at E12.5
19:47
Prophylactic Analgesia
20:18
Surgical Subject the Morning after Surgery
20:55
Part 4: Representative Results
