Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescentie In situ Hybridisatie (LNA flow-FISH): een methode voor Bacteriële Kleine RNA-detectie

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van de expressie van bacterieel RNA in individuele bacteriële cellen. Dit wordt eerst bereikt door het ontwerpen van een locked nucleic acid- of LNA-probe met een biotine-TEG-modificatie aan het 5'-uiteinde. Wanneer de bacteriële cellen vervolgens worden gefixeerd, behandeld met dathyl, percarbonaat of dsy en daarna worden gepermeabiliseerd, wordt het RNA gedenatureerd en wordt de LNA-probe gehybridiseerd.

Ten derde worden de cellen gewassen, geblokkeerd en gekleurd. Ten slotte wordt de cellulaire fluorescentie gemeten via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen veranderingen in de RNA-expressie in de tijd en binnen populaties worden geëvalueerd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de relatieve aanwezigheid en abundantie van RNA-soorten binnen een enkele cel, en in welke mate deze expressie verandert binnen homogene of heterogene populaties. Hoewel deze methode momenteel wordt gebruikt om de expressie van bacteriële kleine RNA's te monitoren, kan deze in theorie worden gebruikt om RNA in potentieel elk celtype te detecteren. Gebruik na het ontwerpen van de LNA-sondesequentie blast om er zeker van te zijn dat de sonde specifiek is voor enkel het betreffende SRNA of mRNA.

Voeg bij het bestellen van de probe een biotine-TEG-modificatie toe aan het 5'-uiteinde van het LNA-oligonucleotide. De biotine-koppeling is noodzakelijk voor kleuring na hybridisatie met een gestript avidine-DI-conjugaat. Drie negatieve controles moeten in de methode worden opgenomen: één A, geen LNA-controle, waarbij geen LNA-probe wordt toegevoegd tijdens de hybridisatie.

Stap twee: een controle zonder kleurstof, waarbij de LNA-probe hybrideert met het doel-sRNA, maar de hybridisatiegebeurtenis niet wordt gedetecteerd vanwege de afwezigheid van de fluorescerende kleurstof. En drie: een controle voor een niet-geëxpresseerd sRNA of mRNA, waarbij gebruik wordt gemaakt van een LNA-probe die gericht is op een niet-bestaand of niet-geëxpresseerd sRNA om aspecifieke hybridisatie te monitoren. Begin met het oogsten van 1 × 10⁸ cellen van de betreffende bacteriën en breng deze over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Pelleteer vervolgens de bacteriële cellen bij 2300 ×g gedurende vijf minuten na het centrifugeren.

Verwijder het supernatant door middel van pipetteren en niet door schenken. Resuspendeer vervolgens het pellet in 400 µL PBS, voeg 400 µL A PFA azijnzuur PBS fixeeroplossing toe en meng de cellen goed. Incubeer de suspensie nu gedurende 10 minuten bij 25 °C.

Vortex één keer na vijf minuten, nadat de cellen opnieuw zijn gecentrifugeerd. Ditmaal op 4.500 ×g gedurende twee minuten. Was het pellet twee keer met 400 µL PBS.

Resuspendeer tot slot het pellet in 400 µL PBS en bewaar de nu gefixeerde cellen bij vier graden gedurende maximaal zeven dagen. Begin met het toevoegen van 400 µL van een vers bereide 1% dsy-oplossing aan elk gefixeerd bacterieel cellmonster. Meng vervolgens de celoplossingen goed door te pipetteren.

Incubeer dit mengsel gedurende 12 minuten bij 25 °C en voeg na het tweemaal wassen van de cellen met 400 µL PBS 800 µL van een vers bereide lysozymoplossing toe aan de cellen. Meng de cel-lysozymoplossing grondig door middel van vortexen en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 25 °C met af en toe mengen. Voeg na het centrifugeren van de cellen 800 µL van een vers bereide proteinase K-oplossing toe aan het pellet en meng de resuspendeerde celoplossing grondig door middel van pipetteren.

Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 25 °C, waarbij halverwege de incubatieperiode wordt gevortexd. Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd en gewassen met 400 µL PBS, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in nog eens 400 µL PBS. Voeg vervolgens 100 µL van de suspensie toe aan vier afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 mL, pellet vervolgens de cellen en verwijder de supernatanten. Incubeer nu alle vier de monsters in elk 100 µL hybridisatiebuffer bij 60 °C gedurende 60 minuten. Voeg na de hybridisatie één mL SSC plus Tween 20 of SSCT toe aan het hybridisatiemengsel om de cellen uit de viskeuze hybridisatieoplossing te kunnen verwijderen.

Voeg na het pelletiseren 200 µL formamide-SSCT-oplossing toe aan de pellets en meng dit grondig. Incubeer de monsters vervolgens gedurende 30 minuten bij 65 °C in een warmteblok. Voeg nu 1 mL SSCT toe aan het mengsel en resuspendeer de cellen in 500 µL SSCT na het opnieuw pelletiseren van de cellen; incubeer de celoplossing vervolgens 40 minuten in het warmteblok.

Na het centrifugeren van de cellen wordt er 200 µL blokkeringsbuffer aan de pellets toegevoegd, waarna de cellen gedurende 30 minuten bij 25 °C worden geïncubeerd. Na het centrifugeren wordt er voor de controle zonder kleurstof opnieuw 50 µL van een gestripte avidine- en kleurstofoplossing aan de pellets toegevoegd en worden de cellen grondig gemengd. Voeg 50 µL blokkeringsbuffer toe.

Incubeer alle monsters vervolgens nog 12 minuten bij 25 graden Celsius met constant mengen in een thermomixer, waarbij de buisjes met aluminiumfolie tegen het licht worden afgeschermd. Was de cellen daarna één keer met 500 microliters SSCT-buffer en één keer met 400 microliters PBS plus tween 20 of PBST. Voeg na het verwijderen van de supernatanten 100 microliters gebiotinyleerde antis, strippin en PBS toe gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius met af en toe mengen; dit antilichaam zal binden aan het strippin DI-conjugaat dat in de vorige stap is geïntroduceerd.

Pelleteer vervolgens de cellen en was deze twee keer met 400 µL PBST, waarna een tweede kleuring wordt uitgevoerd door 50 µL van de gestripte avid- en kleurstofoplossing aan de cellen toe te voegen en grondig te mengen. Deze stap verhoogt de signaaloutput per gehybridiseerde LNA-probe voor de controle zonder kleurstof. Voeg opnieuw 50 µL van enkel de blokkeringsbuffer toe en incubeer vervolgens alle buisjes 12 minuten bij 25 °C in een thermomixer onder constant mengen.

Na incubatie met de kleurstofoplossing worden de cellen opnieuw gewassen met 500 µL SSCT-buffer en vervolgens eenmaal met 400 µL PBST na de tweede wasbeurt. Resuspendeer het pellet in 200 µL PBST en bewaar de cellen bij 4 °C tot ze klaar zijn voor flowcytometrische analyse. Stel voor kleinere bacteriële cellen de stroomsnelheid van de flowcytometer in op traag om de core size te verkleinen. Stel daarnaast, bij flowcytometers met drempelwaarden voor forward scatter, de cutoff zo laag mogelijk in om ervoor te zorgen dat de kleine bacteriële cellen worden gedetecteerd.

Een voorbeeld van cellen die effectief zijn gefixeerd en gepermeabiliseerd wordt hier getoond in deze flowcytometrie dotplot bij gebruik van de zojuist beschreven condities. Voor de permeabilisatie is de celpopulatie klein en homogeen, wat duidt op weinig celaggregaten. Wanneer hogere concentraties lysozym worden gebruikt, zijn cellen echter eerder geneigd te aggregeren en vertonen ze verhoogde forward scatter-waarden, wat wijst op grotere deeltjes zoals te zien is in deze dotplot.

Hier wordt een voorbeeld getoond van flowcytometriegegevens van een succesvol LNA flow fish-experiment. Het histogram demonstreert de specifieke detectie van een target SRNA samen met drie negatieve controles. De 'geen sterf'-negatieve controle in paars produceert de minste fluorescentie, gevolgd door de 'geen LNA'- en de 'niet-geëxpresseerd SRNA'-negatieve controles in respectievelijk blauw en rood.

Ten slotte vertoont de monster met de SRNA-specifieke LNA-sonde de sterkste fluorescentie in zwart. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer zes uur worden uitgevoerd indien correct worden uitgevoerd. Bovendien verschaft deze techniek meer informatie en is deze kosteneffectiever dan R-T-P-C-R.

Na deze procedure kunnen aanvullende probes worden gelabeld met andere HAPS en toegevoegd tijdens de hybridisatiestap om multiplex RNA-detectie mogelijk te maken.I.