Name: Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer microtubuli-etikettering in sensorische neuronen van Drosophila-larven via immunohistochemie. Deze methode onthult microtubuli-organisatie in dendrieten, luchtpijp en spieren voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken RIKEN voor financiering. P10-Gal4 was een soort geschenk van Alain Vincent (Universite Paul Sabatier, Toulouse, Frankrijk).

1. Bereiding van reagentia Opmerkingen voor het begin van: Dissection en immunohistochemische kleuring worden uitgevoerd in een magnetische kamer en de larve wordt vastgepind met behulp van speciaal gevormde insect pinnen. Gedetailleerde instructies voor de bouw van een magnetische kamer, en voorbereiding van deze pinnen is te vinden in gerelateerde referenties 14,15. In het kort, is een 1x1cm vierkant gat gesneden in een magnetische plaat en een dekglaasje aangebracht op de achterkant van het blad naar een kleine kamer te maken. De zijkanten van de kamer worden afgedicht met epoxy lijm, na deze lijm heeft de kamer wordt meerdere malen gewassen met 70% ethanol voor gebruik. Dissectie insect pinnen worden bereid door het buigen naar de gewenste vorm en vervolgens gelijmd op een metalen lipje 14,15. Als alternatief voor een metalen lipje, hebben we gebruik gemaakt van een omgekeerde platte kop stalen punaise met een handvat gemaakt van een cut-off geel tip. Het gebruik van deze magnetische kamer regeling laat ove nauwe controler pin positionering en weefsel stretchen tijdens de dissectie. Te rijden reporter gen-expressie bij verschillende subgroepen van DA neuronen onderzoekers kunnen gebruik maken van verschillende Gal4 regels (samengevat door Shimono en collega&#39;s 16). Veel van deze lijnen zijn verkrijgbaar bij de openbare voorraad centra. In deze vertegenwoordiger protocol, voeren we immunokleuring van een lijn waarin twee contrasterende klassen van DA neuron zijn co-label: de meest eenvoudige klasse I en meest complexe-klasse IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)). <ol><li> Bereid Ca + +-vrij HL3.1 zoutoplossing <ol><li> In mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, trehalose en 5; pH 7,2 19. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C. Let op: Ca + +-vrije oplossing voorkomt dat spiercontractie tijdens de dissectie. </li></ol></li><li> Bereid 2x PHEM buffer <ol><li> In mm: 130 BUIZEN, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C. Opmerking: Deze materialen zullen niet oplossen totdat de pH 7,0 benaderingen. </li></ol></li><li> Vers bereiden de fixeermiddel onmiddellijk voor de fixatie. <ol><li> Met het oog op een 25ml oplossing, eerste mix 2g paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH en 10 ml water voor te bereiden in een 50 ml Falcon buis. </li><li> Schudden fixatief in een 55 ° C waterbad met shaker tot de oplossing helder is. (Totaal volume zal ongeveer 11,5 ml zijn.) </li><li> Cool fixeermiddel op het ijs. </li><li> Voeg 12.5ml 2x PHEM buffer. </li><li> Breng de pH op 7,0 met 1M HCl. </li><li> Vul de oplossing met water tot het volume is 25ml. </li><li> Filtreer de oplossing met behulp van Whatman papier. </li></ol></li></ol> 2. Larvale dissectie Let op voordat u begint: microtubuli netwerken, en met name die in sensorische dendrieten, zal afbraak snel na de start van dissectie. Achieving snel dissectie in minder dan vijf minuten gevolgd door onmiddellijke fixatie zijn de belangrijkste factoren voor het succes van dit protocol. <ol><li> Was de larve in het water en ze snel te verplaatsen naar deze daling met behulp van een lus van haar. </li><li> Oriënteer de larve dorsale zijde omhoog en de ventrale zijde op het glas. Opmerking: Deze oriëntatie is te onderzoeken of het ventrale cluster neuronen. Om te onderzoeken dorsale cluster neuronen, keren de oriëntatie. </li><li> Gebruik het centrum insect-pin aan het voorste einde nabij de monding haken pin. Plaats de pin dicht bij het einde voor het beste resultaat. </li><li> Breng een druppel HL3.1 zoutoplossing in de dissectie kamer. </li><li> Snijd de zeer achterste punt van de larve af met microscissors. Opmerking: Deze stap opent een opening aan het achterste eind van de larve die de toegang voor de microscissors (stap 2.7) zal toestaan. </li><li> Pak met de tang de regio van darm, die nu buiten steken van de opening aan het achterste eind van de larve. Trek de hele darm. </li><li> Plaats hetpunt van een mes van de microscissors door de opening en snijd langs de ventrale middellijn naar de voorste. </li><li> Met behulp van de hoek pinnen, pin het nu gratis hoeken, posterior eerst, dan anterior. Tegelijkertijd voorzichtig rekken open de larvale filet. </li></ol> 3. Fixatie, blokkeren, vlekken, en montage van larvale filets Opmerkingen voor het begin van: Alle fixatie en kleuring stappen worden uitgevoerd in het dissectie kamer. Tijdens dit proces, pas dan op dat het insect pinnen die de larve, omdat dit kan leiden tot weefselschade kloppen. Om te voorkomen dat het experiment uitdroogt, doe alle vlekken stappen in een klein Tupperware container, omringd door vochtige weefsels. <ol><li> Zuig het Ca + +-vrij HL3.1 buffer met behulp van een gele tip. Onmiddellijk toevoegen het fixeermiddel met een andere pipetteman. </li><li> Voorzichtig pipet op en neer om het fixeermiddel mengen met de resterende sporen van Ca + +-vrij HL3.1 bufferin de kamer. Onmiddellijk aspireren en dan voegen we verse fixatief in de kamer. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Was 6x 10 minuten in PBST (0,1% Triton X-100 in PBS). </li><li> Blok met 5% geit serum in PBST voor 20 minuten bij RT. </li><li> Vervang het blokkeren oplossing met primaire antilichamen verdund in 5% geit serum in PBST. De gebruikte primaire antilichamen zijn muis anti-α-tubuline (DM1A) en de rat anti-CD8 (5H10) zowel verdund 1 / 1000. Opmerking: De onderzoeker wenst te muis anti-α-tubuline (DM1A) vervangen met muis anti-Futsch (22C10) 20,21 verdund 1 / 1000 in bepaalde omstandigheden (zie bespreking). </li><li> Incubeer overnacht (minstens 16 uur) bij 4 ° C. </li><li> Was 6x 10 minuten in PBST. </li><li> Voeg secundair antilichaam verdund in 5% geit serum in PBST. De gebruikte secundaire antilichamen worden Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG en Cy3 ezel anti-rat IgG. Houd het monster bedekt om te voorkomen dat fluorofoorfoto-bleken 22. </li><li> Incubeer hetzij bij RT gedurende twee uur, of overnacht bij 4 ° C, gevolgd door een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 6x 10 minuten in PBST. </li><li> Plaats de larvale filet op de dia nagelriem naar beneden, de berg in 80% glycerol, en verzegelen de zijkanten van het dekglaasje met nagellak voor een &#39;snelle&#39; te monteren. Opmerking: Voor een betere weefsel clearing, en een permanent stabiele monster, monteren in DPX zoals eerder beschreven 23. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Fluorescerende kleuring werd onderzocht onder een confocale microscoop. In de figuren 1-2, verschillende branches binnen een dendriet prieel hebben verschillende organisatie van het cytoskelet. Figuur 1 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van een anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti α-tubuline antilichaam en fluorescent secundair (Alexa Fluor 488). De belangrijkste branches positief zijn voor tubuline, sommige dunne zijtakken zijn tubuline-negatief. Film 1 is een set van seriële secties door een soortgelijke kleuring van een klasse I DA neuron. Figuur 2 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron gekleurd met antilichamen tegen Futsch en CD8 op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De belangrijkste takken zijn Futsch-positief, wat dunne zijtakken zijn Futsch-negatief zijn. Figuur 3. Luchtpijpen in het larvale lichaam muur tonen een complex microtubule organisatie. Movies 2 en 3 tonen seriële secties van verkleuring door het lichaam muur spieren en luchtpijp. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" /> Figuur 1. Fig. 1 toont een regio van het prieel van een klasse IV DA neuron op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-&amp;-tubulin antilichamen en fluorescente secundaire (Alexa 488). Panelen AC opeenvolgende confocale z-profielen (0.5μm), C&#39;-C &quot;, een antilichaam vlekken uit panel C. Voorbeeld van takken met (gele pijl) of zonder (paars pijlpunt) microtubuli worden gemarkeerd. Red pijlpunten hoogtepunt microtubuli in de onderliggende epitheliale cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" /> Figuur 2. Fig. 2 toont een vergelijkbare regio&#39;s van het prieel van een klasse IV da neuron gekleurd met antilichamen tegen Futsch en CD8 op de 1 ste larvestadium larvale stadium. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Futsch wordt gedetecteerd met behulp van anti-Futsch antilichaam en fluorescerende secundaire (Alexa 488). De belangrijkste takken zijn Futsch-positief, wat dunne zijtakken zijn Futsch-negatief zijn. Voorbeeld van takken met (gele pijl) of zonder (paars pijlpunt) Futsch worden gemarkeerd. Figuur 3. Luchtpijp gekleurd met het anti-tubuline protocol hierboven beschreven. Deze larve is de derde larvestadium en ontleed zoals eerder beschreven 23,24. Movie 3 toont vergroot seriële secties van het gebied gekenmerkt door een vierkant. Film 1. Serial secties tracing Tubuline vlekken in de dendritische prieel van een klasse I neuron. De hele prieel is gemarkeerd met mCD8:: KO (Magenta) en gedetecteerd met behulp van anti-CD8 antilichaam en fluorescerende secundaire (Cy3). Tubuline (groen) wordt gedetecteerd met behulp van een anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">Klik hier om de film te bekijken.</a> Movie 2. Serial secties tracing Tubuline kleuring in body wand spieren van een derde instar larve. Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">Klik hier om de film te bekijken.</a> Movie 3. Serial secties tracing Tubuline kleuring in een lichaam muur luchtpijp van een derde instar larve, gemarkeerd met een plein in Figure.3. Tubuline wordt gedetecteerd met behulp van anti-α-tubuline antilichaam en tl-secundair (Fluor Alexa 488). Schaal: de ene kant van de video beeld komt overeen met 46.88μm in de sectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">Klik hier om de film te bekijken.</a>

<ol><li>Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+continued%3A+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamon+y+Cajal%2C+S+%22Histology+of+the+nervous+system+of+man+and+vertebrates%2C+1995+translation%22">Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation</a>. , Oxford University Press. (1911).</li>
<li>London, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic computation.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament-stabilizing+protein+tropomyosin+regulates+the+size+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields.</a> J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).</li>
<li>Ye, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+dendritic+and+axonal+development+by+the+novel+Kruppel-like+factor+Dar1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1.</a> J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63, 788-802 (2009).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+methods+for+the+anatomical+study+of+Drosophila+embryonic+and+larval+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions.</a> Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+action+of+Engrailed+and+Gooseberry-Neuro+in+neuroblast+6-4+is+triggering+the+formation+of+embryonic+posterior+commissure+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles.</a> PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).</li>
<li>Dubois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collier+transcription+in+a+single+Drosophila+muscle+lineage%3A+the+combinatorial+control+of+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity.</a> Development. 134, 4347-4355 (2007).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26, 357-370 (2000).</li>
<li>Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+development+in+the+Drosophila+retina%3A+monoclonal+antibodies+as+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes.</a> Cell. 36, 15-26 (1984).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Analysis+of+Drosophila+Larval+Peripheral+Sensory+Neuron+Dendrites+and+Axons+Using+Genetic+Mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics.</a> J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).</li>
<li>Tao, J., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+have+a+rapid+program+of+injury-induced+degeneration+that+is+molecularly+distinct+from+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning.</a> J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).</li>
<li>Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+axonal+sprouting+and+dendrite+branching+by+the+Nrg-Ank+complex+at+the+neuron-glia+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface.</a> Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).</li>
<li>Mattie, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+microtubule+growth%2C+%2BTIPs%2C+and+kinesin-2+are+required+for+uniform+microtubule+polarity+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites.</a> Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).</li>
<li>Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin-dependent+synaptic+growth%3A+evidence+that+Dlar+signals+via+Diaphanous+to+modulate+synaptic+actin+and+dynamic+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules.</a> J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Om te begrijpen hoe complex cel vormen zijn bereikt, is het belangrijk om te kunnen nauwkeurig test microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode voor het testen van microtubuli organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten. In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste immunohistologische kleuring van luchtpijp, spieren en andere lichaamsdelen muur weefsels. Wij gebruiken dit pr...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus aantal </th><th> Reacties (Optioneel) </th></tr><tr><td> Pincet </td><td> Dumont </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Microscissors </td><td> FST </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Muis anti-α-tubuline (Clone: ​​DM1A) </td><td> Sigma </td><td> T9026 </td><td> Verdunning 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Muis anti-Futsch (Clone: ​​22C10), supernatant </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> 22C10 </td><td> Verdunning 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 (Clone: ​​5H10) </td><td> Caltag </td><td> MCD0800 </td><td> Verdunning 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 anti-muis IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.001 </td><td> Verdunning 1 / 500 </td></tr><tr><td> Cy3 anti-Rat IgG </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 712-166-150 </td><td> Verdunning 1 / 200 </td></tr></tbody></table>

immunohistologische etikettering van microtubuli in sensory neuron dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de drosophila larve body muur

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Om te begrijpen hoe verschillen in complexe cellen vormen zijn bereikt, is het belangrijk om nauwkeurig te volgen microtubuli organisatie. De Drosophila larven lichaam muur bevat verschillende celtypen die zijn modellen om cellen en weefsels morfogenese bestuderen. Bijvoorbeeld luchtpijp worden gebruikt om de buis morfogenese 1, en ​​de dendritische arborization (DA) sensorische neuronen van de Drosophila larven hebben een primaire systeem worden voor de opheldering van algemene en neuron-class-specifieke mechanismen van dendritische differentiatie 2-5 en degeneratie zes onderzoeken . De vorm van dendriet takken kunnen sterk variëren tussen neuron klassen, en zelfs tussen verschillende takken van een enkel neuron 7,8. Genetische studies in DA neuronen suggereren dat differentieel organisatie van het cytoskelet kan morfologische verschillen in dendritische branche vorm 4,9-11 ten grondslag liggen. Wij bieden een robuuste immunologische etikettering methode om eenssay in vivo microtubuli organisatie in DA sensorische neuron dendriet prieel (figuren 1, 2, Film 1). Dit protocol geeft de dissectie en immunokleuring van de eerste instar larve, een stadium waarin actieve sensorische neuron dendriet uitgroei en vertakking organisatie is 12,13 optreedt. In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste kenmerken van microtubuli organisatie in de spieren (Movies 2, 3), luchtpijp (Figuur 3, Movie 3), en andere lichaamsdelen muur weefsels. Het is waardevol voor onderzoekers die willen microtubuli organisatie te analyseren in situ in het lichaam muur bij het ​​onderzoek naar de mechanismen die de controle weefsels en cellen vorm.

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en andere<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve lichaamswand weefsels.

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

Om te begrijpen hoe verschillen in complexe celvormen worden gerealiseerd, is het belangrijk om de organisatie van microtubuli nauwkeurig te volgen. De larvale Drosophila ...

Het algemene doel van deze procedure is het labelen van microtubuli in de dendrieten van sensorische neuronen in drosophila-larven in een vroeg stadium. Dit wordt bereikt door eerst een larve vast te pinnen in een magnetische dissectiekamer en deze vervolgens snel te dissecteren tot een larvefilet. Vervolgens wordt de filet, terwijl deze zich nog in de magnetische kamer bevindt, onmiddellijk gefixeerd en immunogekleurd.De laatste stap is het inklissen van het weefsel; confocale immunofluorescentiemicroscopie kan vervolgens de distributie van microtubuli in de dendrieten van dopaminerge sensorische neuronen onthullen. Hallo, mijn naam is Ol Kareem. Vandaag demonstreer ik een protocol voor immunohistologische labeling van microtubuli in sensorische neurodendrieten, tracheae en spieren in de lichaamswand van larven.Deze methode is ontworpen om inzicht te verschaffen in de organisatie van Myco TL in de perifere sensorische neuronen. Daarnaast kan deze worden toegepast op de studie van Myco TL-netwerken en andere celtypen en weefsels van de larvale lichaamswand. Voordat u begint: voor het succes van dit protocol is het essentieel dat het fixatief direct voorafgaand aan de start van dit protocol vers wordt bereid.De genetische achtergrond van de stam is ook van cruciaal belang. Om bijvoorbeeld de dendritische arborisatie van neuronen te bestuderen, selecteert u dieren die een label in de membranen van die neuronen tot expressie brengen, zoals MCDA cherry of MCDA, RA orange. Was een larve in het eerste stadium snel met water met behulp van een haarlus en verplaats deze vervolgens naar de dissectiekamer.Om de neuronen van de ventrale cluster te onderzoeken, moet u de larven met de dorsale zijde naar boven en de ventrale zijde op het glas oriënteren. Om de neuronen van de dorsale cluster te onderzoeken, keert u de oriëntatie om met een insectenspeld door het anterieure uiteinde nabij de mondhaken vast te zetten. Voor het beste resultaat plaatst u de speld dicht bij het uiteinde.Micro- en triple-netwerken, en in het bijzonder die in sensored DDR, zullen snel afbreken na het begin van de dissectie. Het verkrijgen van de eerste dissectie en een snelle fixatie zijn cruciale factoren voor het succes van dit protocol. Knip met een pincet en microschaartje het uiterste posterieure uiteinde van de larve af.Pak het darmweefsel dat uit de nieuwe opening steekt en trek voorzichtig de gehele darm naar buiten. Steek nu met microschaartjes één blad in dezelfde opening en knip langs de ventrale middenlijn in anteriore richting. Zet nu de inmiddels vrijgekomen posterieure hoeken vast met spelden en rek het larvenfilet indien nodig voorzichtig open.Reinig snel de resterende inwendige organen. Ga vervolgens onmiddellijk over tot fixatie om de fragiele microtubuli te behouden.Begin met het aspireren van de calciumvrije HL 3.1-buffer met een pipet, terwijl de kamer onmiddellijk wordt gevuld met vers bereid fixeermiddel. Vervang dit verdunde fixeermiddel onmiddellijk met een andere pipet. Alle fixatie- en ruststappen worden in de dissectiekamer uitgevoerd met vers fixeermiddel.Wees tijdens dit proces voorzichtig om de insectenspelden die de larve vasthouden niet te raken, aangezien dit kan leiden tot weefselschade. Laat de fixatie nu ongestoord 20 minuten bij kamertemperatuur doorgaan om de fixatie te voltooien. Was het larvenfillet zes keer schoon met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt.Vervolgens werden de larven gedurende in totaal één uur bij kamertemperatuur schoon gespoeld om het fixatiemiddel te verwijderen. Agitatie tijdens de incubaties is niet nodig en kan waarschijnlijk leiden tot onbedoelde weefselschade. Om de kleuring voor te bereiden, wordt de laatste wasbeurt met PBST verwijderd en wordt het gefixeerde fillet geblokkeerd door de kamer te vullen met 5% geiten serum in PBST; vervang vervolgens de blokkeringsoplossing door primaire antilichamen verdund in 5% geiten serum in PBST.De gebruikte primaire antilichamen zijn muis anti-α-tubuline en rat anti-CD8, beide verdund 1:1000. Plaats de kamer in een plastic bak met vochtig weefsel om te voorkomen dat het experiment uitdroogt. Incubeer het filet in de antilichamen gedurende ten minste 16 uur bij 4 °C.Verwijder de volgende dag de ongebonden primaire antilichamen door zes keer te wassen met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt, zoals eerder is gedaan om het fixatiemiddel te verwijderen. Voeg na een uur PBST-wassen de secundaire antilichaamoplossing toe, verdund in 5% geiten serum in PBST. In dit voorbeeld zijn de antilichamen LOR 4 88, anti-muis IgG en P SI drie anti-rat IgG; dek de kamer vanaf dit punt af om fotobleken van Fluor four te voorkomen. Incubeer het filet vervolgens in de secundaire oplossing gedurende ofwel twee uur bij kamertemperatuur, ofwel overnight bij 4 °C, gevolgd door één uur bij kamertemperatuur.Verwijder na de incubatie met het secundaire antilichaam de ongebonden antilichamen met hetzelfde strikte schema van zes wasbeurten in PBST van 10 minuten per wasbeurt. Het filet is nu klaar om te worden gemonteerd; dompel het weefsel voor een snelle montage met een pincet onder in een kleine druppel 80%glycerol. Pak het uiterste puntje van het anterieure uiteinde nabij de mondhaken vast en breng het over naar een objectglas, met de cuticulazijde naar beneden. Kit de zijkanten van het dekglas af met nagellak voor een verbeterde weefselklaring en een permanent stabiel monster.Mountain DPX zoals eerder beschreven; fluorescente kleuring onthulde dat verschillende takken binnen een dendrietboom een verschillende cytoskeletorganisatie hebben in een boom van een klasse 4 DA-neuron van een eerste-instar larve, waarbij de hoofdtakken positief zijn voor tubuline. Terwijl sommige dunne zijtakken dat niet zijn, is een reeks seriële secties van een soortgelijke kleuring van een klasse 1 DA-neuron, samengesteld tot een video, onthullender wanneer tubuline-immunokleuring in omliggend weefsel de analyse van de microtubulaire organisatie en neuronen bemoeilijkt. Muis anti-fat tubuline kan worden vervangen door neuron-specifieke muis anti-ch verdund 1:1000.De hoofdtakken van de klasse vier neuronen zijn fch positief. Terwijl sommige dunne zijtakken fch negatief zijn. Een verzameling seriële coupes van lichaamswandspieren onthulde de microtubuli-netwerken in dit weefsel.Een projectie van verschillende confocale secties door de spieren van de lichaamswand en de trachea toonde de complexe microtubuli-netwerken in deze weefsels. Inzoomen op een verzameling seriële secties door een tracheaal uiteinde in de lichaamswandspier onthulde de complexiteit van de microtubuli-organisatie. De combinatie van deze procedure met andere methoden, zoals de generatie van genetische MX's van perifere sensorische neuronen in larven, kan dus aanvullende vragen beantwoorden, zoals welke mechanismen de microtubuli-organisatie in dendrieten controleren.

immunohistological-labeling-microtubules-sensory-neuron-dendrites

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol wordt beschreven hoe u immunohistochemie uit te voeren op ontleed Drosophila larve.

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

De dendritische arborization sensorische neuronen van...

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.

Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila adult been om veranderingen op de neuromusculaire overgang voor een geïdentificeerd motorneuron te detecteren

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Leer microtubuli-etikettering in sensorische neuronen van Drosophila-larven via immunohistochemie. Deze methode onthult microtubuli-organisatie in dendrieten, luchtpijp en spieren voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur (Video) | JoVE Journal

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

Meer video's verkennen