Monstervoorbereiding van Mycobacterium tuberculosis Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming
3 september 2012
De metaboloom profiel van Mycobacterium tuberculosis Bepaald na groei in bouillon kweken. Voorwaarden kan worden gevarieerd om het effect van voedingssupplementen, oxidanten en anti-tuberculose middelen te testen op de metabolische profiel van dit micro-organisme. Procedure voor het extract voorbereiding is van toepassing voor zowel 1D 1 H en 2D 1 H- 13 C NMR analyses.
Het doel van deze procedure is om mycobacterium tuberculosis, celvrije extracten door NMR-metabolomics van de eerste cultuur te analyseren en de cellen in een geschikt groeistadium te oogsten. Lyseer vervolgens de cellen en verkrijg celvrije extracten voor analyse. Suspendeer de gelyofiliseerd extracten opnieuw in buffer voor NMR-analyse.
Verzamel ten slotte NMR-gegevens en analyseer spectra met software om metabolieten te identificeren. Uiteindelijk wordt NMR-analyse van mycobacterium tuberculosis gebruikt om bewaarmiddelen in metabolietenniveaus na verschillende behandelingen te tonen. NMR-metabolomics kan worden toegepast op belangrijke aspecten van de fysiologie van mycobacterium tuberculosis, zoals belangrijke metabolische routes.
Deze begrip is cruciaal om de werkingsmechanismen van medicijnwerking en resistentie te verduidelijken en om nieuwe doelen voor geneesmiddelontwerp te identificeren. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege het onvermogen om alle monsters precies hetzelfde te behandelen, wat onnodige variaties en resultaten uit mijn laboratorium zal introduceren. Steven Luka, promovendus, zal de procedures demonstreren om de monsters te behandelen voor NMR-verwerking. Vanuit mijn laboratorium zullen de onderzoekslaboratoriummanager en Robert Fenton, onderzoekstechnicus drie, nu de procedures demonstreren om met mycobacterium tuberculosis culturen om te gaan bij het uitvoeren van M tuberculosis.
Het onderzoek volgde bioveiligheidsniveau drie praktijken zoals gedefinieerd door institutionele richtlijnen. Hoewel de labels in deze video microbacterium tuberculosis zeggen voor bioveiligheidsoverwegingen, werd deze demonstratie uitgevoerd met het niet-pathogene mycobacterium magmatic. Begin met het ontdooien van een 50% glycerolvoorraad van M tuberculosis op ijs.
Inoculeer 0,15 milliliter in 110 milliliter M-A-D-C-T-W-bouillon in de 250 milliliter ER en mijn fles. Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius met schudden bij 100 RPM gedurende ongeveer zes dagen. Als er geen antibiotica, alternatieve toevoegingen of andere behandelingen nodig zijn. Oogst de culturen voor culturen die behandelingen vereisen.
Reserveer een 0,5 milliliter Eloqua op ijs voor cultuur, titratie en kwaliteitscontrole. Voer vervolgens de gewenste behandeling uit en plaats de culturen na de behandelingstijdperiode terug in de shaker. Verwijder een milliliter en bepaal de OD 600.
Reserveer ook een 0,5 milliliter monster voor cultuur, titratie en kwaliteitscontrole. Houd de cellen tijdens het resterende protocol op ijs. Oogst de cellen in vier 50 milliliter buizen door centrifugatie na wassen met 15 milliliter ijskoud tweemaal gedestilleerd water.
Suspendeer opnieuw de pellets in 10 milliliter aliquoten. Trek twee aliquoten en pellet door centrifugatie, sla vervolgens het celpellet opnieuw op in een eindvolume van één milliliter tweemaal gedestilleerd water. Als een enkele celsuspensie vrij van clumping gewenst is, passeer de cellen door een 27 gauge naald.
Drie keer gaat u door met het overbrengen van de een milliliter celsuspensie naar een twee milliliter schroefdop bevattend lysing matrix B.Plaats de fast prep 24 lysis homogenisator in de bioveiligheidskast. Plaats de monsters in de monsterhouder en zet de borgplaat vast. Verwerk vervolgens gedurende 60 seconden bij een snelheid van zes meter per seconde.
Centrifugeer vervolgens de monsters om celdeeltjes en intacte cellen te pellen. Laat vervolgens de supinate door een 0,2 micron spuitfilter in een steriele buis lopen om de afwezigheid van levensvatbare cellen te controleren. Plateer 0,1 milliliter monster op MADC.Agar.
Bevriest de monsters in een ethanol droogijsbad en bewaart bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn om te worden gelyofiliseerd en verwerkt in een NMR-faciliteit. Controleer na twee maanden de platen om de afwezigheid van kolonievormende eenheden te verifiëren. Als er geen CF-gebruikers worden gevonden, kunnen de monsters worden verwijderd uit het BSL drie laboratorium voor verdere analyse in een standaard NMR-faciliteit.
Nadat de monsters droog zijn geïoniseerd, suspendeer opnieuw in 0,7 milliliter NMR-buffer en breng over naar een microcentrifugebuis centrifuge gedurende drie minuten bij 13.000 keer. G, verwijder 0,6 milliliter en breng over naar een vijf millimeter NMR-buis. Uit media-analyse vergemakkelijkt een aangepast rek het laden van meerdere NMR-buizen in spinners op de juiste diepte.
Breng vervolgens de monsters over naar de NMR-spectrometer om in te voegen in A-B-A-C-S een 20-monsterwisselaar. Wissel af tussen onbehandelde en met geneesmiddel behandelde culturen. De eerste monster moet aan het begin van een geautomatiseerd run in de magneet worden voorgeladen.
Om het instrument te kalibreren, optimaliseert u de 90 graden pulslengte met een enkel monster en stemt u het instrument af voor de resterende monsters. Gebruik icon NMR en grad shim. Automatiseer het vergrendelen van shim en NMR-gegevensverzameling voor elk monster.
Voor een 1D waterstof een NMR-spectrum, selecteer de pulssequentie met waterstofonderdrukking en opwindingsbeeldhouwen. Stel een totaal van 32.000 datapunten in, 128 scans en 16 dummy-scans voor een twee DH een C 13 hs QC-spectrum. Selecteer de pulssequentie.
Selecteer een totaal van 2048 datapunten met veegbreedte langs de directe H een dimensie en 64 datapunten met veegbreedte langs de indirecte C 13 dimensie. Geef ook op dat het spectrum wordt verzameld met 128 scans en 16 dummy-scans om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Een spectrum van m tuberculosis genereerde ongeveer 400 pieken, inclusief 50 bekende metabolieten.
Gegevensverwerking zoals beschreven in het bijgevoegde manuscript produceerde bijvoorbeeld dit spectrum van metabolieten die direct of indirect verband houden met de D alanine-route. De grootte van de piekintensiteit is evenredig met de metabolietenconcentraties in het celextract, zodat relatieve verstoringen in metabolieten en metabolische routes tussen monsters en behandelingen kunnen worden gekwantificeerd. LMR-metabolomics baant de weg voor onderzoekers op het gebied van bacteriologie om fysiologie en pathogenese in visuele en microbacteriën te onderzoeken een ander pathogen of niet-pathogeen micro-organisme.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moet
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het analyseren van het metabolomische profiel van Mycobacterium tuberculosis middels NMR-metabolomica. De procedure omvat het kweken van de bacteriën in bouillionculturen en het bereiden van celvrije extracten voor analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Metabolomics
- Microbiologie
- Mycobacterium tuberculosis
Achtergrond
- Mycobacterium tuberculosis is een significante pathogeen die verantwoordelijk is voor tuberculose.
- Inzicht in het metabole profiel kan informatie verschaffen over de fysiologie ervan.
- NMR-metabolomics is een krachtig instrument voor het analyseren van metabolieten.
- Variaties in groeicondities kunnen de metabole profielen beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om het metabole profiel van Mycobacterium tuberculosis te analyseren.
- Om de effecten van voedingssupplementen en behandelingen op het metabolisme te beoordelen.
- Om NMR-analyse te gebruiken voor het identificeren van metabolieten in celvrije extracten.
Gebruikte methoden
- Kweek Mycobacterium tuberculosis in bouillon.
- Oogst de cellen in een geschikt groeistadium.
- Lysering van de cellen om celvrije extracten te verkrijgen.
- Resuspendeer de extracten in buffer voor NMR-analyse.
Belangrijkste resultaten
- NMR-analyse onthult veranderingen in metabolietniveaus na verschillende behandelingen.
- Belangrijke metabole paden die door verschillende condities worden beïnvloed, zijn geïdentificeerd.
- De toepasbaarheid van NMR-metabolomics bij het bestuderen van Mycobacterium tuberculosis is aangetoond.
- Inzichten in de fysiologische aspecten van de bacterie zijn verschaft.
Conclusies
- NMR-metabolomics is effectief voor het analyseren van Mycobacterium tuberculosis.
- Variaties in groeicondities hebben een significante impact op de metabole profielen.
- Deze benadering kan het begrip van het metabolisme van tuberculose verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Robuuste metabolomische profilering van Mycobacterium tuberculosis-extracten met behulp van NMR maakt een betrouwbare analyse van metabole routes onder invloed van medicamenteuze behandeling en genetische perturbatie mogelijk. Deze workflow ondersteunt targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de ontdekkingsfase, wat direct bijdraagt aan de identificatie en prioritering van leadverbindingen voor de ontwikkeling van antituberculosemiddelen. Betrouwbare, kwantitatieve metabolietgegevens verhogen het voorspellende vertrouwen en de translationele continuïteit binnen de vroege ontdekkingspijplijn.
Strategische toepassingen in Biofarma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve vergelijking van metabole profielen tussen wild-type en mutante stammen onder verschillende behandelingen mogelijk.
- Ondersteunt de identificatie van verstoringen in metabole routes die gekoppeld zijn aan geneesmiddelwerking of resistentiemechanismen.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door gen- of eiwitveranderingen te correleren met verschuivingen in metabolieten.
- Biedt mechanische risicoreductie door de downstream biologische effecten van kandidaat-interventies te verduidelijken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare monstervoorbereiding voor NMR-gebaseerde metabolietkwantificering.
- Genereert hoogwaardige, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor het screenen van compound-effecten op het bacteriële metabolisme.
- Maakt assay-schaalbaarheid en hergebruik van het platform mogelijk voor diverse experimentele condities en compound-bibliotheken.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van metabole responsen op kandidaat-geneesmiddelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt metabole read-outs uit met ziekterelateerde pathways voor translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van metabole inzichten in de ontdekkingsfase naar preklinische validatie van drugseffecten.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk op basis van kwantitatieve metabole perturbaties.
- Ondersteunt voorspellende risicoreductie voor de selectie van kandidaten in drugspipelines tegen tuberculose.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze NMR-metabolomics-workflow integreert processen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van hypothese-gestuurde target-validatie en mechanistische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantitatieve metabolietprofilering verduidelijkt de betrokkenheid van pathways en de biologische respons op interventies.
- Screening: Gestandaardiseerde monstervoorbereiding en NMR-analyse maken reproduceerbare, kwantitatieve assay-resultaten mogelijk.
- Analytica: Spectra met een hoge resolutie en statistische analyse faciliteren een robuuste vergelijking van metabole toestanden over verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Metabolietgegevens informeren de afstemming van biomarkers en de relevantie voor ziekten in preklinische modellen.
- Hergebruik in de praktijk: Het protocol is aanpasbaar voor parallelle proteomische analyse en schaalbaar over meerdere experimentele ontwerpen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare metabolomics-workflows.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen anti-tuberculeuze portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaat-geneesmiddelen gericht op M. tuberculosis.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het werken op biosafety level 3 en NMR-metabolomics.
- Vereist toegang tot NMR-instrumentatie met een hoog veld en analytische software.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams om monster-variatie te minimaliseren.
- Aanpasbaar voor gebruik met andere mycobacteriële of microbiële systemen door middel van protocolwijzigingen.
- Consistentie van de monsters en naleving van de bioveiligheid zijn cruciaal voor betrouwbare, bruikbare gegevens.
