Name: Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer de darmimmunrespons evalueren bij DSS-geïnduceerde colitis in muizen door myeloperoxidase-activiteit en pro-inflammatoire cytokines te kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in de immuunmechanismen van inflammatoire darmziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en door de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC).

1. Muizenmodel van DSS-geïnduceerde acute colitis <ol><li> Voeg dextraansulfaat natrium (DSS) om geautoclaveerd drinkwater aan de gewenste uiteindelijke concentratie (1-5%) (wt / vol) (dwz een 5% DSS-oplossing te maken, 25 mg DSS poeder tot 500 ml van geautoclaveerd water toe te voegen) . Stock oplossing kan worden ingeleverd bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week of bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> In een bioveiligheid kap, giet voorraad DSS-oplossing in 50 ml Falcon buizen (een die nodig is per kooi). Houd de stamoplossing te vullen tubes als dat nodig is. </li><li> Vervangen door het drinkwater in elke muis kooi met de DSS-oplossing (in de 50 ml Falcon buizen) (De duur is afhankelijk van de DSS regime dat wordt gebruikt. Bijvoorbeeld met behulp van 6-8 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen, hebben we een te beheren 5% DSS oplossing voor een totaal van vijf dagen). Muizen zouden geen toegang tot een andere waterbron. Controle muizen worden gegeven geautoclaveerd drinkwater zonder DSS. </li><li> Dagelijks wegen muizen en registreren van de hoeveelheid DSS verbruikt per dag. Boven elkefles tot 50 ml na het opnemen DSS niveaus. Dit is het meten van de geschatte hoeveelheid van DSS verbruikt per kooi per muis gedurende de looptijd van het experiment. In onze onderzoeken maken we gebruik van een 5% DSS-oplossing gedurende 5 dagen met mannelijke C57BL / 6 muizen. Significant gewichtsverlies, gewijzigde consistentie van de ontlasting en tekenen van fecale bloed worden gezien zo vroeg dag 3 het gebruik van deze bijzondere DSS regime. Tijdens de DSS administratie, muizen vertonen uitgesproken gewichtsverlies (ongeveer 5-10% van hun oorspronkelijke gewicht op dag 5) met een gewichtsverlies van meer dan 20% van de initiële gewicht met uitdroging en diarree naar de significante fysiologische indicator die een dier op of worden de buurt van eindpunt. Als het dier krijgt toegang tot normaal water na de 5 dagen van 5% DSS, zal het herstellen binnen 7 dagen. Alle experimenten moet worden goedgekeurd door dier van de instelling ethische commissie en in overeenstemming zijn met de goedgekeurde Animal Gebruik Protocol (AUP). </li><li> Tijdens de duur van het experiment, een ziekte activiteit index (DAI)score kan worden beoordeeld aan de klinische progressie van colitis te evalueren. De DAI is de gecombineerde score van gewichtsverlies ten opzichte van de initiële gewicht, consistentie van de ontlasting, en bloeden. Scores zijn als volgt gedefinieerd: gewichtsverlies: 0 (geen verlies), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) en 4 (&gt; 20%), consistentie van de ontlasting: 0 (normaal), 2 (dunne ontlasting), en 4 (diarree), en bloeden: 0 (geen bloed), 1 (Hemoccult positief), 2 (Hemoccult positieve en visuele pellet bloeden) en 4 (bruto bloeden, bloed rond anus). DAI kunnen dagelijks gescoord gaat worden tijdens de duur van de DSS-behandeling. </li><li> Op het tijdstip van keuze, wegen en opoffering muizen. Muizen kunnen worden gedood door cervicale dislocatie na inhalatie van isofluraan of door een andere methode goedgekeurd door dier van de instelling faciliteit. </li></ol> 2. Verzamel colon weefselmonsters <ol><li> Expose de ventrale zijde van het dier en de buik nat gebied met een 70% ethanol-oplossing. Op dit punt, zie tabel 1 en noteer eenny tekenen van rectale bloeden (bloed aanwezig bij de anale opening) of rectale prolaps in elk dier. </li><li> Gebruik standaard ontleden schaar om de buik incise door het maken van een ventrale middellijn incisie. </li><li> Zoek de dikke darm en de dikke darm transect zo dicht mogelijk bij de colorectale marge mogelijk bij de distale colon vrij. </li><li> Voorzichtig en langzaam trek de hele dikke darm, losgemaakt van de omringende mesenterium. </li><li> Transect de dikke darm bij de colonocecal marge naar het proximale uiteinde van de dikke darm vrij. Uitwerpselen kan worden verwijderd door spoelen dikke darm met steriele PBS met behulp van een maagsonde naald bevestigd aan een 3 of 5 ml spuit of door het zorgvuldig te knijpen met behulp van een paar gebogen pincet / tang. Met behulp van de gehele dikke darm, beoordeel schade (zie paragraaf 3.1) </li><li> Weefsel bemonstering voor histologische analyse en andere testen kunnen worden gedaan door te snijden 0,5 cm tot 1,0 cm lang colon fragmenten met vermelding van welk gebied het monster uit (dat wil zeggen proximale, midden of distaal). </li><li> Weefselmonstersom te worden gebruikt voor de testen kunnen individueel worden geplaatst in 1,5 ml Eppendorf buizen en ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard tot gebruik bij -70 ° C. </li></ol> 3. Beoordeling van de ernst van colitis <ol><li> Macroscopische of ernst van de ziekte score is terminaal beoordeeld door een onpartijdige waarnemer met behulp van een eerder gepubliceerde scoringssysteem (tabel 1). 9 consistentie van de ontlasting kan worden beoordeeld met behulp van een paar pincetten en drukken op de ontlasting om de consistentie te bepalen. Voor het bepalen van een score voor bloed in de ontlasting, let op de kleur van de ontlasting (dat wil zeggen zwarte ontlasting versus lichtbruine ontlasting) en verder te valideren met behulp van een Hemoccult test. Met behulp van de scoring systeem, bepalen van een score voor elk van de voorwaarden. De uiteindelijke macroscopische score voor elk dier is de som van elke individuele score. </li><li> Voor het evalueren van histologische beschadiging van colitis ernst, snijd een klein fragment (0,5 cm) van de dikke darm, in een weefsel cassette en onderdompelen in een gebufferde 10% formaline-oplossing. Voor te bereiden 5um paraffine ingebedde doorsneden en vlekken secties met hematoxyline / eoxin (H &amp; E) met behulp van de juiste procedures. Colon fragmenten kunnen worden genomen van de proximale, mid-colon, of distale deel van de dikke darm. </li><li> H &amp; E gekleurde dikke coupes worden gescoord door een geblindeerde observator met behulp van een eerder gepubliceerde systeem voor de volgende maatregelen: crypt architectuur (normaal, 0 - ernstige crypte vervorming met het verlies van hele crypten, 3), de mate van inflammatoire cel infiltratie (normaal, 0 - dicht ontstekingsinfiltraat, 3), spier-verdikking (basis van de crypte zit op de muscularis mucosae, 0 - gemarkeerde spier verdikking aanwezig is, 3), goblet cel depletie (afwezig, 0 - heden, 1) en de crypte abces (afwezig, 0 - heden , 1). 7 De histologische schade score is de som van elke individuele score. Moet worden opgemerkt dat in tegenstelling tot de menselijke UC, crypte abcessen niet zijn kenmerkend voor dit model en worden zelden gezien, microscopisch kleine zweren zijn ook zeldzaam. Als er meerdere secties zijn dikke darmgebeitst, histologische scores tussen soortgelijke rubrieken moeten gegevens worden gebruikt om de eindscore voor elk gebied (dat wil zeggen histologische score in de proximale colon ten opzichte van histologische score in distale colon) te bepalen. </li></ol> 4. Bereid voorraad oplossingen van reagentia voor assays <ol><li> Bereid een 50 mM oplossing van kalium fosfaatbuffer door het toevoegen van oplossing B (K 2 HPO 4, 8,7 g dibasisch kaliumfosfaat in een L van dH 2 O) naar oplossing A (KH 2 PO 4, 6,8 g kalium monobasisch fosfaat in 1L van dH 2 O) tot een pH van 6,0 is bereikt. Resterende oplossingen kunnen worden opgeslagen in de koelkast (2-8 ° C) tot toekomstig gebruik. </li><li> Bereid hexadecyltrimethylammonium bromide (htab) buffer door het toevoegen van 5 g htab in 1 L van Kalium Fosfaat buffer (50 mM, pH = 6,0). Voorzichtig warmte op te lossen en op te slaan bij 2-8 ° C tot gebruik. Indien nodig, warmte opnieuw te ontbinden. </li><li> Bereid lysis buffer voor weefsel homogenisering voor eiwit analyse doortoevoeging van 10 ml 1 M tris-zoutzuur (pH = 8,0), 6 mL 5M natriumchloride en 2 ml van Triton X-100-182 ml gedestilleerd water gesteriliseerd. Triton X-100 is zeer viskeus bij kamertemperatuur en dus moeten voor voorzichtig worden opgewarmd tot gebruik. De bereide lysis buffer kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 5. Monstervoorbereiding voor assays <ol><li> Monstervoorbereiding voor MPO-analyse. <ol><li> Verwijder de monsters van -70 ° C en leg ze op ijs. Registreer het gewicht van elk monster na het verwijderen van alle zichtbare uitwerpselen of vet met behulp van een gebogen pincet / pincet en plaats in een 2 ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuis (of een buis die kan worden gebruikt met een homogenisator). Monsters moeten worden bewaard op ijs te allen tijde. Het is belangrijk op te merken dat soortgelijke dubbele punt fragmenten moeten gebruikt worden vanaf elke biologische repliceren (dat wil zeggen distale delen of alleen proximale delen only). </li><li> Voeg homogenisator kraal aan elk monster buis. </li><li> Voeg de juiste hoeveelheid htab buffer op basis van weefsel gewicht. Als weefsel gewicht is minder dan 25 mg, voeg de buffer in een verhouding van 12.5mg/mL, als weefsel gewicht is tussen de 25-50, toe te voegen in een verhouding van 25mg/ml. Als weefsel gewicht groter is dan 50, voeg buffer in een verhouding van 50mg/mL. </li><li> Homogeniseren met een tissue homogenisator voor 4 min bij 30 Hz. Herhaal indien weefsel is niet volledig gehomogeniseerd. </li><li> Verwijder de homogenisator kraal en centrifugeer oplossing voor 6 min (13.400 xg, 4 ° C). </li><li> Verzamel supernatant af en gooi de resulterende pellet. Supernatent kan worden opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Monstervoorbereiding voor cytokine analyse. <ol><li> Herhaal de stappen 5.1.1. naar 5.1.2. </li><li> Voeg 50 ul van protease inhibitor cocktail (PIC) tot 10 ml bereid lysis buffer. </li><li> Voeg 1 ml van de PIC en lysisbuffer oplossing voor elk monster ongeacht het gewicht. </li><li> Homogeniseren gedurende 5 min bij 30 Hz. Herhaal indien weefsel is niet volledig gehomogeniseerd. </li><li> Verwijder de homogenisator kraal en centrifuge solutigedurende 5 min bij 3300 x g. </li><li> Verzamel supernatant af en gooi de resulterende pellet. Supernatant kan worden opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 6. Kwantificering van inflammatoire markers <ol><li> MPO-activiteit test <ol><li> Bereid o-dianisidine dihydrochloride (o-dianisidine) oplossing door het combineren van 16,7 mg van de o-dianisidine dihydrochloride, 90 ml dH 2 O, en 10 ml van kalium fosfaat buffer. Deze oplossing moet vers worden bereid voor elke test. </li><li> Voeg 7 ul van weefsel homogenaat (opgesteld in paragraaf 5.1) in drievoud in een 96-wells plaat. </li><li> Voeg 50 ul van verdund H 2 O 2 (4 pi van 30% H 2 O 2 verdund in 96 uL van dH 2 O) om de o-dianisidine mengsel. </li><li> Gebruik een multi-channel pipet tot 200 pi van de o-dianisidine mengsel dat H 2 O 2 aan elk van de bronnen toe te voegen. </li><li> Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een spectrophotometer. Neem drie metingen om de 30 seconden. </li><li> Bereken MPO-activiteit. MPO-activiteit wordt gemeten in units (U) van MPO / mg weefsel, waar een eenheid van de MPO is gedefinieerd als de hoeveelheid die nodig is om een mol van H 2 O 2 per minuut bij kamertemperatuur af te breken. Gezien het feit dat een eenheid (U) van MPO = 1 umol van H 2 O 2 gesplitst en dat 1 mol van H 2 O 2 een verandering van de absorptie van 1,13 x 10 -2 nm / min geeft, is eenheden van MPO in elk monster bepaald als verandering in de absorptie [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Om eenheden per mg van het weefsel, gebruik het weefsel: buffer verhouding. Bijvoorbeeld, als een tissue: buffer verhouding van 50 mg / ml werd gebruikt, in 7 ul homogenaat, is er 0,35 mg van het weefsel. Daarom, om eenheden per mg weefsel te krijgen, deelt u de eenheden van de MPO met 0,35. Een voorbeeld van een berekening met behulp van absorptie-waarden (nm) is hieronder opgenomen (ervan uitgaande dat het monster is toegevoegd in drievoud): </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td colspan="3"> Tijd 0 sec </td><td colspan="3"> Tijd 30 sec </td><td colspan="3"> Tijd 60 sec </td></tr><tr><td> Een </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0.048 </td><td> 0.048 </td><td> 0.051 </td><td> 0.061 </td><td> 0.061 </td><td> 0.065 </td><td> 0.074 </td><td> 0.073 </td><td> 0.078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Gemiddeld op Time 0 sec = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0,049 nm </li><li> Gemiddeld op tijd 30 sec = 0.0623 nm </li><li> Gemiddeld op Time 60 sec = 0,075 nm </li><li> Verandering in de absorptie (AA) van 0 tot 30 sec / mg weefsel (in de veronderstelling 50 mg / ml weefsel: buffer-ratio) = [(+0.0623-+0.049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Verandering in te absorberenAnce (AA) van 30 tot 60 sec / mg weefsel = 3.211 </li><li> * MPO-activiteit (U / mg weefsel) = gemiddelde van ΔA (0-30) en ΔA (30-60) = 3.287 </li></ol><ol start="2"><li> Kwantificering van pro-inflammatoire cytokines door middel van ELISA <ol><li> Cytokine (IL-1β, IL-6 en TNF-α) niveaus worden bepaald met behulp van commercieel beschikbare enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Quantikine Muizen, R &amp; D Systems). </li><li> Absorptie waarden van elk ELISA is genormaliseerd met behulp van een eiwit Bradford assay onderscheiden aan elk monster en wordt uitgedrukt in eenheden van pg / mg eiwit. </li></ol></li></ol> 7. Representatieve resultaten Toediening van de juiste DSS regime zal leiden tot acute colitis bij muizen. Tijdens de duur van de DSS-behandeling kan DAI worden gebruikt voor het beoordelen en evalueren van de klinische progressie van de ziekte. Dieren die behandeld worden met DSS zal blijken significant gewichtsverlies ten opzichte van hun oorspronkelijke gewicht, dunne ontlasting en fecalebloeden (figuur 1). Bij het ​​offer en het onderzoek van de dikke darm, is de ernst van colitis macroscopisch scoorde op basis van verkorting van de dikke darm lengte, colon bloeden, fecale bloeden, versoepeling van consistentie van de ontlasting, en tekenen van rectale bloeden in vergelijking met controles die werden behandeld met alleen water (figuur 2 &amp; Table 1). Cross secties van dikke weefselmonsters gekleurd met H &amp; E hebben een hogere histologische scores voor DSS-behandelde dubbele punt ten opzichte van water-behandelde controles (figuur 3). Om verder te karakteriseren de mate van ontsteking in DSS-behandelde muizen, kan MPO-activiteit worden beoordeeld vanuit gehomogeniseerd colon weefselmonsters. DSS behandelde dubbele punten hebben een hogere MPO-activiteit in vergelijking met controles (figuur 4). Bovendien is dit geassocieerd met verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) (figuur 5). <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Figuur 1. Man, werden C57BL / 6 muizen die 5% DSS in het drinkwater gedurende 5 dagen. DAI scores werden dagelijks onderzocht voor elk dier en werden gemiddeld per dag voor elke groep (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Figuur 2. C57BL / 6 muizen kregen 5% DSS in het drinkwater gedurende 5 dagen. Controle muizen kregen water zonder DSS. Macroscopische schade score / ernst van de ziekte scores werden blind beoordeeld op dag 5 na de DSS-geïnduceerde colitis. Dubbele punten geïsoleerd uit muizen die DSS kreeg een hogere macroscopische schade scores (rectale bloeden, rectale verzakking, diarree, dikke bloeden) geeft een grotere ernst van de ziekte (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. C57BL / 6 muizen kregen 5% DSS-oplossing in het drinkwater om colitis veroorzaken. Controle muizen<html> ontvangen water zonder DSS. (A) histologische scores werden blind gescoord met behulp van H &amp; E gekleurde dikke weefselcoupes verzameld op dag 5 na de DSS administratie. (B) DSS-behandelde monsters toon meer histologische schade (meer cellulaire infiltratie, meer goblet cel depletie, een grotere vervorming / beschadiging van crypt architectuur) in vergelijking met (C) controles (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). In (B) en (C), sterretje (*) geeft gebied van goblet cel depletie en vervorming van de crypte architectuur; hekje (#) geeft cellulaire infiltratie. <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Figuur 4. Alle muizen werden opgeofferd op dag 5 na toediening van de DSS en colon weefselmonsters werden verzameld om MPO-activiteit te beoordelen. De ernst van DSS geïnduceerde colitis wordt geassocieerd met hogere niveaus van MPO activiteit in vergelijking met controles (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Naast de hogere MPO niveaus, de ernst van de DSS-geïnduceerde colitis wordt ook geassocieerd met een verhoogd niveau van pro-ontsteking cytokinen zoals IL-1β, IL-6, TNF-α (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). <table border="1"><tbody><tr><td> Score </td><td> Rectale bloeden </td><td> Rectale prolaps </td><td> Consistentie van de ontlasting </td><td> Bloed </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Geen </td><td> Geen </td><td> Normaal </td><td> Normaal </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Rood </td><td> Tekenen van verzakking </td><td> Zacht </td><td> Rood </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Dark Red </td><td> Duidelijke verzakking </td><td> Zeer zacht </td><td> Donkerrood </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Bruto Bloeden </td><td> Uitgebreide verzakking </td><td> Diarree </td><td> Zwart </td></tr></tbody></tstaat&gt; Tabel 1. Macroscopische / Disease Severity Score

<ol><li>Sands, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+symptom+to+diagnosis%3A+clinical+distinctions+among+various+forms+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).</li>
<li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiopathogenesis+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases.</a> World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+effects+in+CD4%28%2B%29-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+acute+murine+dextran+sodium+sulphate+colitis%3A+cytokine+profile+and+dose+dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency.</a> Digestion. 62, 240-248 (2000).</li>
<li>Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+acute+intestinal+inflammation+based+on+myeloperoxidase+activity.+Assessment+of+inflammation+in+rat+and+hamster+models%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models.</a> Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).</li>
<li>Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathologic+study+of+dextran+sulfate+sodium+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis.</a> Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).</li>
<li>Smith, J. W., Castro, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+peroxidase+activity+in+gut+mucosa+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation.</a> Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).</li>
<li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vagus+nerve%3A+a+tonic+inhibitory+influence+associated+with+inflammatory+bowel+disease+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model.</a> Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).</li>
<li>Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).</li>
<li>Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+model+of+colitis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview.</a> Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).</li>
<li>Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).</li>
<li>Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+resident+intestinal+flora+in+acute+and+chronic+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice.</a> Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).</li>
<li>Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+enteric+bacteria+induce+and+perpetuate+experimental+colitis+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice.</a> Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).</li>
<li>Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+has+a+key+role+in+pathogenesis+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).</li>
<li>Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+murine+inflammatory+bowel+disease%3A+mucosa+immune+responses+and+protection+by+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance.</a> J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).</li>
<li>Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+occurs+in+severe+combined+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice.</a> Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

DSS colitis is een veel gebruikte chemisch geïnduceerde model van intestinale ontsteking. In dit model, muizen krijgen het drinkwater aangevuld met DSS, dat wordt gedacht dat zij giftig voor epitheelcellen darm en de integriteit van de mucosale barrière te verstoren. 10 Toediening van DSS induceert een acute colitis die wordt gekenmerkt door losse ontlasting, fecale bloeden, en infiltratie met granulocyten. 10 Tijdens DSS toediening wordt colitis meestal geassocieerd met significant gewichtsverlies...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur: </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuis (2 ml) </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 Absorptie plaat reader </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Dextraansulfaat natriumzout reagens waardering (moleculair gewicht 36,000-50,000 Da) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 (software) </td><td> Biotek </td><td> Versie 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadecyltrimethylammonium bromide (htab) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Waterstofperoxide, 30 gew.% Oplossing in water </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Bewaren bij 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest platen 96-well vlakke bodem </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td><td> Voor eenmalig gebruik </td></tr><tr><td> o-dianisidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Lichtgevoelig. Bewaren bij 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat, dibasisch </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat, monobasisch </td><td> Merck Chemicals </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaseremmer cocktail </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten Carbide kralen voor Tissue Lyser II </td><td> Quiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoeken darmontsteking in dss-geïnduceerde model van ibd

Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Inflammatoire darmziekte (IBD) omvat een reeks van intestinale aandoeningen, de meest voorkomende daarvan zijn colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). Zowel de UC en CD, indien aanwezig in de dikke darm, een soortgelijk symptoom profiel dat diarree, rectaal bloeden, buikpijn en gewichtsverlies kunnen bestaan ​​uit genereren. 1 Hoewel de pathogenese van IBD nog onbekend is, wordt beschreven als een multifactoriële ziekte die zowel betrekking genetische en omgevingsfactoren componenten. 2 Er zijn talrijke en variabele diermodellen van de dikke darm ontsteking die lijken op een aantal kenmerken van IBD. Diermodellen van colitis variëren van ontstaan ​​spontaan in gevoelige stammen van bepaalde soorten aan die bestanddelen die de toediening van specifieke concentraties van colitis-inducerende chemische stoffen, zoals dextran sulfaat natrium (DSS). Chemisch-geïnduceerde modellen van de darm ontsteking zijn de meest gebruikte en beste omschreven modellen van IBD. Administratie van DSS in het drinkwater produceert acute of chronische colitis, afhankelijk van de administratie-protocol. 3 dieren gegeven DSS vertonen gewichtsverlies en tekenen van losse ontlasting of diarree, soms met het bewijs van rectale bloeden. 4,5 Hier beschrijven we de methoden waarmee colitis ontwikkeling en de daaruit voortvloeiende ontstekingsreactie kan worden gekenmerkt na toediening van DSS. Deze methoden omvatten histologische analyse van hematoxyline / eosine gekleurde dikke delen, meting van pro-inflammatoire cytokines, en de bepaling van myeloperoxidase (MPO) activiteiten, die gebruikt kan worden als een surrogaat marker van ontsteking. 6 De omvang van de ontstekingsreactie bij de ziekte van de staat kan worden beoordeeld door de aanwezigheid van klinische symptomen of door verandering in de histologie in mucosale weefsels. Colonic histologische schade wordt beoordeeld door middel van een scoresysteem dat het verlies van de crypte architectuur, inflammatoire cel infiltratie, spier t beschouwthickening, beker-cel depletie, en crypte abces. 7 kwantitatief, kan het niveau van pro-inflammatoire cytokines met acute inflammatoire eigenschappen, zoals interleukine (IL)-1β, IL-6 en tumor necrosis factor (TNF)-α, worden bepaald met behulp van conventionele ELISA methoden. Daarnaast kan MPO-activiteit worden gemeten met behulp van een colorimetrische assay en gebruikt als een index van een ontsteking. 8 In experimentele colitis, is ernst van de ziekte vaak gecorreleerd met een toename van de MPO-activiteit en hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines. Colitis ernst en ontsteking-gerelateerde schade kan worden beoordeeld door na te gaan consistentie van de ontlasting en bloeden, in aanvulling op de beoordeling van de histopathologische toestand van de darm met behulp van hematoxyline / eosine gekleurde colon weefselcoupes. Colonic weefsel fragmenten kunnen worden gebruikt om de MPO activiteit en cytokine productie te bepalen. Tezamen kunnen deze maatregelen worden gebruikt om de intestinale ontstekingsreactie in te evaluerendiermodellen van experimentele colitis.

Experimentele modellen van inflammatoire darmziekte hebben ons de complexe aangeboren en adaptieve immuunrespons geassocieerd met pathogenese te onderzoeken. Met behulp van histologische scoring, kwantificering van pro-inflammatoire cytokines en myeloperoxidase activiteit, kan men beginnen met deze reacties gezien bij inflammatoire darmziekten te beoordelen.

Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Inflammatoire darmziekten (IBD) omvatten een reeks intestinale pathologieën, waarvan colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn de meest voorkomende zijn ...

Het algemene doel van deze procedure is om de intestinale immuunrespons die wordt geïnduceerd door dextran sulfaat natrium te evalueren door de hoeveelheden myeloperoxidase-activiteit en pro-inflammatoire cytokinen te bepalen die als reactie op de ontsteking worden geproduceerd. Eerst wordt DSS-colitis bij muizen geïnduceerd door de toevoeging van een DSS-zoutoplossing aan het drinkwater. Vervolgens wordt de ernst van de colitis beoordeeld via macroscopische scoring en wordt het colon verwijderd voor verdere analyse.Het gedissecteerde colon wordt vervolgens in drie stukken gesneden voor histologie, cytokwinekwantificering en MPO-activiteit. Tot slot wordt het colonweefsel gehomogeniseerd en wordt het supernatant gebruikt om de MPO-activiteit te bepalen. Uiteindelijk kunnen veranderingen in de MPO-activiteit worden bepaald aan de hand van de absorbantiegegevens die met een spectrofotometer zijn verzameld.Deze methode kan inzicht bieden in chronische informatie van diverse modellen van inflammatoire darmziekten, zoals DSS- en TNBS-geïnduceerde colitis. Daarnaast kunt u deze methode toepassen in andere organen, zoals de longen en de lever. Vervang vóór aanvang van de procedure het dri

investigating-intestinal-inflammation-in-dss-induced-model-of-ibd

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dextransulfaat natrium (DSS) toegediend in het drinkwater is een gevestigde murine inflammatoire letsel model van acute colitis. Dit protocol beschrijft de methode voor DSS behandeling en de preparatie van de weefsels.

Murine Colitis Modeling met dextraansulfaat Natrium (DSS)

This video demonstrates a technique to generate a chemical-induced murine model of colitis — an inflammatory bowel disease. The mouse is allowed to consume a dextran sodium sulfate (DSS) solution for an adequate duration. Upon consumption, DSS damages the mucus and epithelial layer barrier in the colon, allowing gut microbes to enter the underlying tissue — where they are sensed by the resident immune cells to mediate an exaggerated immune response, resulting in inflammation.

A Technique to Generate a Murine Model of Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis

This video demonstrates the hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining method to evaluate colon damage in a murine model of DSS-induced colitis — an inflammatory bowel disease. Upon isolating the colon from a DSS-treated mouse and obtaining sections of the tissue, H&amp;E staining of the sections helps identify the inflammation-mediated tissue damage.

Hematoxylin and Eosin Staining to Assess Colon Damage in DSS-Induced Colitis

DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.

DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Accurate beoordeling van ontstekingsremmende effecten is van het grootste belang voor de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekte. Digitale holografische microscopie biedt beoordeling van ontsteking in muis- en menselijke colonweefselmonsters evenals geautomatiseerde multimodale evaluatie van epitheel wondgenezing in vitro.

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Huidige behandelingen van inflammatoire darmziekten (IBD) zijn gericht op het verlichten van de ziektesymptomen, maar kan ernstige bijwerkingen veroorzaken. Zo worden alternatieve strategieën onderzocht in dierlijke modellen colitis. Hier leggen we uit hoe de gunstige effecten van voedingssupplementen op de klinische IBD borden worden geanalyseerd in een dergelijk colitis model.

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar het effect van de ongeldigheidsverklaring van gustation-gerelateerde genen op immuunresponsen bij een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muismodel van inflammatory bowel disease (IBD).

Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease

Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.

Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

Jared Leadbetter verklaart waarom de termiet-darm microbiële gemeenschap is een uitstekend systeem voor het bestuderen van de complexe interacties tussen microben. De symbiotische relatie bestaat tussen de host insecten en lignocellulose-afbrekende darm microben wordt uitgelegd, evenals het industrieel gebruik van deze micro-organismen voor de afbraak van plantaardige biomassa en het genereren van biobrandstoffen.

Het onderzoeken van de microbiële gemeenschap in de Termite einddarm - Interview

Leer de darmimmunrespons evalueren bij DSS-geïnduceerde colitis in muizen door myeloperoxidase-activiteit en pro-inflammatoire cytokines te kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in de immuunmechanismen van inflammatoire darmziekten.

Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Meer video's verkennen