Segmentatie en waardering van de FAT-volumes in muriene modellen Obesitas Met behulp van X-stralen Computer Tomografie

Het algemene doel van deze procedure is om op niet-invasieve wijze het vetgehalte van levende muizen in kaart te brengen, te kwantificeren en te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een röntgen-CT-scan van de muis uit te voeren. De tweede stap van de procedure is het segmenteren en kwantificeren van de vetvolumes in de muis op basis van radiodichtheid.

De derde stap is het visualiseren van de CT-gegevens in drie dimensies, waarbij vetvolumes in rood zijn gemarkeerd. Uiteindelijk maken de resultaten de kwantificering en visualisatie van het vetgehalte mogelijk tijdens longitudinale in vivo studies met behulp van een albia X-ray ct, gekoppeld aan softwarepakketten van PMOD en vol view. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ex vivo analyse, is dat deze techniek non-invasieve en longitudinale beoordeling van vet in ziektemodellen bij kleine dieren mogelijk maakt.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het segmentatie- en visualisatieprotocol uit verschillende stappen bestaat die opeenvolgend moeten worden uitgevoerd. Bovendien moeten de optimale röntgenparameters tijdens de acquisitie worden gehanteerd. Om het beste contrast van vetweefsel te verkrijgen, begint u met het anesthetiseren van de betreffende obese muizen met behulp van een inductiekamer en brengt u deze vervolgens over naar een neusconus.

Houd de anesthesie in stand tijdens de beeldvorming; positioneer de muizen in een standaard rattenbed met de ledematen zijwaarts ten opzichte van de romp. Dit zorgt voor een uniforme CT-acquisitie. Stel het CT-systeem in om een bed van 115 millimeters lengte te scannen met gebruik van 600 projecties.

Stel de röntgenbron in op 200 µA en 45 kVp en gebruik een aluminium filter van 0,5 mm om de bundel te harden. De equivalente diepdedosis aan straling die de muis bij deze instelling ontvangt, is ongeveer 220 mSv, terwijl de ondiepe dosisequivalent op de computer 357,4 mSv is. Selecteer het FBP-algoritme met standaardparameters voor de beeldreconstructie.

Uiteindelijk bestaat het definitieve beeld uit isotrope foxholes van 125 micron, die gebruikt kunnen worden voor beeldanalyse van het gehele dier. De beeldanalyse wordt uitgevoerd met PMOD-analysesoftware; PMOD segmenteert eerst de beelden op basis van weefseldichtheid en bepaalt vervolgens het vetvolume. Verklein na het laden van het beeld de grootte ervan om de rekenkrachtbehoefte te minimaliseren.

Ga naar het tabblad voor het hoofdaanzicht, selecteer 'tools' en vervolgens 'reduce'. Stel de reductiewaarden in op twee voor X, twee voor Y en twee voor Z, vink dit aan, selecteer 'replace' en start het proces. Er verschijnt een berichtvenster wanneer het proces is voltooid.

Om bed- en neuskegelelementen uit de beelden te verwijderen, moeten deze worden gemaskeerd vóór de VOI-analyse. Ga naar planes layouts, rotations, mirror 3D markers en selecteer planes and layouts. Selecteer show plane Z. Scroll vervolgens naar de neuskegel in het Z-vlak.

Selecteer vervolgens het hoofdtabblad VOI en kies voor 'draw vertices'. Teken een ROI rond de neus, waarbij het bed en de neuskegel worden uitgesloten, en selecteer 'copy actual ROI to each other'. Voer een slice uit met het neuskegel-element.

Plak de ROI vanuit de buffer op de neus indien nodig. Gebruik het commando 'edit group of vertices' om de ROI's aan te passen. Wanneer de neuskegels niet langer zichtbaar zijn, verwijdert u de ROI en genereert u een VOI om de omtrek van het dier te omvatten.

Ga naar VOI-tools, gevolgd door masking en algebra. Voer -1000 in het daarvoor bestemde dialoogvenster in. Selecteer vervolgens de knop met de tekst Mask voxels outside the selected vois.

Wanneer het bericht "irreversible data operation do you want to continue" wordt weergegeven, selecteert u ja. Navigeer nu naar planes layouts, rotations, mirror 3D markers, en tenslotte naar planes and layouts. Selecteer show all planes.

Controleer de integriteit van de VOI. Wanneer de VOI correct is, slaat u deze op als een analysebestand en wijzigt u het voorvoegsel van de bestandsnaam. Ga vervolgens over tot het segmenteren van de afbeelding voor het totale diervolume.

Begin met het selecteren van tools en external. Selecteer vervolgens het selectievakje voor segmentatie. Voer een bereik van -300 tot +3.500 in en voer de segmentatie uit.

Select vervolgens VOI-statistieken, waarin statistieken worden gerapporteerd die het totale volume vertegenwoordigen. Noteer dit volume. Segmenteer nu het beeld voor het vetvolume door eerst terug te keren naar het niet-gesegmenteerde massa-beeld.

Laad vervolgens het opgeslagen massadata-bestand en vink het vakje 'analyze' aan in het laadvenster. Selecteer daarna 'tools' en 'external'. Vink vervolgens het selectievakje 'segmentation' aan.

Voer een bereik in van minus 200 tot minus 50 en voer de segmentatie uit. Selecteer na het goedkeuren van de resultaten VOI.Statistics. Let op: de gerapporteerde statistieken vertegenwoordigen het vetvolume.

Sla de resultaten op in het geanalyseerde formaat en geef een uniek prefix voor de bestandsnaam op. Indien er echter huid- of perifere densiteit overblijft, gebruik dan het erosie- en dilatatieprotocol om deze regio's te elimineren voor de VOI-analyse. Ga vóór het opslaan naar 'tools external' en selecteer het selectievakje 'morphological' in het nieuwe venster.

Selecteer erosie, gevolgd door. Oké, ga terug naar het selectievakje morfologie en selecteer dilatatie en oké, controleer of het probleem met de huid of de perifere dichtheid is opgelost en sla de resultaten op. Gebruik het softwarepakket Volvo view versie 3.2 om gerenderde 3D-visuele weergaven van de gesegmenteerde beelden te maken.

Begin met het openen van de CT-dataset die is opgeslagen in het analyseformaat. Gebruik de standaardinstellingen in het pop-upvenster, open vervolgens het plug-insmenu en selecteer onder 'utility' de optie 'merge volumes'. Vink 'rescale components' uit.

Klik op 'assign Second input'. Kies de gesegmenteerde vetdata voor de tweede input en gebruik de standaardinstellingen in het pop-upvenster. Pas vervolgens de plugin toe voor een groter overzicht van de proefmuis.

Dubbelklik op het venster met het volumeweergave. Ga terug naar het tabblad kleur/opaciteit. Het dropdown-menu voor componenten geeft aan welke dataset momenteel wordt bewerkt.

Onderaan het tabblad bevinden zich twee schuifregelaars. Deze bepalen de relatieve helderheid van elke componentdataset binnen de overlay met waarden tussen nul en één. Om de kleur bijvoorbeeld te wijzigen naar grijstinten, gaat u naar het gedeelte voor scalaire kleurtoewijzing.

Dubbelklik op een van de schuifregelaars en sleep deze uit het vak. Voeg een tweede schuifregelaar toe door ergens binnen het gebied van de schuifregelaars te klikken. Maak de linker kleurregelaar zwart en de rechter kleurregelaar wit.

Ga vervolgens naar het vak voor de scalaire opaciteitsmapping en maak een nieuw punt aan door binnen het vak te klikken. Dit resulteert in totaal in drie punten in het venster voor het middelste punt. Wijzig de scalaire waarde naar ongeveer -3000 en wijzig de opaciteitswaarde naar nul.

Aan de rechterkant van het venster bevindt zich het derde punt; wijzig de scalaire waarde hiervan naar ongeveer 32.000 en de opaciteit naar 0,25. Het eerste punt kan overal aan de linkerkant staan, zolang de opaciteitswaarde maar op nul staat. Nadat de scalaire waarde is ingesteld, schakelt u over naar component twee, waarmee het uiterlijk van het vet moet worden bewerkt; wijzig elke kleurschuif naar rood door dubbel te klikken en de kleurschuif H naar het uiteinde te slepen.

Hierbij wordt het vet valsgekleurd naar rood. Om een rotatiefilm met drie panelen te maken waarin de CT-scan, het vet en de overlay worden weergegeven, sleept u eerst met de muis het subject naar een rechtopstaande positie met de rug naar u toe gericht. Zet vervolgens onder 'component weights' de waarde van component twee op nul, zodat alleen de CT-scan wordt weergegeven. Klik daarna op 'review', vervolgens op 'camera' en selecteer het aantal frames voor de rotatiefilm. Wijzig tot slot de waarde voor de X-rotatie naar 360 graden.

Selecteer vervolgens 'create' in het pop-up dialoogvenster. Maak een nieuwe map aan met de naam CT en sla het bestand op in TIF-formaat, wat resulteert in een reeks rotatiebeelden. Herhaal deze stappen voor het vetbeeld en voor het gecombineerde vet-CT-beeld, waarbij de rotatiebeelden in hun eigen mappen worden opgeslagen. Om een rotatievideo van de output-beelden te genereren, opent u ImageJ en importeert u de beeldsequenties.

Selecteer de eerste afbeelding in de CT-map en de overige afbeeldingen worden automatisch geselecteerd. Herhaal dit proces voor de vet- en overlay-sequenties met een van de stacks. Nog steeds open.

Open de ROI-manager. Deze bevindt zich onder de analysetools (analyze tools). Teken in de ROI-manager een ROI rond de proefmuis, waarbij overbodige achtergrondpixels worden uitgesloten. Klik na voltooiing op 'add' in de ROI-manager.

Pas vervolgens dezelfde ROI toe op elke beeldsequentie. Wanneer de ROI op alle stacks is toegepast, klikt u met de rechtermuisknop. Selecteer binnen de ROI 'duplicate' en selecteer vervolgens de gedupliceerde stack.

Hiermee wordt de ROI gescheiden van de rest van de afbeelding. Sluit nu de grotere afbeeldingsstacks en herhaal deze procedure voor alle drie de beeldsequenties. Om de stacks te combineren, gebruikt u het commando combine, dat te vinden is onder stacks en vervolgens tools.

Selecteer de CT-stack voor stack één en de vet-stack voor stack twee. Herhaal vervolgens het proces door de nieuw gecombineerde stacks te selecteren voor stack één en de overlay-stack voor stack twee.

Hiermee is de creatie van een rotatiestapel van drie panelen voltooid. Bekijk een voorbeeld van de stapel door op afspelen te klikken in de linkerbenedenhoek van het afbeeldingsvenster. Sla deze vervolgens op als een AVI-film.

Obese B six V LE OB J-muizen werden gebruikt om de haalbaarheid van het Alber CT-systeem aan te tonen. Voor CT-gebaseerde metingen van het vetgehalte werden zij vergeleken met C 57 black six wild-type muizen. Links is het totale CT-volume van een obese muis te zien.

In het midden is het vetvolume in rood weergegeven, en rechts bevindt zich de overlay. Een soortgelijke analyse van wildtype dieren laat het aanzienlijke verschil in vetgehalte zien vergeleken met de obese muis. Het totale volume, het vetvolume en de volumeverhoudingen werden voor elk dier berekend.

De gemiddelde verhouding tussen vet en totaal volume voor de wild-type groep en de obese groep was respectievelijk 0,09 en 0,42. Deze waarden verschilden significant met een P-waarde van 0,001. Na het bekijken van deze video zou men, eenmaal beheerst, een degelijk begrip moeten hebben van hoe de vetvolumes binnen een CT-dataset van een levende muis gesegmenteerd kunnen worden.

Deze techniek zou minder dan 30 minuten in beslag moeten nemen. Bedankt voor het kijken, en tot de volgende keer.