Name: Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer hoe je een standaard inkjetprinter omzet tot een bioprinter voor het creëren van voorbijgaande celmembraanporiën. Deze methode maakt opname van fluorescerende G-actine in levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Thomas Boland erkennen voor het idee van het gebruik van de HP DeskJet printers voor cel af te drukken. De financiering voor dit project uit NSF RII-EPS 0903795 en NIH K25 HL0922280.

1. Het omzetten van de HP DeskJet 500 Er zij opgemerkt dat deze techniek moeten werken met veel commercieel inkjetprinters. Echter, ouderen printers neiging om te werken beter als ze inkt met grotere diameter sproeiers, die niet verstoppen zo gemakkelijk te gebruiken. Daarnaast oudere printers hebben de neiging om mechanische papierinvoer sensoren die zijn makkelijker te omzeilen gebruiken. Printers met optische sensoren kunnen worden bedrogen, maar met behulp van een kleine strook papier aan de andere kant van de printer tijdens elke cyclus, maar is een beetje moeilijker dan het mechanische systeem op &quot;truc&quot;. De momenteel in de handel verkrijgbare printers die het beste werken hebben een lage resolutie (DPI). Hogere resolutie printers de neiging om meer gemakkelijk verstopt raken. De resolutie van de HP Deskjet 500 is 300 DPI. Er zijn vele in de handel verkrijgbare printers (HP Deskjet serie en anderen), dat een resolutie van 600 DPI te hebben. Dit type printer kan worden gebruikt met slechts een kleine verhoging in het mondstukverstopping problemen die kunnen worden verlicht met behulp van zorgvuldige reiniging (deel 3). <ol><li> Verwijder de bovenste plastic behuizing van de printer door het ontsluiten diverse kunststof clips van de onderkant voet van de printer en langzaam het opheffen van de top uit. </li><li> Draai de knop / display licht paneel van de bovenkant van de printer, waarbij het is aangesloten op het moederbord van de printer. </li><li> Reinig de binnenkant van de printer, in het bijzonder de gebieden waar de cartridge rust en waar drukwerk optreedt. </li><li> Zoek de kabels stroom aan de papierinvoer mechanismen en haal ze van het moederbord. <ol><li> In de HP DeskJet 500, die net onder de lade naar links van de voorzijde. </li></ol></li><li> Zoek papier detectie mechanisme. Bypass het mechanisme door het aanbrengen van een koord of draad lus om te dienen als een handleiding pull handvat. <ol><li> In de HP DeskJet 500, het papier detectie mechanisme is een grijze plastic hendel gevonden boven en achter de drukkerij / papierinvoermechanisme. </li></ol></li><li> Een fase voor het papierinvoermechanisme (waarbij de papier wordt toegevoerd uit en gedeponeerd) om de gewenste druk dia brengen tot een niveau vlak onder de printkop patroon. <ol><li> Voor onze experimenten werd het schuim verzending houder 15 ml centrifugebuizen gebruikt met verschillende microscoopglaasjes tape in plaats van de druk regio het eindniveau van de dia op het gewenste hoogte. </li></ol></li><li> Om aseptische techniek te behouden, kan de printer worden geplaatst in een standaard biohazard kast of tafel laminaire stroming kap. </li><li> Het is belangrijk op te merken dat het wijzigen van een in de handel verkrijgbare inkt-jet printer meestal van de printer fabrikant garantie. </li></ol> 2. Het omzetten van Stock HP inktcartridges (HP 26 zwarte inktcartridge) <ol><li> Verwijder de cartridge uit de verpakking, waardoor de beschermende tape op de printer contacten en printkop voor het moment. </li><li> Stabiliseren van het lichaamvan de cartridge (zwart gedeelte) ofwel met een klem of bankschroef (gewoon stevig vastgrijpen van de cartridge met de hand gewoonlijk werkt ook), waardoor de groene top uit de buurt van een obstakel. </li><li> Met behulp van een tang of een verstelbare sleutel, pak de groene bovenkant van de cartridge en draai heen en weer een paar keer tot het breekt vrij. <ol><li> Dit niet veel kracht, maar de bovenste niet meer nodig, zodat het goed als breekt wanneer verwijderen. </li></ol></li><li> Met behulp van schroevendraaiers, wrikken uit de doorzichtige plastic stuk nu bloot. <ol><li> Ook zou dit niet veel kracht, maar niet nodig, zodat het goed als breekt tijdens het verwijderen. </li></ol></li><li> Giet het resterende uit het reservoir. </li><li> Verwijder de plastic beschermkap tape op de printer contacten en printkop. </li><li> Spoel de reservoirs met water. <ol><li> Gebruik een pipet of spuit het water te duwen door de kanalen. </li><li> Water zal waarschijnlijk lekken uit de printkop tijdensDit proces, dat aanvaardbaar is en geen schade toebrengen aan de functionaliteit van de cassette. </li></ol></li><li> Als het water helder blijft, laat de cartridge om te drogen. </li></ol> 3. Reiniging inktcartridge <ol><li> Om een ​​schoon printomgeving houden, moet de cartridge worden gereinigd en na gebruik. <ol><li> Dit helpt ook met het vermijden van kristallisatie van zouten en andere biologisch materiaal in de cartridge die kunnen verstoppingen veroorzaken. </li></ol></li><li> Volledig onderdompelen de cartridge in een bekerglas vol met gedeïoniseerd water en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten voor en na het afdrukken. </li><li> Na sonicatie, verwijdert u de cartridge uit het water, en schud het overtollige water. </li><li> Spray 70% ethanol in de cartridge om een ​​aseptische omgeving te creëren. <ol><li> Zorg ervoor dat de ethanol is opgedroogd voordat u de bioink printoplossing. </li></ol></li></ol> 4. Het maken van celsuspensie - &quot;Bioinkt &quot; <ol><li> Cultuur-cellen tot het moment van passage. <ol><li> Voor 3T3 fibroblasten: Seed cellen T-75 kolven ongeveer 1.3x10 4 cellen / cm 2 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS). Kweekcellen twee dagen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol></li><li> Merk fluorescerende g-actine stockoplossing een concentratie 50 pg / ml in fosfaatbufferoplossing (PBS). </li><li> Passage cellen. <ol><li> Voor 3T3 fibroblasten: Verwijder het afdrukmateriaal uit kolf en tweemaal met PBS te spoelen. Bedek cellen met 5 ml 0,25% trypsine + EDTA en incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 5 ml vers medium en pipetteren de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis conische centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Zuig besteed medium. </li></ol></li><li> Resuspenderen de cellen in PBS met fluorescerende g-actine stockoplossing bioink maken. <ol><li> Bioink moet een eindconcentratie van g-actine van 10 ug / ml en een cel concentration van 1x10 5 cellen / ml. Deze concentratie is geoptimaliseerd voor het bedrag beperken cellen per drop en verstopping van de printkop. 8 </li><li> Merk op dat 250 ul van bioink drie dekglaasjes met het patroon in figuur 2 drukt. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Voeding aan en laat de printer op te warmen. </li><li> Place gewenste drukoppervlak (hier we 22 mm x 22 mm dekglaasjes) in het midden van de fase bereid in stap 1.6. </li><li> Maak een drukkerij patroon bestand. <ol><li> Open Microsoft Word (of een andere tekening software), en teken het gewenste patroon. </li><li> Kies een gewenste afdrukinstellingen patroon voor cel afdrukken in de premade bestand. </li></ol></li><li> Plaats de voorbereide cartridge met de gewenste celsuspensie. <ol><li> Pipetteer suspensie in de kleine cirkelvormige en op de bodem van cartridgevak. Gebruik circa 100-120 ul oplossing. De gedrukte druppelgrootte is ongeveer 130picoliter 8. </li></ol></li><li> Print het bestand met de HP Deskjet 500 printer. <ol><li> Voor de beste resultaten af ​​te drukken kleinere patronen meerdere keren (5), door het veranderen van het aantal kopieën gewenst in het tekstverwerkingsprogramma. </li></ol></li><li> Printer weer op te warmen, dan cartridge gaat naar de &quot;klaar positie&quot;. </li><li> Bij het patroon beweegt in de gereed positie (iets naar links van de inkt infuus ver onder en blijft daar), trekt u het papierinvoermechanisme draad, en het afdrukken te beginnen. <ol><li> Voor meerdere exemplaren van het drukken, zal het papierinvoermechanisme moeten worden vrijgegeven na elke cyclus of pagina afgedrukt. De cartridge zal dan terug naar de &quot;klaar&quot; te zetten, en het papierinvoermechanisme draad moet weer worden verhoogd. </li></ol></li><li> De printer drukt op het dekglaasje geplaatst op het midden van de drukkerij stap in stap 5.2 (zie figuur 2). </li></ol> 6. Representatieve resultaten &lt;/ P&gt; De representatieve resultaten van het hele conversieproces van een standaard, off-the-shelf HP Deskjet 500, zal standaard HP 26-serie cartridges zorgen voor een printer met de mogelijkheid van het afdrukken van mobiele oplossingen voor veel soorten analyses zoals eerder vermeld. De voltooide printer na omzetting wordt getoond in Figuur 3 met een drukfase de microscoop dekglas plaatsen op. De printer kan nuttig zijn in de analyse op vele gebieden, met inbegrip van maar niet beperkt tot: enkele cel mechanica, weefsel-, gen transfectie, biosensor micropatterning, en directe celtherapie 1-10, 16-22. In dit voorbeeld werden een HP Deskjet 500 printer en HP 26-serie inktpatronen aangepast voor bioprinting. Met deze opstelling met een printer bioink bestaande uit een fibroblast celsuspensie in een g-actine monomeeroplossing werden cellen gedrukt op microscoopglasplaatjes dekglaasjes. Figuur 1 illustreert representatieve res<html> ULT&#39;s van gedrukte fibroblast cellen, die opgenomen tl-actine monomeren te laten zien. De resultaten werden verkregen in een gecontroleerde aseptische omgeving waarin de cellen werden gedrukt in aanpasbare patronen. Het patroon wordt gebruikt in dit voorbeeld is gemaakt in Microsoft Word (figuur 2). Dit patroon heeft een ononderbroken lijn van de gedrukte oplossing in de meeste microscoopglaasje. Figuur 4 toont de rechte lijn in de bioink en cellen elkaar afgezet. Opgemerkt dat direct na het printen, is er een toename van achtergrond fluorescentie omdat bioink oplossing waarin de cellen gesuspendeerd bevat vrije overmaat fluorescerende actine monomeren. Deze achtergrond fluorescentie vermindert aanzienlijk na de toevoeging van groeimedia de cellen (Figuur 1), waarbij een overmaat monomeer wast van het substraat. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Afbeeldingen slechts ter illustratie van de 3T3 fibroblasten 3 uur na het afdrukken met behulp van de gemodificeerde inkjet printer. Het interieur van de cellen geven opgenomen fluorescent gelabeld actine monomeren. Schaal balken geven 50 um. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Figuur 2. Dat werd gebruikt ter bioink af te drukken. <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Figuur 3. Printer na conversie met piepschuim podium. De oranje draad in het midden omzeilt de papierinvoer hendel sensor. <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatief beeld van 3T3 fibroblasten gedrukt in een plaatselijke drukkerij zone. Microscopie beeld dat vijf minuten na het afdrukken bij 20x vergroting. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Fluorescence beeld (40x vergroting) genomen 3 uur na het drukken met een fibroblast met geïnternaliseerde fluorescerende actine monomeren. Schaal balk vertegenwoordigt 50 um. <img alt="Figuur 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> Figuur 6. Fluorescentie microscopie (20x vergroting) van een cel die 15 minuten na het afdrukken. Het beeld toont zowel g-actine (groen) en de kern (blauw). Van links naar rechts: G-actine met Alexa Fluor 488, kern met DAPI, en een overlay van beide. <img alt="Figuur 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> Figuur 7. Fluorescentie microscopie die twee fibroblasten in een lijn patroon 3 uur na het afdrukken. Afbeelding links toont fluorescent gelabelde actine-monomeren in de cellen. Afbeelding rechts is een overlay van de tl-kanaal met de achtergrond afbeelding om te laten zien dat, hoewelkan er wat vuil op de foto (linksonder) te zijn, is het niet fluoresceren. Schaal balken geven 50 pm Als grootte niet aangegeven extreem-rechts is een controlegroep van niet-gedrukte cellen geïncubeerd gedurende 3 uur met fluorescent gelabeld monomeren. Deze controle is aan te tonen dat monomeren niet de celmembraan dringen zonder membraan permeabilisatie door cel afdrukken.

<ol><li>Calvert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Printing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Printing cells.</a> Science. 318, 208-209 (2007).</li>
<li>Mironov, V., Reis,, Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Bioprinting%3A+A+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Review: Bioprinting: A beginning.</a> Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).</li>
<li>Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Implementation+of+a+two-dimensional+inkjet+bioprinter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+IEEE+Eng.+Med.+Biol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter.</a> Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).</li>
<li>Campbell, P., Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+the+aid+of+inkjet+printers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Biol.+Th%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with the aid of inkjet printers.</a> Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).</li>
<li>Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+inkjet+printing+to+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Application of inkjet printing to tissue engineering.</a> Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).</li>
<li>Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Living+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Living Structures.</a> J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).</li>
<li>Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-mediated+gene+transfection+into+living+cells+combined+with+targeted+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).</li>
<li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Damage+Evaluation+of+Thermal+Inkjet+Printed+Chinese+Hamster+Ovary+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Saunders, R., Derby, B. B. ioprinting Inkjet Deposition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaunders%2C+R+%22Encyclopedia+of+Industrial+Biotechnology%3A+Bioprocess%2C+Bioseparation%2C+and+Cell+Technology%22">Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology</a>. 15, John Wiley & Sons. (2010).</li>
<li>Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependency+of+nanoparticle+mediated+gene+transfection%3A+studies+with+fractioned+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles.</a> Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li>
<li>Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+Traffic+in+Polarized+Epithelial+Cells%3A+Role+of+Actin+and+microtubule+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton.</a> Traffic. 2, 149-159 (2001).</li>
<li>Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).</li>
<li>Allen, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament+uncapping+localizes+to+ruffling+lamellaw+and+rocketing+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles.</a> Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).</li>
<li>Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-based+biopatterning+of+bone+morphogenetic+protein-2+to+spatially+control+calvarial+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).</li>
<li>Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+alignment+using+inkjet+printer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+1094+%28DD%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix alignment using inkjet printer technology.</a> Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).</li>
<li>Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+of+macromolecules+on+hydrogels+to+steer+neural+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).</li>
<li>Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jet-based+methods+to+print+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).</li>
<li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvasculature+fabrication+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering.</a> Science. 260, 920-926 (1993).</li>
<li>Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+fabrication+with+covalent+attatchment+of+DNA+using+Bubble+Jet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology.</a> Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Het proces om een ​​standaard inkjet desktop printer voor bioprinting is niet bijzonder moeilijk. De meest uitdagende stap is het bepalen van hoe het papierinvoermechanisme, die afhankelijk is van het merk en model van de printer gebruikt te omzeilen. Dit is echter relatief eenvoudig de papierinvoer sensor mechanische zoals hier beschreven. Voor modellen met optische-feed sensoren, kunnen andere technieken moeten worden ingezet om de printer te laten denken is het papier met behulp van, bijvoorbeeld, kan men een klein stukje papier door de printer tijdens het afdrukken op de microscoop dia. Het omzeilen van de papierinvoermechanisme is waarschijnlijk de moeilijkste stap in de toepassing van deze procedures om andere printer modellen. Bij de bouw van een fase van de dekglaasjes vasthouden voor het drukken is het belangrijk om een ​​goede uitlijning en hoogte. Het podium moet het mogelijk maken voor het dekglaasje te worden geplaatst in het midden van het afdrukgebied. Bovendien, het zou moeten place het dekglaasje op een voldoende hoogte om goedkeuring voor de inktpatroon door te geven over de dia zonder verstoring van het. De exacte hoogte van de fase zal afhangen van de printer model. Om ervoor te zorgen dat de afgedrukte cellen niet weg te krijgen gewassen, werden de dia&#39;s in een incubator geplaatst direct na het afdrukken van ongeveer 30 minuten om voor celhechting voordat aanvullende celgroei media werd toegevoegd. Omdat de cellen werden gedrukt in een oplossing die veel PBS de cellen niet uitdroogt en bleef levensvatbare omvat. Cellen werden belicht met fluorescentiemicroscopie de verdeling van het gelabelde g-actine monomeren in de cel (figuren 1, 5-7) visualiseren. Bij het ​​afdrukken van 3T3 fibroblasten, Figuur 5 toont een representatief resultaat met actine waardoor veel van de cel te fluoresceren maar presentatie lijnen van verhoogde helderheid. De integratie van fluorescent gelabeld g-actine in het cytoskelet isnuttig voor de studie van cytoskelet dynamiek en cellulaire mechanica. 12-15 Een beperking van deze techniek is dat alleen voor moleculen en eiwitten die diameters kleiner dan ongeveer 10 nm. Om cellen daadwerkelijk worden verwerkt door de printer omgezet, werd DAPI (1:5000 in PBS) aan het bioink in plaats van de helft van het volume zuivere PBS. De fluorescerende vlek DAPI bindt aminozuur rijke porties DNA in de kern. Daarom DAPI is nuttig vlek in fluorescent beeldvorming kernen van de gedrukte cellen. Figuur 6 toont een representatief beeld van een cel getoond zowel Alexa Fluor 488 (actine) en DAPI (kern) fluorescentie met een overlaybeeld van beide. Figuur 7 illustreert hoe de cellen eenmaal lichten de g-actine monomeren zijn opgenomen, terwijl niet-biologisch materiaal dat is afgezet in het monster niet fluoresceren door de absence van g-actine monomeren. Een belangrijke overweging voor bioprinting is de waterige media wordt gebruikt voor de bioink. Het bleek dat met behulp van standaard celgroei media met serum inconsistente resultaten opgeleverd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan verstopping van de print-spuitkanaaltjes door serum eiwitten. Het gebruik van PBS om de consistentie van gedrukte patronen en het aantal cellen, werd gedeponeerd. Een nadeel van PBS dat cellen niet worden gelaten in de suspensie gedurende langere tijd. Echter, fibroblasten in deze voorbeelden waren in staat om de bioink voorwaarden voor minstens een uur tolereren, zonder verandering in de levensvatbaarheid van de cellen. Dit is consistent met diverse eerdere bevindingen, die melden dat cellen afgedrukt via thermische inkjet mechanismen is aangetoond dat een hoge levensvatbaarheid tarieven. 2-8 Deze aangepaste installatie van de printer kan worden gebruikt voor andere toepassingen dan de cel af te drukken. 16-22 Matrix eiwitten, zoals collageen of fibronectin, gemakkelijk kunnen worden afgedrukt op substraten met deze techniek, die nuttig zijn voor cellen patronen. Bijvoorbeeld collageen type I gedrukt in lijn zal resulteren in lijn collageen substraten die kunnen worden gebruikt voor in vitro celkweek studies. 17 Naast matrixeiwitten andere moleculen, zoals groeifactoren, betrouwbaar kan worden gelokaliseerd op substraten voor celstudies en potentiële therapeutische toepassingen. 18 Een belangrijke beperking van het ontwerp zoals hierboven beschreven stappen is dat deze printer niet kan afdrukken in meer dan een dimensie. Dit beperkt de mogelijkheden voor gebruik in patroon toepassingen zoals steiger afdrukken. Om voor 3D-printing, een gespecialiseerde stadium moet worden gebruikt. Het podium dient te beschikken over incrementele hoogte verstelbaar voor laag-voor-laag afzetting van bioink. Bioprinting heeft aangetoond belofte als een efficiënte en kosten-effectieve methode voor tissue engineering, Gen transfectie micropatterning en microarray fabricage 1-12, 16-22 De toekomstige toepassingen van dergelijke inrichting zijn vele, waaronder:. Creëren van gecontroleerd en patronen cellulaire micromilieus, opname van macromoleculen in cytoplasma en afzetting van cellen op steigers en structuren die niet de natuur voorkomen of efficiënt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> HP DeskJet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Beëindigde van de fabrikant. Gekocht gerenoveerde december Trader. </td></tr><tr><td> HP 26 zwarte inktcartridge </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> Actin van konijn spieren, Alexa Fluor 488 conjugaat, 200 pg </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Gebruikt op 0,5% in de media voor celkweek </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Gebruikt op 0,5% in de media voor celkweek </td></tr><tr><td> Unidirectionele Flow Clean Bench </td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td> Optionele behuizing voor het houden van printer aseptische </td></tr></tbody></table>

het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting heeft een breed scala van toepassingen en het belang, met inbegrip van tissue engineering, directe cel applicatie therapieën, en biosensor microfabricage. 1-10 Onlangs heeft thermische inkjettechnologie ook gebruikt voor gen transfectie. 8,9 De thermische inkjet printing proces werd aangetoond dat tijdelijk verstoren de celmembranen zonder dat dit invloed levensvatbaarheid van de cellen. De tijdelijke poriën in het membraan kunnen worden gebruikt om moleculen die anders te groot zijn om door het membraan in de cytoplasma. 8,9,11 voeren De toepassing wordt hier gedemonstreerd is het gebruik van thermische inkjettechnologie voor de integratie van fluorescent gelabelde g-actine-monomeren in de cellen. Het voordeel van thermische inktstraaldrukkers om moleculen injecteren in cellen is dat de techniek relatief goedaardige aan cellen. 8, 12 levensvatbaarheid van de cellen na afdruk is gebleken dat vergelijkbaar met standaard cel plaTing methoden 1,8. Daarnaast kunnen inkjet printen verwerken duizenden cellen in een paar minuten, dat is veel sneller dan handmatige micro-injectie. De poriën die door drukken is gebleken sluiten binnen ongeveer twee uur. Er is echter een grens aan de grootte van de poriën gemaakt (~ 10 nm) met deze druktechniek, waarbij de techniek beperkt tot injecteren cellen met kleine proteïnen en / of deeltjes. 8,9,11 Een standaard HP DeskJet 500-printer is gewijzigd, zodat voor cel af te drukken. 3, 5, 8 De deksel van de printer werd verwijderd en het papierinvoermechanisme was gepasseerd behulp van een mechanische hefboom. Een podium is gemaakt om voor de plaatsing van objectglaasjes en dekglaasjes kan direct onder de printkop. Inktpatronen werden geopend, de inkt werd verwijderd en ze werden gereinigd voor gebruik met cellen. De drukkerij patroon is gemaakt met behulp van standaard tekensoftware, die vervolgens de printer gecontroleerd door middel van een eenvoudige printopdracht. 3T3 fibroontploffing werden gekweekt tot confluentie, getrypsiniseerd, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing met oplosbare fluorescent gelabelde g-actine-monomeren. De celsuspensie werd gepipetteerd in de inktpatroon en lijnen cellen werden gedrukt op microscoopglasplaatjes dekglaasjes. De levende cellen werden afgebeeld met behulp van fluorescentie microscopie en actine werd gevonden in het cytoplasma. Integratie van TL-actine in de cel zorgt voor beeldvorming van de korte tijd cytoskelet dynamiek en is nuttig voor een breed scala aan toepassingen. 13-15

Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een ​​HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Bioprinting heeft een breed scala aan toepassingen en betekenis, waaronder weefseltechniek, therapieën voor directe celtoepassing en biosensoren ...

Het algemene doel van deze procedure is om met behulp van inkjetprinten tijdelijke poriën in celmembranen te creëren. Dit wordt bereikt door eerst een standaard inkjetprinter aan te passen. De tweede stap is het legen en reinigen van een standaard inktcartridge voor de printer om de invoering van de bio-inkt mogelijk te maken.Vervolgens worden de relevante cellen gesuspendeerd in een oplossing van fluorescent gelabelde actine-monomeren en PBS om de bio-inktoplossing te maken. De laatste stap is het printen van de bio-inkt op microscoopglasplaten met behulp van de aangepaste printer en cartridge. Uiteindelijk kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om aan te tonen dat de Fluor four-geconjugeerde G-actine-monomeren door de geprinte cellen zijn geïnternaliseerd via tijdelijke membraanporiën.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard transfectie- en celmicroinjectietechnieken is dat deze printtechniek eenvoudig in gebruik is en een hoge cellevensvatbaarheid oplevert. Hoewel deze techniek inzicht kan bieden in de genetica, kan zij ook worden toegepast op andere vakgebieden, zoals de celbiofysica en tissue engineering in de celbiofysica. Deze techniek kan worden gebruikt om het cytoskelet van een cel tijdens celmigratie eenvoudig te observeren.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we veranderingen in de organisatie van het cytoskelet wilden kunnen visualiseren als gevolg van uitgeoefende krachten op cellen. Begin met het lossen van de plastic klemmen aan de onderzijde van de printer en til vervolgens voorzichtig de bovenste plastic behuizing omhoog. Koppel daarna het lichtpaneel van het knoppendisplay los van de bovenkant van de printer, waarbij de verbinding met het moederbord van de printer behouden blijft.Gebruik Kim wipes en ethanol. Maak de binnenkant van de printer schoon, met name de gebieden waar de inktcartridge rust en waar het printen plaatsvindt. Zoek vervolgens de kabel die de stroomvoorziening voor de papieraanvoermechanismen van de HP desk Jet 500 verzorgt.Ze bevinden zich net onder het papierlade aan de linkerkant van de voorzijde; trek de kabels uit het moederbord. Lokaliseer nu het papierdetectiemechanisme en bevestig een ijzerdraadlus aan de grijze plastic hendel boven en achter het papieraanvoermechanisme om als handmatig handvat te dienen, en plaats hier een platform. De schuimrubberen transporthouder voor 15 centrifugebuizen wordt gebruikt met verschillende microscoopglaasjes die met tape op hun plek zijn bevestigd in het printgebied voor het papieraanvoermechanisme, om de gewenste printglaasjes op een niveau net onder de printkop van de cartridge te brengen.Plaats ten slotte de printer in een laminaire flowkast om een aseptische techniek te waarborgen. Begin met het verwijderen van de cartridge uit de verpakking, waarbij de beschermende tape over de printercontacten en de printkop moet blijven zitten. Stabiliseer de behuizing van de cartridge met een klem, waarbij de groene bovenkant vrij moet blijven van obstakels, en gebruik een handmatige roterende snijmachine.Snijd de groene bovenkant van de cartridge af, giet alle resterende inkt uit het reservoir en verwijder vervolgens de plastic beschermband die de printercontacten en de printkop bedekt. Tijdens dit proces zal er waarschijnlijk water uit de printkop lekken, maar dit zal de cartridge niet beschadigen. Wanneer het water helder is, laat u de cartridge drogen.Om een schone printomgeving te behouden, begint u hiermee door de cartridge volledig onder te dompelen in een bekerglas gevuld met gedeïoniseerd water, waarna u de cartridge 15 minuten lang soniceert. Verwijder na sonisatie de cartridge en schud het overtollige water eruit. Spray 70% ethanol in de cartridge om een sterielere omgeving te creëren.Centrifugeer na het oogsten van de gewenste cellen deze in vijf milliliter vers medium in een conische centrifugebuis van 15 milliliter gedurende vijf minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het medium en resuspendeer de cellen daarna bij 1 × 10⁵ cellen per milliliter in een vers bereide fluorescente G actine-stockoplossing. Let bij het maken van de bio-inkt op dat 250 µL bio-inkt drie dekglasjes print met het hier getoonde lijnpatroon. Nadat de printer is ingeschakeld en is opgewarmd, plaatst u het gewenste printoppervlak hier; dekglasjes van 22 millimeter bij 22 millimeter worden gebruikt in het midden van de eerder geassembleerde tafel.Open vervolgens een tekenprogramma en selecteer het gewenste patroon. Pipetteer nu ongeveer 100 tot 120 µL van de celstroom in de kleine ronde put onderaan het patrooncompartiment. Print het bestand; terwijl de printer opnieuw opwarmt, beweegt de cartridge naar de gereedpositie.Wanneer de cartridge zich iets naar links van de inktdruppelbak beweegt en daar blijft staan, trek dan aan het papieraanvoermechanisme en de draad, waarna het printen begint. De printer print op het dekglas dat in het midden van het printplatform is geplaatst, met behulp van een HP DeskJet 500-printer met een bio-inkt bestaande uit een fibroblastcellesuspensie in een G-actine-monomeeroplossing.Binnen een HP 26-serie werden inktcartridgecellen geprint op glazen microscoopdekglaasjes. Deze figuur illustreert een representatief resultaat van geprinte fibroblastcellen die geïncorporeerde fluorescerende actine-monomeren vertonen. Dit patroon werd in de vorige figuur gebruikt om een continue lijn van de printoplossing over het grootste deel van het microscoopglaasje te creëren.In deze figuur wordt de rechte lijn getoond waarin de biolink en cellen wederzijds zijn gedeponeerd. Let op dat er direct na het printen een toename van de achtergrondfluorescentie is, omdat de biolink-oplossing waarin de cellen zijn gesuspendeerd vrije overtollige fluorescerende actine-monomeren bevat; het incuberen van de cellen gedurende ongeveer 10 minuten na het printen bevordert de adhesie aan het objectglas, waardoor de overtollige monomeeroplossing met vers groeimedium van het substraat kan worden gewassen, wat de achtergrondfluorescentie aanzienlijk vermindert. Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van drie T3-fibroblasten die in een gelokaliseerde printzone zijn geprint; deze fluorescentiemicroscopische fotomicrografie van een cel, genomen 15 minuten na het printen, toont actine in het groen, de nucleus in het blauu en de overlay van zowel de G-actine als de nucleaire kleurstof.De volgende twee afbeeldingen tonen fluorescentiemicroscopie van twee fibroblasten in een lijnpatroon drie uur na het printen. Deze eerste afbeelding toont fluorescentielabelled actine-monomeren in de cellen. Deze tweede afbeelding is een overlay van het fluorescentiekanaal met de achtergrondafbeelding om aan te tonen dat, hoewel er mogelijk wat debris op de objectglasplaat in de linkerbenedenhoek aanwezig is, dit niet fluoresceert.Ten slotte wordt hier een controlegroep van niet-geprinte cellen gepresenteerd, die drie uur lang zijn geïncubeerd met fluorescentie-gelabelde monomeren, om aan te tonen dat monomeren het celmembraan niet kunnen penetreren zonder membraanpermeabilisatie door celprinten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om meerdere cartridges gereinigd en klaar voor gebruik te hebben, aangezien het verstoppen van de printer een van de problemen is die deze techniek vertragen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een standaard desktopprinter kan worden omgebouwd om levende cellen te printen, wat helpt bij het creëren van een tijdelijke membraankracht.

creating-transient-cell-membrane-pores-using-a-standard-inkjet-printer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af.  We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd.  Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

De in dit document beschreven methoden zien hoe je een commerciële inkjet printer omzetten in een bioprinter met gelijktijdige UV-polymerisatie. De printer is geschikt voor het construeren van 3D-weefselstructuur met cellen en biomaterialen. De studie hier toonde construeerde een 3D neocartilage.

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier wordt een milde 3D-printtechniek gepresenteerd die wordt aangedreven door afwisselend viskeuze-traagheidskrachten om de constructie van hydrogel-microdragers mogelijk te maken. Zelfgemaakte nozzles bieden flexibiliteit, waardoor eenvoudige vervanging voor verschillende materialen en diameters mogelijk is. Celbindende microdragers met een diameter van 50-500 μm kunnen worden verkregen en verzameld voor verdere kweek.

3D-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

Dit artikel biedt een techniek voor het vervaardigen van op chips gebaseerde supercondensatoren met behulp van een inkjetprinter. Methodologieën worden in detail beschreven om inkten te synthetiseren, softwareparameters aan te passen en de elektrochemische resultaten van de gefabriceerde supercondensator te analyseren.

Uitgebreide controle van inkjetprinter voor fabricage van chipgebaseerde supercondensatoren

Leer hoe je een standaard inkjetprinter omzet tot een bioprinter voor het creëren van voorbijgaande celmembraanporiën. Deze methode maakt opname van fluorescerende G-actine in levende cellen mogelijk.

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Meer video's verkennen