Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Het algemene doel van deze procedure is om voorbijgaande poriën in celmembranen te creëren met behulp van inkjet-printen. Dit wordt bereikt door eerst een standaard inkjetprinter aan te passen. De tweede stap is om een voorraad inktcartridge te legen en schoon te maken om de invoeging van de bio-ink mogelijk te maken.

Vervolgens worden de cellen van belang gesuspendeerd in een oplossing van fluorescent gelabelde acton-monomeren en PBS om de bio-ink oplossing te creëren. De laatste stap is het afdrukken van de bio-ink op microscoopglaasjes met behulp van de aangepaste printer en cartridge. Uiteindelijk kan fluorescente microscopie worden gebruikt om aan te tonen dat de Fluor vier geconjugeerde G-actin monomeren door de bedrukte cellen zijn geïnternaliseerd via voorbijgaande membraanporiën.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard transfectie- en celmicro-injectietechnieken is dat deze printtechniek gemakkelijk te gebruiken is en een hoge celviabiliteit oplevert. Hoewel deze techniek inzicht kan geven in genetica, kan deze ook worden toegepast op andere studievelden zoals celbiofysica en weefselengineering in celbiofysica. Deze techniek kan worden gebruikt om het cytoskelet van een cel gemakkelijk te bekijken tijdens celmigratie.

We kregen het idee voor deze methode toen we veranderingen in de cytoskeletopstelling als gevolg van toegepaste krachten op cellen wilden visualiseren. Begin met het ontgrendelen van de plastic clips van de onderkant van de printer en til vervolgens langzaam de bovenste plastic behuizing op. Ontkoppel vervolgens het knopdisplaylichtpaneel van de bovenkant van de printer, waarbij het verbonden blijft met de moederbord van de printer.

Gebruik Kim-doekjes en ethanol. Reinig de binnenkant van de printer, vooral de gebieden waar de inktcartridge rust en waar wordt afgedrukt. Zoek vervolgens de kabel die stroom levert aan de papiervoermechanismen voor de HP Desk Jet 500.

Ze bevinden zich net onder de papierlade aan de linkerkant van de voorkant en ontkoppel de kabels van de moederbord. Zoek nu het papierdetectiemechanisme en bevestig een draadlus aan de grijze plastic hendel boven en achter het papiervoermechanisme om als handmatige handgreep te dienen, plaats een podium hier. De schuimverpakking voor 15 centrifugebuizen wordt gebruikt met verschillende microscoopglaasjes die op hun plaats zijn vastgeplakt in het printgebied voor de papiervoermechanisme om de gewenste printglaasjes naar een niveau net onder de cartridge printkop te brengen.

Ten slotte, om een aseptische techniek te behouden, plaats de printer in een laminaire stroomkap. Begin met het verwijderen van de cartridge uit de verpakking, waarbij het beschermende plakband de printercontacten en de printkop bedekt. Stabiliseer het lichaam van de cartridge met een klem en laat de groene bovenkant vrij van enig obstakel met behulp van een handbediend rotatief snijgereedschap.

Snij de groene bovenkant van de cartridge, maak eventueel resterende inkt uit de reservoir leeg en verwijder vervolgens het plastic beschermende plakband dat de printercontacten en de printkop bedekt. Het water zal waarschijnlijk uit de printkop lekken tijdens dit proces, maar het zal geen schade aan de cartridge veroorzaken. Wanneer het water helder loopt, laat de cartridge drogen.

Om een schone printomgeving te behouden, begint u door de cartridge volledig onder te dompelen in een beker vol gedeïoniseerd water en soniceer vervolgens de cartridge gedurende 15 minuten. Verwijder na sonicatie de cartridge en schud het overtollige water eruit. Spuit 70% ethanol in de cartridge om een meer aseptische omgeving te creëren.

Na het verzamelen van de cellen van belang, centrifugeert u de cellen in vijf milliliter vers medium in een 15 milliliter conische centrifugeerbuis gedurende vijf minuten bij 250 keer G bij kamertemperatuur. Aspirant de volgende stap het medium en resuspendeer vervolgens de cellen bij eenmaal 10 tot de vijfde cellen per milliliter in vers bereide fluorescente G-actin stockoplossing Om bio-ink te creëren, merk op dat 250 microliter bio-ink drie dekglasjes met het lijnpatroon hier getoond afdrukt. Nadat de printer is ingeschakeld en opgewarmd, plaatst u hier het gewenste printoppervlak, dekglasjes van 22 millimeter bij 22 millimeter worden gebruikt op het midden van de eerder geassembleerde fase.

Open vervolgens een tekstverwerkingsprogramma en selecteer het gewenste patroon. Pipetteer nu ongeveer 100 tot 120 microliter van de celsuspensie in het kleine ronde putje aan de onderkant van het cartridgecompartiment. Druk het bestand af terwijl de printer weer opwarmt, de cartridge zal naar de gereedpositie bewegen.

Wanneer de cartridge iets naar links van het inktvlekje beweegt en daar blijft. Trek aan het papiervoermechanisme, bedrading en afdrukken beginnen. De printer drukt af op het dekglas geplaatst in het midden van de printfase met behulp van een HP desk jet 500-printer met een bio-ink bestaande uit een fibroblastcelsuspensie in een G-actin monomeroplossing.

Binnen een HP 26-serie werden inktcartridgecellen op glazen microscoopdekglasjes afgedrukt. Deze figuur illustreert een representatief resultaat van afgedrukte fibroblastcellen die geïncorporeerde fluorescente actine-monomeren laten zien. Dit patroon werd gebruikt in de vorige figuur om een continue lijn van de printoplossing over het grootste deel van het microscoopglas te creëren.

In deze figuur wordt de rechte lijn getoond waarin de biolink en cellen wederzijds zijn gedeponeerd. Merk op dat direct na het afdrukken er een toename van achtergrondfluorescentie is omdat de biolinkoplossing waarin de cellen zijn gesuspendeerd vrije overtollige fluorescente actine-monomeren bevat. Het incuberen van de cellen gedurende ongeveer 10 minuten na het afdrukken vergemakkelijkt de hechting aan het glas, waardoor overtollige monomeroplossing van het substraat kan worden gewassen met vers groeimedium, wat de achtergrondfluorescentie aanzienlijk vermindert. Hier, een representatief beeld van drie T3-fibroblasten afgedrukt in een lokale printzone, zoals getoond, deze fluorescente microscoopfotomicrografie van een cel genomen 15 minuten na het afdrukken toont giin in groen, de kern in blauw en de overlay van zowel de GI-actine als de