Name: Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer cytotoxische CD8 T-celactiviteit meten via impedantiegebaseerde assay en vergelijk deze met de Chromium Release Assay. Deze methode biedt real-time, labelvrije monitoring met hogere gevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Keith L. Knutson van de Susan G. Komen for the Cure Foundation en NIH / NCI 9R01 CA152045 en P50-CA116201.

1. Generatie van korte termijn Menselijke Antigeen-specifieke CD8 T cel lijnen 7 <ol><li> Afzonderlijke perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit bloed van normale gezonde HLA-A2 positieve donoren middels Ficoll-Paque plus. </li><li> Voeg 2 ml / putje van PBMC op 6-putjes platen bij 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377 peptide (aminozuursequentie KIFGSLAFL) of HLA-A2-bindende influenza p58-66 peptide (GILGFVFTL) direct aan de putjes bij een eindconcentratie van 10 ug / ml en plaats in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Te helpen stimuleren en vergroten T-cellen, voeg, om de 2 dagen, 250 pl / putje vers medium aangevuld met humaan recombinant IL-2 (voorraad: 50 eenheden / pl) tot een eindconcentratie van 50 eenheden / ml in het kweekmedium bereiken. </li><li> Opnieuw stimuleren van de kweekcellen met 2 x 10 6 cellen / ml bestraalde autologe PBMC gepulst gedurende 2 uur met 10 ug / ml van dezelfde peptiden gebruikend in stap 1.3 en voeg deze cellen te kweken bij 1 ml / putje een week na de eerste peptide stimulatie. </li><li> Voeg menselijke recombinant IL-2 en vers medium, zoals beschreven in stap 1.4, in de bestaande culturen elke 2 dagen. </li><li> Opnieuw stimuleren van de cellen met peptide en bestraalde autologe PBMC zoals beschreven in stap 1.5 een week na de tweede peptide stimulatie. </li><li> Bereid cellen gebruiken zes dagen na de laatste herstimulatie op zijn vroegst. </li></ol> 2. Voorbereiding van borstkankercellen <ol><li> Plaats de xCELLigence impedantie meetstation (xCELLigence station) in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Harvest humane tumorcellen (SKBR3, BT20, MCF7 of HCC1419) die 75% confluent met 0,25% trypsine en centrifugatie (1000 rpm gedurende 5 minuten). </li><li> Telling tumorcellen met behulp van een hemocytometer en ze langs tumor RPMI medium (aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 500 eenheden / mlIFN-gamma) in een concentratie van 7,5 x 10 3 tumor cells/100 pl. </li><li> Programma de xCELLigence software door het opzetten van de lay-out pagina om goed layout te bepalen en door het opzetten van het schema pagina naar impedantie metingen te nemen om de 5 minuten gedurende een periode van 40 uur. Voor de eerste 18 uur wordt de xCELLigence netimpedanties lezingen van alleen de tumorcellen nemen. </li><li> Voeg 100 ul van RPMI medium om de tumor xCELLigence E-borden en een achtergrondsynchronisatie lezing door het meten impedantie in afwezigheid van cellen. </li><li> Voeg tumorcellen aan de E-platen bij 100 ul per putje en plaats in de xCELLigence station. </li><li> Druk op de startknop van de xCELLigence software om te beginnen met het nemen van impedantie metingen van de tumorcellen, die onmiddellijk beginnen met vast te houden aan de E-platen. </li></ol> 3. Co-cultuur van de Tumor met CD8-T-cellen <ol><li> Nadat de tumorcellen 4 x 10 tumorcellen per putje (onge hebben gehecht en verdubbeld tot 1,5veer 18 uur na aanvankelijk zijn verguld), oogst T-cellen bereid in afdeling 1 door zachte schrapen en agitatie </li><li> Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en tel T-cellen met een hemocytometer en ze langs RPMI medium met 10% FBS bij verschillende verhoudingen, vanaf een maximale verhouding van 1 tumorcel 40 T-cellen en verdun 2-voudig tot een verhouding van 1 tumorcel 1,25 T-cellen wordt bereikt. Zo zijn er 1,5 x 10 4 tumorcellen per putje. Een 01:40-verhouding te bereiken, voeg 6 x 10 5 T-cellen per putje en verdun de T-cellen 2-voudig tot een verhouding van 1,5 x 10 4 tumorcellen tot 1,875 x 10 4 T-cellen per putje (1:1,25 verhouding) wordt bereikt. </li><li> Pauzeren xCELLigence station en verwijder de e-plaat. </li><li> Verwijder het medium in de putjes met een pipet en voeg 200 ul alleen media of de geschikte verhouding van T-cellen aan de putjes. </li><li> Plaats de E-plaat terug in de xCELLigence station en blijven de xCELLigence software program dus impedantie metingen worden elke 5 minuten voor ongeveer 20 uur na de T-cel toevoeging genomen. </li><li> Normaliseren van de resultaten aan het einde van de assay. </li></ol> 4. Chroom release Assay (CRA) 7 <ol><li> Volg institutionele straling veiligheidsprocedures bij het ​​werken met 51 Cr en 51 Cr-gelabelde doelcellen. Gebruik altijd de juiste afscherming om blootstelling aan straling te verminderen. </li><li> Pulse tumorcellen gedurende 2 uur bij 1 x 10 6 tumorcellen / ml met 10 ul / ml vers 51 Cr (0.005 Ci / ml). </li><li> Wassen tumorcellen in 10 ml RPMI medium met 10% FBS en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Voeg tumorcellen een 96-well rondbodem plaat bij 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul / well. </li><li> Do cellen bij verschillende verhoudingen van 1 af tumorcel 40 T-cellen en verdun 2-voudig tot een verhouding van 1 tumorcel 1,25 T-cellen wordt bereikt. Zo zijn er 1 x 10 5 tumorcellen<html> per putje. Een 01:40 verhouding te, voeg 4 x 10 6 T cellen per well en verdun de T-cellen 2-voudig tot een verhouding van 1 x 10 5 tumorcellen tot 1,25 x 10 5 T-cellen per putje (1:1,25 verhouding) wordt bereikt. </li><li> Voeg spontane en maximale tumorcel controles aan de plaat. Om de spontane afgifte van 51 Cr berekenen van de tumorcellen, voeg zes putjes die elk 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul tot 100 ul van RPMI medium met 10% FBS. Om maximale afgifte van 51Cr berekenen van de tumorcellen, voeg zes putjes die elk 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul tot 100 ul 0,1% Triton X-100 in PBS, waarin alle cellen lyseert. </li><li> Incubeer de platen gedurende 5 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Na incubatie, verwijder 50 ul van de supernatant uit elk putje en voeg deze toe aan een Luma plaat. </li><li> Droog de platen gedurende de nacht en meet met behulp van een CPM Gamma Counter. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Percent Lysis Berekening <ol><li> Impedantie test: Neem de impedantie lezen, gerapporteerd als de cel index (CI), op verschillende tijdstippen en gebruik de volgende formule om procent lysis bepalen: (CI tumor alleen - (CI tumor + T-cellen)) / (CI alleen tumor) * 100. </li><li> CRA: Gebruik de volgende formule om procent lysis te bepalen: (CPM experimenteel - CPM spontaan) / (CPM maximaal - CPM spontane) * 100. </li></ol> 6. Representatieve resultaten T-cellen alleen niet verhogen impedantie T-cellen, in het algemeen, zich niet houdt aan de meeste vaste oppervlakken en geen hechting voor activering en proliferatie niet nodig. Derhalve werd verondersteld dat T-cellen niet bijdraagt ​​aan de impedantie xCELLigence E-platen. Om dit te testen, werden putten geladen met ofwel SKBR3 borstkankercellen of vers gezuiverde humane CD8 T-cellen. Impedantie werd gemeten in de loop van 40 uur en een representatief voorbeeld demonstreizigers wezen weinig effect van T-cellen is getoond in figuur 1A. In tegenstelling, zou men kunnen stellen dat de T-cellen achtergrond impedantie kan afnemen, zij het slechts licht. Desondanks co-cultuur bleek dat het toevoegen van T-cellen op 18 uur na de start van impedantiemetingen resulteerde in een impedantie ontwrichting (Figuur 1B). Andere studies toonden aan dat verstoringen waren mede het hanteren omdat de vermindering van signaal kan worden verminderd door ervoor te zorgen dat de temperatuur van de T-cel-bevattende oplossing werd hetzelfde als het interieur van de incubator. Verlagingen van de impedantie gemedieerd door T-cellen zijn dosis-afhankelijk. Het nut van een impedantie-gebaseerde test monsters Vergelijk cytotoxische T cel activiteit vereist het onderscheiden tussen verschillende concentraties van antigen-specifieke T-cellen. Om te testen of dit mogelijk is, SKBR3 cellen werden samen gekweekt met verschillende concentratiesties van T-cellen afkomstig van een HER-2/neu p369-specifieke T-cellijn. Zoals getoond in figuur 2A, vermindering impedantie waren afhankelijk van de dosis van T-cellen. Figuur 2B toont dat de celindices op 10 uur volgen een eenvoudige tweede orde polynoom over het bereik van T-cellen. Dus de xCELLigence station bewaakt CD8 T cel gemedieerde dood van SKBR3 tumoren in real time als een daling celindex. De impedantie gebaseerde assay detecteert antigeen-specifieke T-cellen Om te bepalen of vermindering impedantie van SKBR3, een HER-2/neu en HLA-A2 positieve borsttumor cellijn, met HER-2/neu p369-specifieke T cellen antigen specifieke afzonderlijke putjes bevattende SKBR3 werden geïncubeerd met T cellen afkomstig van een influenza (FLU)-specifieke T-cellijn. De FLU-specifieke T-cellen dienden als een niet-specifieke controle, die HLA-A2 positief, maar niet met een vermogen HER-2/neu te herkennen. Zoals weergegeven in Fi-guur 3, is er een significant verschil tussen de lytische activiteit van HER-2/neu p369-specifieke T-cellen in vergelijking met FLU-specifieke T-cellen (p &lt;0,0001). In sommige gevallen, T-cellen niet specifiek zijn voor tumor (bijv. FLU-specifieke of anti-CD3/anti-CD28 gestimuleerde) toonde een lage lytische activiteit (Figuren 3A-B). T-cellen kunnen doden op twee manieren, hetzij niet-specifiek door Fas: Fas ligand interacties of antigeen-specifiek door het vrijkomen van granzymen en perforins. Om verder te bevestigen het idee dat HER-2/neu-specific T-cellen werden gedood in een antigeen-specifieke manier, we opgenomen een blokkerend antilichaam tegen Fas-ligand. Zoals getoond in fig. 3B, heeft het antilichaam niet de lytische activiteit van het HER-2/neu p369-specifieke T-cellen te verminderen. Het antilichaam kan wisselwerkingen tussen Fas en Fas Ligand, zoals aangetoond met T-cellen die waren niet-specifiek geactiveerd met anti-CD3/CD28 kralen remmen. Deze resultaten suggereren dat, wanneertumor-specifieke T-cellen worden getest met niet-tumor-specifieke T-cellen kunnen Fas ligand blokkade vereist om niet-TCR gemedieerde interacties tot een minimum. Als alternatief, bij gebruik op korte termijn gekweekte T-cellijnen waarin slechts een fractie van de T-cellen specifiek voor het antigeen voor ex vivo generatie, zou de mogelijkheid van MHC mismatch-gemedieerde T cel activatie raken en daardoor niet-specifieke lysis. In dit geval kan de toevoeging van antilichamen die de irrelevante HLAs blokkeren gerechtvaardigd. Om te bepalen of de p369-specifieke T-cellen doden van tumorcellen in een HLA klasse I afhankelijke wijze, hetzij anti-HLA-klasse I antilichaam of isotype controle antilichaam werden aan het co-culturen. Zoals getoond in figuur 3C, lysis door p369-specifieke T-cellen werd onderdrukt door toevoeging van antilichaam aantonen HLA klasse I restrictie. Tenslotte, aangezien de ontwikkeling van deze assay grotendeels uitgevoerd met SKBR3 was het belangrijk vast te stellen of andere hechtende HLA-A2 en HER-2/neu tot expressie tumorcellen konden worden gedood door p369-specifieke T-cellen. Zo werden T-cellen bereid en toegevoegd in een 01:05 verhouding van de HLA-A2 en HER-2/neu-expressing tumorcellen SKBR3, MCF-7 en HCC1419 cellen. De HLA-A2 negatieve tumor cellijn, BT20 werd gebruikt als een negatieve controle. Zoals getoond in figuur 3D, al deze extra tumorcellen behalve BT20 werden gedood zoals beoordeeld door impedantie. Aldus wordt de werkwijze bruikbaar voor meerdere doel hechtende tumorcellen zijn. De impedantie-gebaseerde test is gevoeliger dan de standaard chromium-afgifte assay detectie cytotoxische T-celactiviteit Het chroom (51 Cr) afgifte test (CRA) dat cytolytische activiteit meet is al lange tijd de gouden standaard voor het CD8 T-cel responsen te controleren. In deze assay worden doelwitcellen (bijv. tumorcellen) gelabeld met 51Cr. In de meeste gevallen kan gezonde doelcellen de meeste behoudenradiolabel in de loop van de test. CD8 T-cellen worden toegevoegd aan de doelcellen, gewoonlijk bij variërende concentraties, en het doden van de doelwitcellen wordt gedetecteerd door de afgifte van 51Cr in het medium. Afgezien van het feit dat het gebruikt gevaarlijke straling, twee grote problemen de CRA een gebrek aan gevoeligheid en de test vereist normaliter grote hoeveelheden CD8 T-cellen beperkt de bruikbaarheid. Om te bepalen of de impedantie gebaseerde assay gevoeliger was dan de CRA, HER-2/neu p369-specifieke T-cellen werden in vitro gegenereerd en toegepast, in verschillende hoeveelheden, ofwel E-platen met gemerkte tumorcellen of standaard polypropyleen platen die 51 Cr-gemerkte doelcellen. Metingen, hetzij impedantie of gratis chroom, werden gemeten bij 5 uur na T cel toevoeging. Figuur 4, een representatief voorbeeld, toont de impedantie test beter presteert dan de chroom release. De intra-assay variatievan de impedantie gebaseerde assay meestal onder 20%. Intra-assay variatie onderzocht, aangezien toenemende gebruik van deze assay wordt grotendeels bepaald door de reproduceerbaar en variatie (figuur 5). Twee p369-specifieke T-cellijnen werden onafhankelijk 30 dagen apart gegenereerd en in drievoud toegevoegd over een reeks tumorcel T cel verhoudingen. De inzet grafiek in figuur 5 laat zien dat de lijnen waren grotendeels gelijkwaardig qua lyseren SKBR3 cellen. De variatiecoëfficiënt% is berekend op het moment celverhouding en uitgezet. Zoals getoond in figuur 5, 1:40-01:05 ratio% de variatiecoëfficiënten (CV) was dan 15%. Op 1:2,5 en 1:1,25, maar de CV kon hoog of onvoorspelbaar. Door uitgebreide biologische variatie is het niet mogelijk om inter-assay variatie meten primaire T cellijnen. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Impedantie moet worden genormaliseerd na toevoeging van de T-cellen. Paneel A: toont aan dat tumorcellen (rode lijn) en geen T-cellen (blauwe lijn) zijn verantwoordelijk voor de impedantie. Getoond zijn de impedantie traces meer dan 40 uur voor of tumor of T-cellen alleen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen uit een tweede experiment. Merk op dat het signaal verstoring ongeveer 20 uur vertegenwoordigt het punt van toevoeging van T-cellen in de putjes zonder tumorcellen Paneel B:. Blijkt dat impedantiemetingen tijdelijk verstoord met de toevoeging van T-cellen om tumorcellen. Dit vereist normalisering op een tijdstip na toevoeging van T-cellen (zie bijzondere normalisatie gemarkeerd grafiek). Sporen zijn samengesteld uit dubbele gegevens punten. Het trace voor de tumorcellen alleen wordt getoond in het rood. De andere sporen vormen tumorcellen samen gekweekt met HER-2/neu p369-specifieke T-cellen (blauw: verhouding van 1,25 T cellen / tumorcel Green:verhouding van 40 T cellen / tumorcel). Elk spoor wordt berekend uit dubbele datapunten elke 5 minuten verzameld via de duur van de kweek. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Vermindering impedantie gemedieerd door T-cellen is dosisafhankelijk. Paneel A: Getoond zijn de impedantie sporen van SKBR3 tumorcellen alleen of met verschillende concentraties van tumor-specifieke T-cellen geïncubeerd. Elk spoor wordt berekend uit drievoudige datapunten elke 5 minuten verzameld via de duur van de kweek. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten Paneel B:. Getoond zijn celindices op 10 uur voor alle T cel / tumorcel-concentraties. De stippellijn geeft de cel index voor tumorcellen al.een. Elk symbool is de gemiddelde (± SEM) van drievoudige bepalingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. De impedantie gebaseerde assay detecteert antigeen-specifieke cytotoxische T-cel responsen. Panel A toont de mate van lysis van SKBR3 cellen door HER-2/neu p369-specifieke T-cellen (rood) en FLU-specifieke T-cellen (blauw) en 5, 10 en 15 uur na de co-cultuur. Elk gegevenspunt is het gemiddelde (± SEM) van drievoudige metingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Paneel B toont lysis van SKBR3 door p369-specifieke T-cellen of niet-specifiek geactiveerde T-cellen, hetgeen aantoont dat antigeen-specifieke lysis niet door Fas Fas-ligand interacties. Zwarte balken vertegenwoordigen co-culturen diebevatte een Fas ligand antilichaam. Elke balk is de gemiddelde (± SEM) lysis in drievoud 5 uur na toevoeging van T-cellen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Paneel C toont lysis 10 uur na toevoeging van T-cel SKBR3 door p369-specifieke T cellen HLA-klasse I afhankelijk. Ofwel HLA-klasse I blokkeringen of isotypecontrole werd tijdens co-cultuur toegevoegd. Elke bar is de gemiddelde (± SEM) lysis in drievoud. Dit experiment werd twee keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Paneel D toont% lysis 10 uur na T cel toevoeging van verscheidene HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellijnen door p369-specifieke T-cellen. BT20, werd een HLA-A2-negatieve borstkanker cellijn gebruikt als een negatieve controle. Elke plek is een uniek experiment berekend uit triplobepalingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figuur 4&quot; /&gt; Figuur 4. De impedantie gebaseerde test is gevoeliger dan het chromium afgifte assay voor de detectie van tumor antigen-specifieke T-cellen. Vermeld zijn% lysis van SKBR3 in reactie op variërende concentraties p369-specifieke T-cellen zoals gemeten 5 uur na tumor en T- mixen met zowel de impedantie gebaseerde assay en chromium-afgifte assay. Elk symbool is de gemiddelde (± SEM) van de drie herhalingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig5.jpg" alt="Figuur 5"/> Figuur 5. % Intra-assay coëfficiënt van variatie van de impedantie gebaseerde T cel cytotoxiciteit assay. Vermeld zijn gemiddelden (± SD)% intra-assay coëfficiënt van variatie in lysis van SKBR3 over een bereik van concentraties van antigeen-specifieke T cellen. Elk symbool is het gemiddelde van drie herhalingen. Cijfers aangegeven in de grafiek zijn thij bedoelt% CV. Inzet paneel toont de gemiddelde (± SEM, n = 3)% lysis van SKBR3, bij variërende concentraties van p369-377-specifieke T-cellen. Twee onafhankelijk gegenereerde p369-specifieke T-cellijnen met T-cellen van twee verschillende donoren zijn getoond.

<ol><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li>
<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li>
<li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li>
<li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li>
<li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+a+HER-2%2Fneu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2%2Fneu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li>
<li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta%2FTNF%28alpha%29-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li>
<li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li>
<li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang van deze video-artikel wordt gesponsord door Roche Diagnostics.

CD8 T cellen zijn belangrijk voor de adaptieve immuunrespons kunnen direct doden geïnfecteerde of kwaadaardige cellen 4. Hoewel er verschillende manieren om het aantal antigeen-specifieke CD8 T-cellen (bijv. ELIspot, tetrameer, flowcytometrie) te meten, is het vaak nuttig om te weten of deze cellen functioneel cytotoxisch 3. De meest herkenbare assay voor de beoordeling cytotoxische functie de CRA, die wordt beschouwd als de gouden standaard test 4. Belangrijke beperkingen van de CRA zijn (1) het vereiste van radioactiviteit, (2) het gebrek aan gevoeligheid, (3) het ontbreken van mechanistische informatie (4) vereiste grote hoeveelheden cellen, en (5) moeizaam set up. Zo is de afgelopen tien jaar, is er belangstelling voor de vaststelling van nieuwe strategieën om deze beperkingen te minimaliseren. Nieuwere benaderingen omvatten die die maatregel caspase versie 4, BLT esterase activity5, en oppervlakte-expressie van CD107 6. De huidige manuscript suggereert datde impedantie-gebaseerde test, uitgevoerd op het Roche xCELLigence systeem kan ook nuttig zijn als alternatief voor de CRA. De mogelijkheid om de impedantie-gebaseerde benadering passen berust op de waarneming dat T-cellen die niet goed kan hechten aan oppervlakken, lijken niet veel invloed hebben op de impedantie dus zwakker wordt zorg van directe interferentie van de T-cellen met de meting. De arbeid die nodig is voor het gebruik van de impedantie bepalingssysteem verwachting aanzienlijk minder hoofdzakelijk te wijten aan de verwijdering van het regulerende bezorgdheid over het gebruik van radioactiviteit. Het enige opvallende nadeel van de impedantie-gebaseerd systeem is dat een uitgave van $ 50.000 tot $ 60.000 is nodig voor de aankoop van de xCELLigence eenheid. De xCELLigence unit elimineert de noodzaak van een straling teller en is veelzijdiger, die nuttig is om cellulaire respons op drugs en ​​migratie naast T-cel cytotoxiciteit 8. De waarnemingen diede vermindering van tumorcel impedantie is dosisafhankelijk, zoals weergegeven in figuur 2, met een redelijk steile helling op een eenvoudig tweede kwadratische functie stelt de assay kan worden gebruikt in assays beperkende verdunning (LDA) de frequentie van cytotoxische cellen 9 schatten . Een voordeel van de impedantie-gebaseerde benadering is dat het aantal T-cellen en tumorcellen minder is dan de CRA, waardoor LDA potentieel haalbaar. Bijvoorbeeld, in de CRA, een 01:40 verhouding, 1 x 10 5 tumorcellen per putje van verchroomd welke 4 x 10 6 totale T-cellen per putje vereist. In de impedantie gebaseerde assay slechts 1,5 x 10 4 tumorcellen per well nodig, die slechts 6 x 10 5 totale T-cellen per putje verbruikt. Zo de impedantie-gebaseerde test gebruikt 85% minder T-cellen en tumorcellen. Deze verlaging suggereert dat de impedantie-systeem kan worden aangepast om immunologische bewaking in klinische proeven waarbij tHij volumes bloedafname kan worden beperkt. Ook, terwijl de CRA is beperkt tot een tijdstip, de impedantie gebaseerde bepaling verzamelt continu real-time data, waardoor de gebruiker meerdere lysis tijdstippen vergelijken op hetzelfde experiment met minimale extra arbeid en cellen. Frequentie berekeningen zou kunnen worden gecombineerd met andere strategieën die niet meten functioneren zoals tetrameer analyse de verhouding van functionele cytotoxische T-cellen vast aan totale antigeen-specifieke CD8 + T-cellen 10. Een van de meest aantrekkelijke eigenschappen van de impedantie-gebaseerde benadering is dat, in tegenstelling tot andere assays cytotoxiciteit kan worden gevolgd in real time mogelijk waardoor het makkelijker om cellulaire interacties met het gebruik van remmers of antilichamen bestuderen. Een ander is dat de methode geschikt is voor tumorcellen labeling kan weerstaan. Tenslotte, aangezien de niet gedode tumorcellen niet gelabeld en steriel blijven verdere oogst en onderzoek van de T-cel-resistente cellen possible. Samengevat, terwijl beide systemen tumor doden data in antwoord op specifieke T-cellen, de impedantie-gebaseerde test is gevoeliger dan de CRA en een meer flexibel platform.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Gebruikt om PBMC's uit bloed te isoleren </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Celkweekmedium </td></tr><tr><td>FBS </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Celkweekmedium </td></tr><tr><td>Human IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>Voor het stimuleren van de groei van T-cellen </td></tr><tr><td>Human Interferon gamma </td><td>Cell Sciences</td><td>CR2026</td><td>Voor het stimuleren van MHC-expressie in tumorcellen </td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377 peptide </td><td>Mayo Clinic peptide synthesis core</td><td>amino acid sequence KIFGSLAFL</td><td>Bindt aan HLA-A2 </td></tr><tr><td>Influenza p58-66 peptide </td><td>Mayo Clinic peptide synthesis core</td><td>amino acid sequence GILGFVFTL</td><td>Bindt aan HLA-A2 </td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Voor aspecifieke T-celactivatie en expansie </td></tr><tr><td>Chromium-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA-labelingsreagens </td></tr><tr><td>E-plate </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td>Voor xCelligence impedantie-unit </td></tr><tr><td>Luma plate 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Voor het meten van radioactiviteit in de Top Count NXT. </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP Station </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>Impedantie-unit </td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Scintillatie- &amp; luminescentieteller </td></tr><tr><td>Fas Ligand antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Voor het blokkeren van Fas-Fas ligand-interacties</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>Voor het blokkeren van HLA klasse I</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>Isotypecontrole voor HLA klasse I</td></tr><tr><td>SKBR3 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Adenocarcinoom</td></tr><tr><td>MCF7 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Adenocarcinoom</td></tr><tr><td>HCC1419 tumor line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Primair ductaal carcinoom</td></tr><tr><td>BT20 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Carcinoom</td></tr></tbody></table>

het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens her2neu specifieke cd8 t cellen door vergelijking van de cr51 afgifte test aan de xcelligence system

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxische CD8 T-cellen vormen een subgroep van T-cellen die in staat zijn tot het induceren de dood van geïnfecteerde of kwaadaardige gastheercellen 1. Deze cellen brengen een speciale receptor, genaamd de T-celreceptor (TCR), die een specifieke antigene peptide gebonden aan HLA klasse I moleculen 2 kan herkennen. Betrokkenheid van geïnfecteerde cellen of tumorcellen door hun HLA klasse I molecule resulteert in productie van lytische moleculen zoals granzymen en perforin resulteert in target celdood. Hoewel het nuttig om frequenties van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen met assays zoals de ELIspot of flowcytometrie bepalen is ook nuttig om de sterkte van CD8 T celresponsen cytotoxiciteitstests 3 bepalen. De meest herkenbare assay voor de beoordeling cytotoxische functie is Chromium-afgifte assay (CRA), die als standaard test 4. Het RB heeft verschillende beperkingen, waaronder blootstelling van cellen aan gammastraling, lack reproduceerbaarheid en een vereiste voor grote aantallen cellen. In het afgelopen decennium is er belangstelling voor de vaststelling van nieuwe strategieën om deze beperkingen te overwinnen. Nieuwere benaderingen omvatten die die maatregel caspase versie 4, BLT esterase activiteit 5 en oppervlakte-expressie van CD107 6. De impedantie gebaseerde assay, met de Roche xCELLigence systeem, werd onderzocht in dit document voor zijn potentieel als een alternatief voor de CRA. Impedantie of verzet tegen een elektrische stroom ontstaat wanneer hechtende tumorcellen binden aan elektrode platen. Tumorcellen los na doden en elektrische impedantie verminderd kan worden gemeten door de xCELLigence systeem. De mogelijkheid om de impedantie benadering aan cel-gemedieerde doding beoordelen berust op de waarneming dat T-cellen niet goed hechten aan de meeste oppervlakken en lijken niet veel invloed op de impedantie dus zwakker wordt zorg van directe interferentie van de T-cellen metde meting. Resultaten tonen aan dat de impedantie gebaseerde assay kan detecteren veranderingen in de niveaus van antigeen-specifieke cytotoxische CD8 T-cellen met verhoogde gevoeligheid ten opzichte van de standaard CRA. Gebaseerd op deze resultaten, kan impedantie-gebaseerde benaderingen goede alternatieven voor RB of andere benaderingen die gericht zijn op cytotoxische CD8 T-cel functies te meten.

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

Cytotoxische CD8 T-cellen vormen een subgroep van T-cellen die in staat zijn de dood van geïnfecteerde of maligne gastheercellen te induceren1. Deze cellen brengen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cytotoxische T-celactiviteit te bepalen door een impedantiegebaseerde benadering met behulp van het EXOGEN-systeem te vergelijken met de chroomvrijgave-assay. De eerste stap wordt bereikt door perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed te scheiden met behulp van fial. Vervolgens worden de PBMC aan de wells toegevoegd samen met peptide-antigeen, menselijk recombinant IL 2 en bestraalde PBMC om antigeen-specifieke CD 8 T-cellen te creëren.De antigeenspecifieke CD8 T-cellen worden vervolgens in beide assays gecultiveerd met tumorcellen om tumorceldood te induceren. De resultaten tonen het percentage lyse van tumorcellen aan met behulp van zowel de impedantiemethode als de chroomvrijgave-assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de chroomvrijgave-assay, is dat het impedantiegebaseerde systeem real-time gegevens verzamelt en minder cellen vereist die bovendien geen labeling nodig hebben. Voor dit protocol wordt bloed van gezonde HLA-A2-positieve donoren gebruikt als bron van PBMC's of perifere bloedmononucleaire cellen, volgens het protocol van de fabrikant.Gebruik F call PA plus om de P BMC's van het bloed te scheiden. Breng vervolgens in zeswellplaten ongeveer 4 miljoen P BMC's over in twee milliliter medium per well. Voeg aan elke well HLAA twee bindend peptide toe voor een eindconcentratie van 10 µg/mL cultuur.De cellen op om en om dagen behandelen om de stimulatie en expansie van T-cellen te bevorderen. Voeg vers medium toe, aangevuld met humaan recombinant IL-2 voor een eindconcentratie van 50 units per milliliter. Bereid na één week een cultuur van autologe pbmc voor, bestraal de cellen en pulseer ze gedurende twee uur met hetzelfde hla.Restimuleer de cultuur door 1 mL van de bestraalde autologe PBM CS toe te voegen aan elke well, met een twee-bindingspeptideconcentratie van 10 µg/mL. Voeg om de dag vers medium toe, aangevuld met IL-2. Na een verdere week restimuleer de culturen op dezelfde wijze voor een tweede maal. Na nog eens zes dagen in cultuur zijn de cellen klaar voor gebruik.Bereid het meetstation voor intelligente impedantie voor gebruik door het gedurende ten minste een uur te equilibreren op 37 °C onder 5% koolstofdioxide. Oogst 75% conflueerde menselijke tumorcellen met behulp van 0,25% trypsine en centrifugatie. Tel de tumorcellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in RPMI.Tumormedia met een concentratie van 7.500 cellen per microliter. Vervolgens stelt de Excel agent-software in het layout-venster de indeling van de wells in. Stel de schedule-pagina zo in dat er elke vijf minuten impedantiemetingen worden verricht gedurende een periode van 40 uur; gedurende de eerste 18 uur zal het Xceligent-systeem alleen impedantiemetingen van de tumorcellen uitvoeren.Voeg vervolgens 100 µL RPMI-tumormedium per put toe. Voer een achtergrondmeting uit op de EPL's door de impedantie te meten in afwezigheid van cellen. Nadat de tumorcellen zijn toegevoegd, plaatst u de platen in het station en begint u met het uitvoeren van de metingen.De tumorcellen zullen onmiddellijk beginnen te hechten aan de EPL's. Na ongeveer 18 uur incubatie zullen de tumorcellen aan de EPL's zijn gehecht en zijn toegenomen tot 15.000 tumorcellen per well. Oogst op dit moment de voorbereide T-cellen door middel van voorzichtig schrapen en een agitatiecentrifuge.Resuspendeer de T-cellen in RPMI-medium met 10% FBS en tel ze met een hemocytometer. Zodra de celdichtheid bekend is, bereidt u een tweevoudige verdunningsreeks van T-cellen voor, zodanig dat wanneer 200 µL T-cellen aan de tumorcellen worden toegevoegd, de hoogste concentratie 40 T-cellen per tumorcel is. De laatste verdunning van de reeks moet 1,25 T-cellen per tumorcel opleveren.Pauzeer het EXOGEN-station en verwijder de EPL met een pipet. Verwijder het medium uit de wells en voeg vervolgens 200 microliters T-cellen toe, waarbij alle concentraties uit de verdunningsreeks als negatieve controle worden gebruikt. Gebruik puur medium, plaats de EPL terug in het station en vervolg het programma aan het einde van de assay.Normaliseer de resultaten. Volg altijd de institutionele stralingsveiligheidsprocedures bij het werken met chroom 51 en met chroom 51 gelabelde doelcellen en gebruik de afscherming om de blootstelling aan straling te verminderen. Begin met het pulseren van tumorcellen gedurende twee uur bij 1 miljoen cellen per milliliter met 10 µL per milliliter vers chroom 51.Was vervolgens de tumorcellen in 10 milliliters RPMI-medium met 10% FBS, centrifugeer de cellen en resuspendeer ze in hetzelfde medium op een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Breng deze vervolgens over naar een 96-well plaat met ronde bodem. Voeg 100.000 tumorcellen per well toe om de spontane afgifte te bepalen.Voeg niets anders toe aan zes van deze putjes en aan zes andere putjes. Voeg 100 µL Triton X 100 toe aan alle overige putjes om de cellen te lyseren en zo de maximale vrijgave te berekenen. Voeg T-cellen toe aan de plaat met behulp van de eerder bereide verdunningsreeks.Incubeer de platen nu gedurende vijf uur en neem van elke plaat monsters van 50 µL supernatant; breng de monsters over op een luma-plaat nadat de platen gedurende de nacht in de zuurkast bij kamertemperatuur zijn gedroogd. Meet de CPM met een gammacounter voor T-cellen en SKBR3-kankercellen. De kankercellen werden gekweekt op X-intelligence-platen en de celindex werd gemeten, wat een reflectie is van de plaatimpedantie, aangezien T-cellen geen adhesie nodig hebben om te prolifereren.Hun effect op de impedantie was verwaarloosbaar gedurende een kweekperiode van 40 uur. Alleen gekweekte kankercellen vertoonden een stijgende impedantiemeting. De toevoeging van T-cellen na 18 uur doorbreekt echter deze trend.Deze gebeurtenis vereist softwarenormalisatie na de toevoeging van T-cellen en wordt verder onderzocht in het volgende experiment. Wanneer SK BR three-cellen werden gecocultiveerd met variërende concentraties T-cellen, waren reducties in impedantie zeer duidelijk afhankelijk van de dosis T-cel; gegevens werden elke vijf minuten verzameld over drie trials bij het 10-uursmerk. Celindices volgden een tweedegraads polynoom over het bereik van T-cellen, wat aangeeft dat het Exogen station CD8 T-cel-gemedieerde sterfte van SK B three-tumoren in realtime monitort als een daling in de celindex om te bepalen of reducties in impedantie van SK BR three door de T-cellen antigeenspecifiek waren.SK KBR-3-cellen werden gecultiveerd in co-cultuur met HLA-A2-positieve FLU-specifieke T-cellen die HER2-neu niet herkennen. Deze cellen vertoonden een significant lagere lytische activiteit. Om verder vast te stellen of HER2-neu-specifieke T-cellen op een antigeenspecifieke wijze doodden, werd een antilichaam tegen Fas-ligand aan de co-culturen toegevoegd. Het antilichaam reduceerde de lytische activiteit van de HER2-neu P360-9-specifieke T-cellen niet.Echter, bij T-cellen die aspecifiek waren geactiveerd met anti-CD3/CD28-beads, remde het antilichaam de lysis wel, om te bepalen of de doding plaatsvond op een HLA-klasse I-afhankelijke wijze. Er werd ofwel een anti-HLA-klasse I-antilichaam of een isotype-controleantilichaam toegevoegd aan de coculturen. De resultaten ondersteunden deze hypothese sterk.Vervolgens werden T-cellen gecokultureerd met andere kankercellen in een verhouding van één op vijf. De HLA A2-negatieve tumorcellijn BT 20 werd gebruikt als negatieve controle. De resultaten tonen aan dat de methode bruikbaar is voor meerdere doelwit-adherente tumorcellen.Cocultures van de twee nieuwe HER2-specifieke P360 9 T-cellen werden toegevoegd aan met chromium-51 gelabelde targetcellen, gevolgd door CRA-analyse. De intelligentie-assay lijkt gevoeliger om consistentie te analyseren. De intra-assay variatie werd berekend als het procentuele variatiecoëfficiënt bij elke celratio tussen 1:40 en 1:5.Dit werd gemeten onder de 15% bij de laagste celratio's. Echter was het percentage CV hoog of onvoorspelbaar. Daarnaast werd de variabiliteit van SK BR 3 T-cellyse door co-cultuur met verschillende P 360 9 specifieke T-cellijnen onderzocht.De gegevens werden met een interval van 30 dagen gegenereerd. De assays werden in triplo uitgevoerd en de resultaten waren zeer vergelijkbaar. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cytotoxische T-celactiviteit kan worden bepaald met behulp van antigeenspecifieke CD8 T-cellen en tumorcellen via een impedantiegebaseerde benadering.

determining-optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-specific-cd8-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Een zeer nauwkeurig in vitro high-throughput testsysteem werd ontwikkeld om geneesmiddelen tegen kanker te evalueren met behulp van patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's), vergelijkbaar met kankerweefsels, maar zijn ongeschikt voor in vitro high-throughput testsystemen met 96-well en 384-well platen.

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Hier presenteren we een protocol voor een antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) assay met behulp van een ADCC-bioassaykit. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van het ADCC-mechanisme en het evalueren van het therapeutisch potentieel van antilichamen in kankerimmunotherapie.

Beoordeling van antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit in kankercellen met behulp van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit Reporter Bioassay

Het huidige protocol beschrijft een experimentele workflow die de ex vivo analyse van menselijke T-celstimulatie mogelijk maakt in een allogene...

Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer cytotoxische CD8 T-celactiviteit meten via impedantiegebaseerde assay en vergelijk deze met de Chromium Release Assay. Deze methode biedt real-time, labelvrije monitoring met hogere gevoeligheid.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System (Video) | JoVE Journal

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

Meer video's verkennen