Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

Het algemene doel van het volgende experiment is om de activiteit van cytotoxische T-cellen te bepalen door een impedantiegebaseerde benadering met behulp van het EXOGEN-systeem te vergelijken met de chroomvrijgave-assay. De eerste stap wordt bereikt door perifere bloedmononucleaire cellen uit volbloed te scheiden met behulp van fial. Vervolgens worden de PBMC samen met peptide-antigeen, recombinant humaan IL 2 en bestraalde PBMC aan wells toegevoegd om antigeenspecifieke CD 8 T-cellen te creëren.

De antigeenspecifieke CD8 T-cellen worden vervolgens in beide assays gecocultuurd met tumorcellen om tumorceldood te veroorzaken. Er worden resultaten verkregen die het percentage lyse van tumorcellen tonen met behulp van zowel de impedentiemethode als de chroom-release-assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de chroom-release-assay, is dat het impedantiegebaseerde systeem realtime gegevens verzamelt en minder cellen vereist die geen labeling nodig hebben. Voor dit protocol dient bloed van gezonde HLA-A2-positieve donoren als bron voor PBMC's of perifere bloedmononucleaire cellen, volgens het protocol van de fabrikant.

Gebruik F call PA plus om de P BMC's van het bloed te scheiden. Breng vervolgens ongeveer 4 miljoen P BMC's in twee milliliter medium per put over naar zesputjesplaten. Voeg aan elke put HLAA twee bindend peptide toe voor een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL cultuur.

Ververs de cellen op alternatieve dagen om de stimulatie en expansie van T-cellen te bevorderen. Voeg vers medium toe, aangevuld met menselijk recombinant IL-2 voor een eindconcentratie van 50 units per milliliter. Bereid na één week een cultuur van autologe PBMC's voor, bestraal de cellen en pulseer deze gedurende twee uur met dezelfde HLA.

Restimuleer de culturen door 1 ml van de bestraalde autologe PBM CS toe te voegen aan elke put, met een twee-bindend peptide in een concentratie van 10 µg/mL. Voeg om de dag vers medium toe, aangevuld met IL-2. Na een weitere week worden de culturen op dezelfde wijze voor een tweede maal restimuleerd. Na nog eens zes dagen in kweek zijn de cellen klaar voor gebruik.

Bereid het intelligentie-impedantiemetingstation voor door het gedurende ten minste een uur te equilibreren op 37 °C onder 5% koolstofdioxide. Oogst 75% confluente menselijke tumorcellen met behulp van 0,25% trypsine en centrifugatie. Tel de tumorcellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in RPMI.

Tumormedium met een concentratie van 7 500 cellen per microliter. Programmeer vervolgens in de Excel agent-software de lay-outpagina met de well-indeling. Stel de schedule-pagina zo in dat er elke vijf minuten impedantiemetingen worden verricht gedurende een periode van 40 uur; gedurende de eerste 18 uur zal het Xceligent-systeem uitsluitend impedantiemetingen van de tumorcellen uitvoeren.

Voeg vervolgens 100 µL RPMI-tumormedium per well toe. Voer een achtergrondmeting uit op de betreffende EPL's door de impedantie te meten in afwezigheid van cellen. Nadat de tumorcellen zijn toegevoegd, plaatst u de platen in het betreffende station en begint u met de metingen.

De tumorcellen zullen onmiddellijk beginnen aan te hechten aan de EPL's. Na ongeveer 18 uur incubatie zullen de tumorcellen aan de EPL's zijn gehecht en zijn toegenomen tot 15 000 tumorcellen per well. Oogst op dit moment de voorbereide T-cellen door voorzichtig te schrapen en middel een agitatiecentrifuge.

Resuspendeer de T-cellen in RPMI-medium met 10% FBS en tel ze met behulp van een hemocytometer. Zodra de celdichtheid bekend is, wordt een tweevoudige verdunningsreeks van T-cellen bereid, zodanig dat wanneer er 200 µL T-cellen aan de tumorcellen worden toegevoegd, de hoogste concentratie 40 T-cellen per tumorcel bedraagt. De laatste verdunning van de reeks moet 1,25 T-cellen per tumorcel opleveren.

Pauzeer het EXOGEN-station en verwijder de EPL met een pipet. Verwijder het medium uit de wells en voeg vervolgens 200 µL T-cellen toe, waarbij alle concentraties uit de verdunningsreeks als negatieve controle worden gebruikt. Gebruik puur medium, plaats de EPL terug in het station en vervolg het programma aan het einde van de assay.

Normaliseer de resultaten. Volg altijd de institutionele procedures voor stralingsveiligheid bij het werken met chroom 51 en met chroom 51 gelabelde doelcellen en gebruik de afscherming om de blootstelling aan straling te verminderen. Begin met het pulseren van tumorcellen gedurende twee uur bij 1 miljoen cellen per milliliter met 10 microliters per milliliter vers chroom 51.

Was vervolgens de tumorcellen in 10 milliliters RPMI-medium met 10% FBS, centrifugeer de cellen en resuspendeer deze in hetzelfde medium op een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Breng deze vervolgens over naar een 96-wells plaat met ronde bodems. Voeg 100.000 tumorcellen per well toe om de spontane release te bepalen.

Voeg niets anders toe aan zes van deze wells en aan zes andere wells. Voeg 100 µL Triton X 100 toe aan alle overige wells om de cellen te lyseren en zo de maximale release te berekenen. Voeg T-cellen toe aan de plaat met behulp van de eerder bereide verdunningsreeks.

Incubeer de platen nu gedurende vijf uur en verzamel 50 µL monsters van het supernatant uit elke plaat; laad de monsters op een luma-plaat nadat de platen 's nachts bij kamertemperatuur in de zuurkast zijn gedroogd. Meet hun CPM met een gammacounter voor T-cellen en SKBR3-kankercellen. De kankercellen werden gekweekt op X intelligence-platen en de celindex werd gemeten, wat een reflectie is van de plaatimpedantie, aangezien T-cellen geen adhesie vereisen om te prolifereren.

Hun effect op de impedantie was verwaarloosbaar gedurende een cultuurperiode van 40 uur. Kankercellen die alleen werden gekweekt, vertoonden een toenemende impedantiemeting. De toevoeging van T-cellen na 18 uur doorbreekt echter deze trend.

Deze gebeurtenis vereist softwarenormalisatie na de toevoeging van T-cellen en wordt verder onderzocht in het volgende experiment. Wanneer SK BR three-cellen werden gecocultiveerd met variërende concentraties T-cellen, waren reducties in impedantie zeer duidelijk afhankelijk van de dosis T-cellen; gegevens werden elke vijf minuten verzameld over drie trials op het 10-uursmarkeerpunt. Celindices volgden een tweedegraads polynoom over het bereik van T-cellen, wat aangeeft dat het Exogen-station CD eight T-cel-gemedieerde dood van SK B three-tumoren in real-time monitort als een daling in de celindex, om te bepalen of reducties in impedantie van SK BR three door de T-cellen antigeenspecifiek waren.

SK KBR-3-cellen werden gecocultureerd met HLA-A2-positieve FLU-specifieke T-cellen die HER2-neu niet herkennen. Deze cellen vertoonden significant minder lytische activiteit. Om verder te bepalen of HER2-neu-specifieke T-cellen op een antigeenspecifieke wijze doodden, werd een antilichaam tegen Fas-ligand aan de cocultures toegevoegd. Het antilichaam verminderde de lytische activiteit van de HER2-neu P 360 9-specifieke T-cellen niet.

Echter, bij T-cellen die aspecifiek waren geactiveerd met anti-CD3/CD28-beads, remde het antilichaam de lysis wel; dit werd gedaan om vast te stellen of de doding plaatsvond op een HLA-klasse I-afhankelijke manier. Aan de coculturen werd ofwel een anti-HLA-klasse I-antilichaam of een isotype-controleantilichaam toegevoegd. De resultaten ondersteunden deze hypothese sterk.

Vervolgens werden de T-cellen gecocultureerd met andere kankercellen in een verhouding van één op vijf. De HLA A2-negatieve tumorcellijn BT 20 werd gebruikt als negatieve controle. De resultaten tonen aan dat de methode bruikbaar is voor meerdere soorten adhærente target-tumorcellen.

Cocultures van de twee nieuwe P 360 9 specifieke T-cellen van de HER werden toegevoegd aan met chromium 51 gelabelde doelcellen, gevolgd door CRA-analyse. De intelligentie-assay lijkt gevoeliger voor het analyseren van consistentie. De intra-assayvariatie werd berekend als het procentuele variatiecoëfficiënt bij elke celratio tussen 1:40 en 1:5.

Dit was lager dan 15% bij de laagste celverhoudingen. Echter was het percentage CV hoog of onvoorspelbaar. Daarnaast werd de variabiliteit van SK BR three T-cellyse door co-cultuur met verschillende P 360 9 specifieke T-cellijnen onderzocht.

De gegevens werden met een tussenpoos van 30 dagen gegenereerd. De assays werden in drievoud uitgevoerd en de resultaten waren zeer vergelijkbaar. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het bepalen van de cytotoxische T-celactiviteit met behulp van antigeenspecifieke CD8 T-cellen en tumorcellen via een impedantiegebaseerde benadering.