Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en kwantificeren van de pool van toxine die het cytosol binnendringt. Om dit te bereiken, wordt het toxine eerst gebonden aan het oppervlak van de gastheercel bij 4 °C. Het ongebonden toxine wordt vervolgens verwijderd en de cellen worden opgewarmd tot 37 °C, wat de beweging van het toxine naar het endomembraansysteem en vervolgens naar het cytosol van de gastheer mogelijk maakt; daarna wordt digitonine gebruikt om na celpermeatie selectief het plasmamembraan te permeabiliseren.

De celextracten worden middels differentiële centrifugatie gescheiden in afzonderlijke membraan- en cytosolfracties. Als laatste stap wordt surface plasmon resonance (afgekort als SPR) gebruikt om de entry van toxines in het cytosol te detecteren en te kwantificeren, door de cytosolfractie te perfunderen over een SPR-sensor die is gecoat met een antitoxine-antilichaam. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen de toxinebiologie, zoals de efficiëntie en kinetiek van de entry van toxines in het cytosol, de hoeveelheid toxine die het cytosol binnendringt en de mogelijke remming van het toxinetransport naar het cytosol door geneesmiddelen. Bereid vóór de start van dit protocol HeLa-cellen voor op intoxicatie, zoals beschreven in het schriftelijke protocol, na een incubatie van de HeLa-cellen gedurende één nacht.

Vervang het kweekmedium door één milliliter DMEM met 100 nanogram per milliliter Ganglioside GM1 en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Dit verhoogt het aantal bindingsplaatsen voor choleratoxine, aangezien de GM1-receptor van het toxine zal interpoleren in het plasmamembraan van cellen die zijn blootgesteld aan een GM1-oplossing.

Na een incubatie van één uur wordt het medium in het GM-well verwijderd en worden de cellen tweemaal gewassen met DMEM. Voeg vervolgens één milliliter DMEM toe die één microgram per milliliter choleratoxine bevat, en plaats de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het toxinehoudende medium en was de cellen tweemaal.

Incubeer de cellen vervolgens in één milliliter DMEM bij 37 °C gedurende de gewenste tijd. Was aan het einde van elke chase-periode de cellen met PBS en incubeer daarna elke put met 250 µL 0,5 mM EDTA en PBS. Verwijder na een incubatie van 10 minuten op ijs de cellen uit de zes-putsplaat door krachtig te tritureren met een P 1000 pipetpunt.

Nadat de cellen uit één put zijn verzameld, voegt u deze samen met de cellen uit de tweede en vervolgens de derde put van dezelfde conditie. Plaats daarna de gecombineerde celsuspensie van de drie replicate putten in één microcentrifugebuisje. Centrifugeer het microcentrifugebuisje vervolgens vijf minuten in een tabletop-microcentrifuge.

Bij 5.000 ×g moeten celpellets van ongeveer gelijke grootte worden verkregen voor alle condities. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet vervolgens in 100 µL van een vooraf bereide en gekoelde 0,04% werkoplossing van digitonine. Plaats de celsuspensie 10 minuten op ijs en centrifugeer de gedigitoniseerde en permeabele cellen vervolgens 10 minuten bij 16.000 ×g met een tabletop microcentrifuge.

Overbreng de cytosolbevattende supernatantfractie naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar de organelbevattende pelletfractie. SPR-toxine-standaarden worden bereid in concentraties van 110, 1 en 0,1 ng/mL in HCN-buffer; monsters worden bereid door cytosolbevattende supernatantfracties te verdunnen in HCN-buffer tot een eindvolume van 1 mL. Monstervolumes van ten minste 1 mL zijn noodzakelijk om te garanderen dat lucht uit de 500 µL monsterlus wordt verwijderd vóór injectie; organelbevattende pelletfracties worden geresuspendeerd in 1 mL HCN-buffer bevattend 1% Triton X 100.

De toevoeging van detergent is noodzakelijk om de in membranen ingesloten pool van toxine vrij te maken. Bereid daarnaast parallelle sets van cytosolische en organel-fracties voor een controle-experiment om de getrouwheid van de fractioneringsprocedure te bevestigen; resuspendeer de cytosolische fractie in 20 µL van vier x monsterbuffer en de organel-fractie in 120 µL van één x monsterbuffer. Scheid gelijke volumes van elke fractie via natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en analyseer deze met een Western blot om de verdeling van een cytosolisch eiwit in de supernatantfractie en een oplosbaar resident ER-eiwit in de pelletfractie aan te tonen. Om de SPR-dia voor te bereiden, plaatst u eerst een verguld glazen dia met een zelfgeassembleerde monolaag in het SPR-instrument.

Activeer de sensorslide door gedurende 10 minuten een E-D-C-N-H-S-oplossing over de slide te perfunderen met een stroomsnelheid van 41 µL per minuut. Voor alle volgende perfusies gebruiken we dezelfde stroomsnelheid. Verwijder de E-D-C-N-H-S-activatiebuffer door de plaat vijf minuten te wassen met PBS met 0,05%2020.

De plaat bevat nu reactieve MI-tethers als gevolg van de ontdekking door de E-D-C-N-H-S-oplossing. Perfundeer vervolgens een anti-CTA-antilichaam over de geactiveerde sensorslide in een verdunning van één op 20.000 in 20 millimolair natriumacetaat gedurende 15 minuten. Er zal een initiële daling in de brekingsindexeenheid, afgekort RIU, zichtbaar zijn als gevolg van de pH-verandering.

Dit zal worden gevolgd door een stijging van de RIU naarmate het antilichaam wordt gebonden door de amide-reactieve tethers. Verwijder het unbound antilichaam van de sensorplaat door een vijf minuten durende PBST-wasstap. Het RIU-signaal dat wordt gegenereerd door het gebonden antilichaam zal afvlakken en stabiliseren, waardoor een nieuw baselinesignaal ontstaat.

Als laatste stap bij de preparatie van de slide wordt één molaire ethanolamine vijf minuten lang over de sensorslide GEPERFUSEERD. Hiermee worden alle ongebonden tethers die op de sensorslide zijn achtergebleven afgedekt en geïnactiveerd. Het RIU-signaal zal toenemen; om een basislijnmeting vast te stellen, wordt PBST vijf minuten lang over de met antilichamen gecoate sensor geperfuseerd.

Perfuseer vervolgens een experimenteel monster of een toxine-standaard gedurende 300 seconden over de sensor. Verwijder het ligand uit de buffer en perfuseer gedurende nog eens 200 seconden PBST over de sensor. Eventueel resterend gebonden toxine op de sensor wordt verwijderd door een 102e wasbeurt met PBST bij pH 5.0.

Dit zal het signaal terugbrengen naar de initiële basislijnmeting, waardoor een ander monster op dezelfde sensor kan worden verwerkt. Duw vóór het laden van een nieuw monster een kleine hoeveelheid lucht door de monsterlus om eventuele resterende vloeistof van het vorige monster te verdrijven. Na de acquisitie.

Gegevens kunnen worden geanalyseerd met de scrubber two-software en de Igor-software kan worden gebruikt voor de voorbereiding van figuren. Pertussistoxine is een AB-toxine dat zich van het celoppervlak naar het ER verplaatst voordat de a-keten van PTs one het cytosol binnendringt.

De op SPR gebaseerde translocatie-assay kon PT's detecteren in het cytosol van geïntoxiceerde CHO-cellen. Er werd geen signaal gegenereerd vanuit het cytosol van niet-geïntoxiceerde cellen, wat de anti-PT's bevestigde. Eén antilichaam vertoonde geen kruisreactiviteit met een component van het cytosol van de gastheer.

De cytosolfractie van cellen die zijn geïntoxiceerd in aanwezigheid van felden. A slaagde er ook niet in om een positief signaal te produceren, BFA voorkomt het transport van het toxine naar de translocatieplaats van het ER, en daarmee de aflevering van de H-keten in het cytosol. Chole toin is een ander AB-type ER-translokerend toxine.

CTA1 werd gedetecteerd in de cytosolische fractie van CT-behandelde HeLa-cellen. Dit benadrukte dat de methodologie werkt met meerdere celtypen en kan worden toegepast op elke toxine waarvoor een antilichaam tegen de A-keten beschikbaar is. Er werd geen signaal gedetecteerd wanneer de cytosolische fractie van CT-behandelde cellen werd geperfundeerd over een SPR-sensor gecoat met een anti-CTB-antilichaam, wat aantoont dat in tegenstelling tot de CT A1-subeenheid het celbindende CTB-pentameer het cytosol niet binnendringt.

Na perfusie over een SPR-sensor gecoat met een anti-CTA-antilichaam. Het signaal van de organelfractie is buiten bereik in vergelijking met het zwakkere signaal van de cytosolische fractie. Dit is consistent met de bekende inefficiëntie van CT-transport naar de translocatieplaats van het ER, wat op zijn beurt de hoeveelheid toxine beperkt die het cytosol kan bereiken.

De tijdsafhankelijke accumulatie van getransloceerd cytosolisch toxine kan ook worden gemonitord. Na blootstelling van de cellen aan CT bij vier graden Celsius werd 15 minuten na het opwarmen naar 37 graden Celsius geen toxine in het cytosol aangetroffen.

Een kleine hoeveelheid cytosolische toxine werd gedetecteerd na 30 minuten bij 37 °C en geleidelijk grotere hoeveelheden cytosolische toxine werden waargenomen na de chase-intervallen van 45 en 60 minuten. Dit demonstreert een continue langdurige afgifte van cel-geassocieerde toxine naar het gastheercytosol. De assay kan ook de inhibitie van de translocatie van toxine naar het cytosol detecteren; cellen behandeld met 10% DMSO vertoonden lage niveaus van cytosolische CT1 in vergelijking met de onbehandelde, geïntoxiceerde controlecellen, wat wijst op een belemmering van de ontvouwing van de toxine.

Een keten is een vereiste voor translocatie naar het cytosol, waardoor DMSO-geïnduceerde stabilisatie van CT A1 dienovereenkomstig de beweging van het ER naar het cytosol verhinderde. Om de door DMSO geïnduceerde blokkade van toxine-translocatie te kwantificeren, werd een standaardcurve gegenereerd uit bekende concentraties toxine gebruikt om een cytosolische CT A1-concentratie te berekenen van 0,3 ng/mL voor onbehandelde cellen en 0,1 ng/mL voor DMSO-behandelde cellen. De inhibitie van de ontvouwing van CT A1 door DMSO leidde zodoende tot een drievoudige reductie in de translocatie van CT A1 van het ER naar het cytosol.

Na deze procedure kunnen we andere technieken gebruiken, zoals intoxicatie-assays, om een direct verband vast te stellen tussen de hoeveelheid toxine aanwezig in het cytosol en de toxine-activiteit.