Name: Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer de detectie en kwantificering van toxine-translocatie naar het gastheercytosol met behulp van oppervlakte-plasmonresonantie. Deze gevoelige methode biedt inzicht in de kinetiek van toxine-intrusie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​R01 AI073783 naar K. Teter. Wij danken dr. Shane Massey voor hulp bij de ontwikkeling van de subcellulaire fractionatie protocol en Helen Burress voor de kritische lezing van het manuscript.

1. Voorbereiding van de digitonine <ol><li> Voeg 500 ul van 100% ethanol tot een microcentrifugebuis en plaats deze in een warmte blok ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Los 2,5 mg digitonine in 250 pi van de verhitte ethanol tot een 1% oplossing van digitonine voorraad te produceren. </li><li> Voor het genereren van een werkende oplossing van 0,04% digitonine, voeg 40 ul van de digitonine stamoplossing tot 960 ul van HCN-buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10 mM N-ethylmaleimide, en een proteaseremmer cocktail). </li></ol> 2. Cel dronkenschap en permeabilisatie Onze translocatie test kan worden toegepast op een reeks van toxines en cellijnen. Hieronder geven we een gedetailleerd protocol voor de detectie van cholera toxine (CT). Een overzicht van de procedure is gegeven in figuur 1. <ol><li> HeLa-cellen worden gezaaid in 6-wells platen met 1 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en antibiotica-schimmelwerendte bereiken 1x10 6 cellen / well na een nacht incubatie bij 37 ° C. Voor het genereren van voldoende cytosolische toxine voor reproduceerbare detectie, zijn drievoud putten vereist voor elke conditie. </li><li> Na een nacht incubatie, vervang dan het kweekmedium met 1 ml DMEM met 100 ng / mL ganglioside GM1. Dit verhoogt het aantal bindingsplaatsen voor CT, omdat de GM1 receptor van CT zal intercaleren in de plasmamembraan van de cellen blootgesteld aan een oplossing van GM1. </li><li> Na een 1 uur incubatie bij 37 ° C, verwijder de GM1-bevattend medium en tweemaal was de cellen met DMEM. Plaats vervolgens de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten in 1 ml DMEM met 1 ug / ml CT. </li><li> Verwijder de toxine-bevattend medium, twee keer de cellen met DMEM wassen, en de cellen in 1 ml DMEM incuberen bij 37 ° C voor de gewenste tijdsinterval (s). </li><li> Aan het einde van elke periode chase, was de cellen met PBS en incubeer elk goed met 250 pl van 0,5 mM EDTA in PBS. Laat de cellen zitten voor 10<html> minuten bij kamertemperatuur en verwijder ze uit de 6-wells plaat van krachtige trituratie met een P1000 Pipetman. Na een goed van de cellen is verzameld, combineren met de tweede en vervolgens derde goed van dezelfde aandoening. Cel schrapers kan ook worden gebruikt om de cellen te verzamelen. </li><li> Plaats het gecombineerde celsuspensie van de drie gelijke putten (750 pi totaal volume) in een enkele microcentrifugebuis, en draai het in een tabletop microcentrifuge gedurende 5 min bij 5000 x g. Celpellets van ongeveer gelijke grootte moet worden verkregen voor alle omstandigheden. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 100 ui van de 0,04% van de werkende oplossing digitonine. Plaats de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Spin de digitonine-gepermeabiliseerde cellen op 16.000 xg gedurende 10 min in een tafelblad microcentrifuge. Breng de cytosol bevattende supernatant fractie een nieuwe microcentrifugebuis, en behouden de organel-bevattende pellet fractie. </li></ol>titel &quot;&gt; 3. Voorbereiding van het monster <ol><li> Cytosol-bevattende supernatant fracties worden verdund in HCN buffer tot een uiteindelijk volume van 1 ml. Monstervolumes van ten minste 1 mL nodig zijn om ervoor te zorgen de lucht is verwijderd uit de 500 uL monster lus vóór de injectie. </li><li> Organel-bevattende pellet fracties zijn geresuspendeerd in 1 ml van HCN een buffer met 1% Triton X-100. Toevoeging van reinigingsmiddel is nodig om de membraan-omsloten pool van toxine vrij te geven. </li><li> Toxine normen bij concentraties van 100, 10, 1 en 0,1 ng / mL worden bereid in HCN buffer. </li><li> Parallelle sets van cytosolische en organel fracties zijn voorbereid op een controle-experiment aan de trouw van de fractionering procedure te bevestigen. Breuken ontstaan, zoals beschreven in hoofdstuk 2 worden opnieuw gesuspendeerd in 20 ul 4x sample buffer (cytosolische fractie) of 120 ul 1x sample buffer (organel fractie). Equivalente volumes van elke fractie worden opgelost door natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese en probed by Western blot-analyse om het partitioneren van een cytosolisch eiwit in het supernatant fractie en een oplosbaar, woonachtig ER eiwit in de pellet-fractie 16-19 te tonen. </li></ol> 4. SPR preparaat <ol><li> De Reichert SR7000 SPR Refractometer wordt gebruikt voor het SPR experimenten. </li><li> Stel een vergulde glazen dia met een zelf-geassembleerde monolaag in de SPR instrument. Het activeren van de sensor glijbaan, perfuseren een 1:1 (v: v) oplossing van 0,4 M EDC en 0,1 M NHS over de glijbaan voor 10 min bij een stroomsnelheid van 41 pL / min. Alle volgende perfusies zal gebruik maken van hetzelfde debiet. </li><li> Voor het verwijderen van het EDC: NHS activering buffer, was de plaat gedurende 5 min met PBS met 0,05% Tween 20 (PBST). De plaat bevat nu reactieve amide tethers te wijten aan ontzegeld, door de EDC: NHS-oplossing. </li><li> Perfuseren een anti-CTA antilichaam op de geactiveerde sensor dia een verdunning van 1:20.000 in 20 mM natriumacetaat (pH 5,5) gedurende 15 minuten. Een eerste daling van de refractieve index eenheid (RIU) zal als gevolg van de pH-verandering te zien. Dit zal worden gevolgd door een toename van de RIU als het antilichaam wordt opgevangen door de amide-reactieve aanbinden op de sensor dia. </li><li> Verwijder de niet-gebonden antilichaam van de sensor dia met een 5 minuten PBST wassen. De RIU signaal geproduceerd door de gevangen antilichaam zal plateau en stabiliseren, waardoor een nieuwe baseline signaal. </li><li> Perfuseren 1 M ethanolamine (pH 8,5) over de sensor glijbaan voor 5 minuten. Deze caps en inactiveert alle ongebonden aanbinden links op de sensor dia. </li></ol> 5. SPR analyse van de monsters <ol><li> Om een ​​basislijn te lezen, perfuseren PBST over de antilichaam-gecoate sensor gedurende 5 minuten. </li><li> Perfuseren een experimentele monster of de standaard toxine over de sensor voor 300 sec. Verwijder de ligand uit de buffer en perfuseren PBST over de sensor voor een andere 200 sec. </li><li> Na elke perfusie, is gebonden toxine verwijderd van de sensor door een 100 sec wassen met PBST bij pH 5,0. Deze zoekopdracht zal het signaalnaar de oorspronkelijke basislijn te lezen, waardoor een andere steekproef te worden verwerkt op dezelfde sensor. </li><li> Voor het laden van een nieuw monster, druk een kleine hoeveelheid lucht door het monster lus om eventuele resten van vocht te verdrijven uit het voorafgaande monster. Met behulp van de procedure beschreven in 5.2-5.4, hebben we aanloop naar de 12 monsters op een dia, zonder substantieel verlies van de basislijn signaal. </li><li> Data-analyse is uitgevoerd met de Scrubber 2-software, en de Igor software wordt gebruikt voor figuur voorbereiding. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Pertussis-toxine (PT) is een AB-toxine die uit het celoppervlak wordt verplaatst naar de ER voor zijn A-keten (PTS1) komt in de cytosol 3, 12. Zoals weergegeven in figuur 2, zou onze SPR-based translocatie test te detecteren PTS1 in het cytosol van dronken CHO-cellen. Er geen signaal werd gegenereerd uit de cytosol van unintoxicated cellen, die bevestigd dat de anti-PTS1 antilichaam niet cross-reageren met een component van de gastheer cytosol. Decytosolische fractie van cellen die dronken in de aanwezigheid van Brefeldine A (BFA) evenmin een positief signaal te produceren. BfA voorkomt toxine transport naar de ER translocatie plaats 6-8, 12, 20-25 en, dus, Een ketting levering aan de cytosol. Aan het einde van elke run, is gebonden toxine ontdaan van de sensor dia. Dit liet meerdere monsters worden gescreend op een enkele sensor glijbaan en daarmee zorgde voor een directe vergelijking tussen de resultaten verkregen met verschillende experimentele omstandigheden. CT is een ander AB-type, ER-transloceren toxine 4. In figuur 3A, was CTA1 gedetecteerd in de cytosolische fractie uit CT-behandelde HeLa-cellen. Dit benadrukt dat onze methodiek werkt met meerdere celtypen en kan worden toegepast op elke toxine waarvoor een anti-A-keten antilichaam beschikbaar is. Er wordt geen signaal was gedetecteerd wanneer de cytosolische fractie uit CT-behandelde cellen was perfusie over een SPR-sensor voorzien van een anti-CTB antilichaam (Fig. 3B), waaruit blijkt dat de CTA1subunit, maar niet de cel-bindende CTB pentameer komt in de cytosol. Figuur 3C toont het signaal van de organel fractie is off-schaal in vergelijking met de zwakkere signaal van de cytosolische fractie. Dit was consistent met het bekende inefficiëntie van CT transport naar de ER translocatie plaats 6, 7, die op zijn beurt beperkt de hoeveelheid toxine die de cytosol kan bereiken. Bovendien is de organel fractie bevat CT holotoxin als ER-gelokaliseerde CTA1, waardoor het resulterende SPR signaal voor de organel fractie wordt opgeblazen door de extra massa van de holotoxin-geassocieerde CTB pentameer. Dus is het niet praktisch om te plotten gegevens van de organel en cytosolische fracties op dezelfde sensorgram. Onze test kan toezien op de tijdsafhankelijke accumulatie van translocatie, cytosolisch toxine (afb. 4). Cellen werden blootgesteld aan CT bij 4 ° C, een temperatuur die het mogelijk maakt toxine binding aan het plasmamembraan maar voorkomt internalisatie van de cel-geassocieerde toxine. Na de removal van ongebonden toxine, werden de cellen verwarmd tot 37 ° C. Beide toxine transport naar de ER en een ketting translocatie naar het cytosol kan optreden bij deze temperatuur. Geen toxine werd ontdekt in de cytosol 15 minuten na het opwarmen tot 37 ° C. Dit weerspiegelde de vertraging die nodig is voor (i) holotoxin mensenhandel aan de ER, (ii) A / B-subunit dissociatie in het ER, en (iii) een keten export naar de cytosol. Een kleine pool van cytosolisch toxine werd ontdekt na 30 minuten bij 37 ° C, en geleidelijk grotere hoeveelheden cytosolisch toxine werd ontdekt na de 45 en 60 minuten te jagen intervallen. Nog hogere niveaus van cytosolisch toxine werd ontdekt na een 5 uur durende achtervolging interval van 17, hetgeen aantoont dat een continue, langdurige levering van cel-geassocieerd toxine naar de host cytosol. Onze test detecteert ook de remming van de toxine translocatie naar het cytoplasma (Fig. 5). Cellen behandeld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO), een chemische stof chaperone dat de thermische Disord voorkomtEring van de geïsoleerde CTA1 subeenheid (T. Banerjee en K. Teter, ongepubliceerde waarnemingen), een laag niveau van cytosolisch CTA1 tentoongesteld in vergelijking met de onbehandelde controle cellen. Ontvouwing van het toxine A-keten is een voorwaarde voor translocatie naar de cytosol 16-18, zodat de DMSO-geïnduceerde stabilisatie van CTA1 dienovereenkomstig zijn beweging verhinderd het ER naar het cytosol. De vereniging snelheidsconstante (k a) berekend op basis van SPR experimenten is recht evenredig met de concentratie van ligand in de perfusie buffer 14, 15, 26. Zo is het mogelijk om de concentratie van de cytosolische toxine te bepalen uit een grafiek die plots de K-waarden voor een toxine normen als een functie van toxine concentratie. Deze procedure werd gebruikt om de DMSO-geïnduceerde blok van toxine translocatie weergegeven in Figuur 5 te kwantificeren: de standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties toxine werd gebruikt om een ​​cytosolische CTA1 CONCENTRAT berekenenion van 0,3 ng / ml voor onbehandelde cellen en 0,1 ng / ml voor DMSO-behandelde cellen (Fig. 6). De remming van CTA1 ontvouwen door DMSO aldus opgewekte een 3-voudige vermindering van de ER-to-cytosol translocatie van CTA1. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Figuur 1. Protocol overzicht. (A) Cellen worden geïncubeerd met de AB toxine bij 4 ° C, een temperatuur die het mogelijk maakt toxine binding aan het celoppervlak, maar voorkomt toxine endocytose. De A-en B-subeenheden van het toxine worden vertegenwoordigd door rode en blauwe cirkels, respectievelijk. (B) geconsolideerd toxine is verwijderd uit het medium, en cellen worden verwarmd tot 37 ° C om endocytose en retrograde transport van de holotoxin promoveren naar de ER. Holotoxin dissociatie vindt plaats in de ER, die het mogelijk maakt de geïsoleerde Een ketting om de cytosol betreden door het passeren van een eiwit-geleidende kanaal (s) in het ER membraan. (C) Cellen worden behandeld met digitonine om selectief permeabilize het plasmamembraan. (D) Centrifugeren wordt gebruikt om partitie van de cellen in afzonderlijke cytosolische en organel fracties. Het cytosol is geperst uit de cel door middel van de digitonine gegenereerde poriën en is gelegen in het supernatant. Het intacte, membraangebonden organellen zijn te vinden in de pellet-fractie. (E) Om de translocatie pool van toxine A-keten in de ontvangende cytosol te detecteren, is het supernatant fractie geperfuseerde meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-A-keten antilichaam. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Figuur 2. Detectie van PTS1 translocatie in de gastheer cytosol. CHO cellen werden puls-gelabeld bij 4 ° C gedurende 30 min met 1 ug / ml van PT. De cellen werden vervolgens achtervolgd gedurende 3 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium bevat geen toevoegingen (onder invloed) of 5 microgram BfA / ml (+ BfA dronken). Permeabilisatie van de plasma membraan met digitonine werd gebruikt om de partitie celextracten in aparte organel en cytosolisch fractions. Een SPR sensor voorzien van een anti-PTS1 antilichaam werd gebruikt om de cytosolische pool van PTS1 van onbehandelde of BfA-behandelde cellen te detecteren. PTS1 normen werden geperfuseerd over de sensor als positieve controles, terwijl de cytosolische fractie van unintoxicated cellen werd doorbloed over de sensor dia als een negatieve controle. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Figuur 3. Detectie van CTA1 translocatie in de gastheer cytosol. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT werden verjaagd gedurende 2 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium die geen toevoegingen (onder invloed) of 5 microgram BfA / ml (+ BfA dronken). Permeabilisatie van de plasma membraan met digitonine werd gebruikt om de partitie celextracten in aparte organel en cytosolische fracties. (A) De cytosolische fracties werden geperfuseerd meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. Bekendhoeveelheden van de CTA werden gebruikt als positieve controles, terwijl het cytosol van unintoxicated cellen werd gebruikt als een negatieve controle. (B) De cytosolische fractie van cellen die dronken in de afwezigheid van BfA was geperfuseerd over een SPR-sensor voorzien van een anti-CTB antilichaam. Een gezuiverde CTB pentameer was doorbloed over de dia als een positieve controle. (C) De organel fractie werd opgelost met 1% Triton X-100 voor perfusie via een sensor SPR gecoat met een anti-CTA antilichaam. Voor vergelijkingsdoeleinden zijn de cytosolische fractie (1 ml uiteindelijk volume) uit dezelfde cel-extract en een CTA standaard ook doorbloed over de sensor. Voor alle panelen, was gebonden monster ontdaan van de sensor aan het einde van elke run. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Figuur 4. Kinetiek van CTA1 binnenkomst in het cytosol. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT waren verjaagd voor 15, 30, 45, of 60 minuten bij 37 ° C in toxine-vrij medium. Voor het detecteren van de translocatie pool van toxine, zijn cytosolische fracties uit digitonine-gepermeabiliseerde cellen doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. CTA normen werden geperfuseerd over de sensor ook. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Figuur 5. Remming van CTA1 translocatie door DMSO. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT werden verjaagd gedurende 2 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium die geen toevoegingen (onder invloed) of 10% DMSO (+ DMSO dronken). Voor het detecteren van de translocatie pool van toxine, zijn cytosolische fracties uit digitonine-gepermeabiliseerde cellen doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. CTA normen (100, 10, 1 en 0,1 ng / ml) werden geperfuseerd over de sensor als positieve controles, alleen de 1 en 0,1 ng / mL normen worden voor het schalen doeleinden. Het cytosol van unintoxicated-cellen werd gebruikt als een negatieve controle. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Figuur 6. Berekening van de cytosolische CTA1. K een waarden voor de CTA normen uit figuur 5 werden uitgezet als functie van de toxine concentratie. De resulterende standaardcurve werd gebruikt om te bepalen, op basis van de k een waarden van de experimentele monsters uit Figuur 5, de concentratie van cytosolisch CTA1 bij onbehandelde en DMSO-behandelde cellen. Toxine normen worden gepresenteerd als gevulde cirkels, de onbehandelde cytosol wordt gepresenteerd als een open plein, en de DMSO-behandelde cytosol wordt gepresenteerd als een open cirkel. De gemiddelden ± varieert van twee onafhankelijke experimenten worden getoond.

Geen belangenconflicten verklaard.

Vergelijking met bestaande methodologie Onze SPR-gebaseerde translocatie assay is een snelle, gevoelige en kwantitatieve methode om de levering toxine te detecteren in de gastheer cytosol. De techniek vereist geen radiolabeling of andere wijzigingen van het toxine, en het kan worden toegepast op elk toxine waarvoor een anti-toxine A keten antilichaam beschikbaar is. Bestaande methoden voor het toxine passage monitor in het cytosol ook vertrouwen op een subcellulaire fractionatie protocol te pa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Digitonine </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lijst </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-hydroxysuccinimide) </td><td> Doorboren </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> SiGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB antilichaam </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor dia&#39;s </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Injectiepomp </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detectie van toxin translocatie in de host cytosol van surface plasmon resonance

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxines bestaan ​​uit een enzymatische A subeenheid en een cel-bindend B-subunit 1. Deze toxinen worden uitgescheiden in de extracellulaire milieu, maar ze reageren op doelen binnen de eukaryote cytosol. Sommige AB toxines reizen blaasje luchtvaartmaatschappijen uit het celoppervlak naar het endoplasmatisch reticulum (ER), voordat u het cytosol 2-4. In de ER, om de katalytische A-keten distantieert van de rest van de toxine en beweegt zich door een eiwit-geleidende kanaal bereiken zijn cytosolische doel 5. De getransloceerde, cytosolische Een ketting is moeilijk op te sporen omdat toxine mensenhandel aan de ER is een zeer inefficiënt proces: de meeste geïnternaliseerd toxine is doorgestuurd naar de lysosomen voor degradatie, zodat slechts een kleine fractie van het oppervlak gebonden toxine bereikt het Golgi-apparaat en ER 6 -12. Voor het bewaken van toxine translocatie uit het ER naar het cytosol in gekweekte cellen, combineerden we een subcellulaire fractionering protocol met de highly gevoelige detectiemethode van surface plasmon resonance (SPR) 13-15. Het plasmamembraan van de toxine-behandelde cellen selectief gepermeabiliseerd met digitonine, waardoor verzameling van een cytosolische fractie die vervolgens wordt doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-toxine A-keten antilichaam. Het antilichaam-gecoate sensor kan vangen en op te sporen pg / mL hoeveelheden cytosolisch toxine. Met dit protocol, is het mogelijk om de kinetiek van de toxine toegang te volgen in het cytosol en remmende effecten op de translocatie evenement karakteriseren. De concentratie van cytosolisch toxine kan ook worden berekend op basis van een standaard curve gegenereerd met bekende hoeveelheden van een keten normen die zijn doorbloed over de sensor. Onze methode is een snelle, gevoelige en kwantitatieve detectie systeem dat niet nodig radiolabeling of andere wijzigingen van het doel toxine.

In dit rapport beschrijven we hoe oppervlakte plasmon resonantie wordt gebruikt om toegang toxine te detecteren in de gastheer cytosol. Deze zeer gevoelige methode kan kwantitatieve gegevens over de hoogte van cytosolische toxine, en het kan worden toegepast op een reeks van toxines.

Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

AB-toxinen bestaan uit een enzymatische A-subeenheid en een celbindende B-subeenheid1. Deze toxinen worden uitgescheiden in het extracellulaire milieu, maar ze werken in op ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en kwantificeren van de pool van toxine die het cytosol binnendringt. Om dit te bereiken, wordt het toxine eerst gebonden aan het oppervlak van de gastheercel bij vier graden Celsius. Het ongebonden toxine wordt vervolgens verwijderd en de cellen worden opgewarmd tot 37 graden Celsius, wat de beweging van het toxine naar het endomembraansysteem en vervolgens naar het cytosol van de gastheer mogelijk maakt. Daarna wordt digitonine gebruikt om selectief het plasmamembraan te permeabiliseren na de celpermeatie.De celextracten worden met behulp van differentiële centrifugatie gescheiden in afzonderlijke membraan- en cytosolfracties; als laatste stap wordt surface plasma resonance (afgekort SPR) gebruikt om de entry van toxine in het cytosol te detecteren en te kwantificeren door de cytosolfractie te perfunderen over een SPR-sensor die is gecoat met een antitoxine-antilichaam. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de toxinebiologie, zoals de efficiëntie en kinetiek van de entry van toxine in het cytosol, de hoeveelheid toxine die het cytosol binnendringt en mogelijke remming van het transport van tox

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes the surface plasmon resonance, or SPR, technique for studying the interaction between two molecules using a sensor chip. The change in resonance angle and the intensity of the reflected light are detected as a function of the association and dissociation of two molecules, and this provides information about the interactions between the two molecules.

Surface Plasmon Resonance to Study Biomolecular Interactions Using a Sensor Chip

This video demonstrates localized surface plasmon resonance imaging to detect protein secretions from a single cell. Using a microfluidic setup and a peptide-bound plasmonic nanostructure chip, changes in reflected light intensity at the resonance angle reveal interactions with secreted proteins from a single cell.

Localized Surface Plasmon Resonance Imaging to Detect Protein Secretions from a Single Cell

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande...

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

Een nieuwe aanpak wordt beschreven voor de constructie van een elektronische tong (eT), die het ontwerp en de productie van sensormaterialen aanzienlijk vereenvoudigt en het mogelijk maakt voor de eT om continue evolutieprofielen en landschappen voor monsters in vloeibare vorm te genereren. De verkregen eT is efficiënt voor gebruikelijke eiwitanalyse, zoals onderscheiding.

Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Plasmonische nanopincetten gebruiken gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in gouden nanostructuren om afzonderlijke nanodeeltjes, waaronder eiwitten, op te vangen in een optisch veld op nanometerschaal. Veranderingen in het verstrooide signaal onthullen de aanwezigheid van eiwitten en de conformationele dynamiek, waardoor monitoring mogelijk is zonder fluorofoormodificaties of oppervlaktetethering.

Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Leer de detectie en kwantificering van toxine-translocatie naar het gastheercytosol met behulp van oppervlakte-plasmonresonantie. Deze gevoelige methode biedt inzicht in de kinetiek van toxine-intrusie.

Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

Meer video's verkennen