Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gewenst DNA-construct in het bacteriële chromosoom te integreren op een vooraf bepaald locus. Dit wordt bereikt via een paringsprotocol met vier gemanipuleerde bacteriële stammen. De recipientstam beschikt over een landing pad-sequentie bestaande uit een spectinomycine-resistentiegen en het E. coli bèta-glucuronidasegen, geflankeerd door ATP-sites die in het chromosoom zijn geïntegreerd.

De donorstam P JH one 10 draagt een plasmide met attB-sites die een stuffer-gen voor een rood fluorescent eiwit en een antibioticumresistentiegen flankeren. De donorstam PJC two draagt een plasmide dat de site-specifieke integrase van de streptomycesfaag C 31 bevat onder controle van de LAC-promotor. De vierde stam, MT 616, levert de transfergenen die nodig zijn voor conjugatie, de overdracht van plasmiden van cel naar cel, wat resulteert in de creatie van trans via de recipientstammen.

Verwerving van de twee plasmiden die nodig zijn voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling. De uitwisseling van de donorcassette van het PJ H one 10-plasmide met de markers van de landing pad-cassette op het chromosoom resulteert in het verlies van de landing pad-markers, SPR en UIDA, en het behoud van de donorcassette RFP en GMR in de resulterende trans-immigrant. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals homologe recombinatie, is het gemak en de efficiëntie van het protocol.

Het is ook overdraagbaar op een breed scala aan bacteriën. De acceptorstam die in deze video wordt gebruikt, is een S. milli latte-stam. Inoculeer twee dagen vóór de paringsprocedure voor het creëren van trans-integrines vanuit een enkele kolonie in vijf milliliter TY-medium met spectmycine. Incubeer de S. milli-stam gedurende twee dagen bij 30 °C onder schudcondities. Inoculeer op de dag vóór de paringsprocedure elk van de volgende E. coli-stammen in vijf milliliter LB-vloeibaar medium aangevuld met het juiste antibioticum: DH5α met het integrase-expressieplasmid in medium met tetracycline, MT616 (de mobilisator) in medium met chloramfenicol en DH5α met het donorcassette-plasmid in medium met gentamycine. Incubeer de drie E. coli-stammen overnacht bij 37 °C onder constante schudcondities. Om de cellen voor te bereiden op de paringsprocedure, brengt u 1,5 milliliter van elk van de vier culturen over in een buis en centrifugeert u deze bij 17.000 ×g gedurende 30 seconden om de celpellet te verzamelen. Verwijder het medium en resuspendeer elke celpellet in één milliliter steriele 0,85% natriumchloride. Centrifugeer de buizen opnieuw en resuspendeer na het verwijderen van het supernatant elke pellet in 100 µL steriele 0,85% natriumchloride. Breng met een pipet individueel 10 µL van de gewassen cultuur van elke stam aan op een gewone TY-agarplaat.

Deze spots zijn controle-spots. Voeg vervolgens 40 µL van elke stam, met uitzondering van de e coli DH five alpha met Pjc twee, toe aan een steriele buis en meng deze door herhaaldelijk te pipetteren; spot 120 µL van dit mengsel op de gewone TY-agarplaat. Deze spot is de negatieve controle zonder integrase.

Voeg ten slotte 40 µL van elk van de vier stammen toe aan een steriele buis, meng deze en spot 160 µL van dit mengsel op dezelfde TDY-agarplaat. Deze spot is de paringsspot voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling.

Plaats de plaat in een laminaire flowkast en laat de spots daarna ongeveer 20 minuten drogen. Verzegel de plaat en incubeer deze de dag na het uitstrijkprotocol voor de paring gedurende de nacht bij 30 °C. Strijk de twee controle-spots en de IMCE-paringsspot uit op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine en gentamycine.

De S milli-acceptorstam bevat een mutatie die een hoge mate van resistentie tegen streptomycine verleent voor de berekening van de IMCE-efficiëntie. Resuspendee ongeveer een kwart van de IMCE-paringsspot in 500 µL steriele 0,85% natriumchloride. Maak tienvoudige seriële verdunningen tot 10⁻⁷. Plat de verdunningen 10⁻² tot 10⁻⁵ uit op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine, gentamycine en xgl om de trans-immigranten te selecteren. Plat de verdunningen 10⁻³ tot 10⁻⁷ uit op TY-agarplaten, aangevuld met streptomycine en xgl om zowel de trans-immigranten als potentiële recipiënten te selecteren. IE totale recipiënten. Incubeer de platen bij 30 °C gedurende drie dagen.

Bekijk RFP-trans onder groen licht en door een rood filter. Bereken de procentuele IMCE-efficiëntie als CFU van trans-immigranten vergeleken met de CFU van het totaal aantal recipienten. Ongeveer de helft van de trans-cellen zal een werkelijke uitwisseling hebben ondergaan, waardoor ze wit en ongevoelig worden na drie dagen incubatie op Ty aangevuld met streptomycine en gentamycine. Er mag geen groei zijn bij de volgende controlestammen: no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha bevattende P JH one 10 control en e coli DH five alpha bevattende PJC two control. In contrast hiermee moet de IMCE-uitstrijk uit de paringsplek confluente groei vertonen op de hoofduitstrijk en veel kolonies op de tweede uitstrijk. De volgende twee afbeeldingen tonen resuspensies van een 10⁻² verdunning van de paringsplek op TY streptomycine xgl-agar, en op TY streptomycine gentamycine xgl-agar op de TY streptomycine gentamycine xgl-agar.

De blauwe kolonies zijn enkelvoudige recombinanten. Terwijl de witte kolonies trans-integrines zijn die een werkelijke cassette-uitwisseling hebben ondergaan wanneer ze onder groen licht en door een rood filter worden bekeken, vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus suspensie op TY strept cin xgl agar geen fluorescentie. In tegenstelling hiermee vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus suspensie op Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar twee niveaus van fluorescentie.

De helderdere kolonies komen overeen met de blauwe kolonies en hebben een hogere RFP-expressie, vermoedelijk als gevolg van een read-through vanuit de LAC-promotor in de vector. De minder heldere kolonies komen overeen met de witte kolonies, die een daadwerkelijke cassette-uitwisseling hebben ondergaan en RFP bevatten met enkel de directe promotor en zonder read-through vanuit de LAC-promotor. Deze trends zouden ook specksmycine-gevoelig moeten zijn.

De efficiëntie van de trans-integratie, uitgedrukt als het percentage trans-immigranten ten opzichte van het totaal aantal recipienten, zou in de range van 0,5% moeten liggen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het gebruik van bacteriële conjugatie met onze gemodificeerde stammen om DNA-constructen in het bacteriële chromosoom in te voegen.