Name: Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer hoe je DNA-constructen site-specifiek integreert in bacteriële chromosomen met behulp van ΦC31-integrase en geëngineerde landing pad-stammen. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Om Margaret CM Smith voor vriendelijk het verstrekken van de integrase kloon Financiering steun van: Genome Canada / Genome Prairie NSERC Discovery en strategische Projectsubsidies

1. Productie van Cultuur <ol><li> Bereid steriele vloeibare media: TY 10 (5 g / l trypton, 3 g / l gistextract, 0,44 g / l calciumchloride dehydrateren) en LB 11 (10 g / l trypton, 5 g / l gistextract, 5 g / natriumchloride, pH 7). </li><li> Inoculeer uit een kolonie: SmUW227 (S. meliloti LP-stam: de bouw zal elders worden beschreven, stam bouw details zijn beschikbaar op aanvraag) () in 5 ml TY media met 50 ug / ml spectinomycine. Inoculeer de volgende stammen in 5 ml LB vloeibare media, aan te vullen met de gegeven antibiotica: E. coli DH5a 12 met pJC2 de integrase expressieplasmide, met 10 ug / ml tetracycline, E. coli MT616 13, mobilisator, met 10 ug / ml chlooramfenicol en E. coli DH5a bevattende pJH110 de donor cassette plasmide met 5 pg / ml gentamicine. </li><li> Incubate E. coli-stammen &#39;s nachts op 37 &amp;deg; C met een constante schudden. Incubate S. meliloti rek bij 30 ° C voor twee dagen schudden. Het is mogelijk om een S. meliloti cultuur &#39;s nachts met een grotere inoculum (1:500 subcultuur van een verzadigde cultuur). </li></ol> 2. De bereiding en de Mixing <ol><li> Was 1,5 ml van de cultuur voor elke stam door het verzamelen van de cel pellet door middel van centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 30 seconden en resuspenderen in 1 ml steriele 0,85% NaCl, herhaal een keer. </li><li> Hersuspenderen pellet in 100 ul steriel 0,85% NaCl. </li><li> Individueel spot 10 ul van gewassen cultuur voor elke stam op een vlakte TY agarplaat. Deze vlekken zijn controle-plekken. </li><li> Voeg 40 pi van elke stam exclusief E. coli DH5a 12 met pJC2 in een steriele buis mix en spot 120 pi van dit mengsel op een vlak TY agarplaat. Deze plek is de no-integrase negatieve controle. </li><li> Voeg 40 pi van elke stam in een steriele tUbe, mix, en spot 160 pi van dit mengsel op een vlakte TY agarplaat. Deze plek is de IMCE paring plaats. </li><li> Laat plekken te drogen in een laminaire stroming kap. </li><li> Seal platen en incuberen bij 30 ° C geroerd. </li></ol> 3. Isolatie van Trans-integranten <ol><li> Strook controle vlekken en IMCE spot op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine (SmUW227 berust op Rm1021 die een mutatie verleend op hoog niveau tegen streptomycine 14 draagt) en 30 ug / ml gentamicine. </li><li> Voor de berekening van de IMCE efficiëntie, mengen ongeveer ¼ van de IMCE paring plaats in 500 pi steriel 0,85% NaCl. Maak 10-voudige seriële verdunningen tot 10 -7. Plaat verdunningen 10 -2 via 10 -5 op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine en 30 ug / ml gentamicine, om te selecteren op trans-integranten. Plaat verdunningen 10 -3 thrdoorgedreven 10 -7 op TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine, te selecteren voor trans-integranten potentiële ontvangers, dus totaal ontvangers. </li><li> Voor isolatie van markerless trans-integranten mengen ongeveer een kwart van de IMCE paren plaats in 500 ul steriel 0,85% NaCl. Maak 10-voudige seriële verdunningen tot 10 -6. Plaat verdunningen 10 -4-10 -6 vier TY agarplaten aangevuld met 200 pg / ml streptomycine en 200 ng / ml X-Gluc. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 3 dagen. </li><li> Bekijk RFP trans-integranten onder groen licht (525 nm) en door een rood filter (&gt; 610 nm) 15. </li><li> Bereken het percentage IMCE efficiëntie CFU trans-integranten opzichte van de totale CFU ontvangers. Ongeveer de helft van de trans-integranten zal hebben ondergaan, waar cassette uitwisseling waardoor ze wit en spectinomycine gevoelig. </li><li> Om de markerless trans-integranten (w vindenhier donor vector geen Gm r bevat zoals in pJH110) scherm een witte kolonie (langere incubatieperiode 1-2 extra dagen bij kamertemperatuur wordt de differentiatie van kolonies via X-Gluc verbeteren, dit noodzakelijk S. meliloti SmUW227), bevestigen de kolonie spectinomycine gevoeligheid door middel van screening op een TY agarplaat zonder antibiotica en een TY agarplaat met 100 ug / ml spectinomycine. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Na drie dagen van incubatie op TY aangevuld met streptomycine en gentamicine de controle strepen mag geen groei. De IMCE strook moet confluent groei van de kop strook en veel kolonies op de tweede strook, zoals in figuur 2. De efficiëntie van trans-integratie, uitgedrukt als het percentage trans-integranten de totale ontvangers, moet in het bereik van 0,5%. Ongeveer de helft van de trans-integranten zal spectinomycine gevoelig en witHiermee tonen ze hebben ondergaan waar cassette uitwisseling. Trans-integranten met de tester RFP donor cassette van pJH110 getoond moet worden onderscheiden RFP fluorescentie wanneer bekeken onder groen licht (525 nm) en door een rood filter (&gt; 610 nm) 15. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> . Figuur 1 Conjugation mengsel illustratie: Met behulp van de expressie van de genen van overdracht pRK600, worden alle plasmiden willekeurig overgebracht van cel tot cel. Deze overdracht resulteert in de creatie van de trans-integranten in het mengsel, door overname van de LP-stam van de twee plasmiden die nodig zijn voor IMCE, de integrase (int) helper plasmide pJC2 en de donor plasmide pJH110. De donor cassette van de niet-replicerende donor plasmide (pJH110) wordt uitgewisseld via ΦC31 integrase activiteit met merkers van de LP-cassette op het chromosoom, waardoor het verlies van de LP-merkers (Spr en uidA) en het behoud van de donor cassette (RFP en Gm r) in het resulterende trans-integrand. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. A:. Paring spot plaat op een niet-selectieve TY plaatje, waar gedroogde cel mengsels op agar oppervlak B: Mating vlekken strepen op de streptomycine-gentamicine-X-Gluc plaat, van linksboven met de klok mee geen integrase controle, IMCE in S. meliloti, E. coli DH5a bevattende pJC2 en E. coli DH5a bevattende pJH110 en E. coli MT616 controle, en S. . meliloti UW227 controle C: 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-X-Gluc agar D:. 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-gentamicine-X-Gluc agar (blauwe kolonies zijn single recombinanten, witte kolonies hebben ondergaan waar. cassette uitwisseling) E: 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-X-Gluc agar tonen een gebrek aan fluorescentie F:. 10 -2 verdunning van de paring plaats resuspensie op TY streptomycine-gentamicine-X-Gluc agar met twee niveaus van de fluorescentie (helderder kolonies komen overeen met blauwe kolonies en hebben een hogere RFP uitdrukking vermoedelijk als gevolg van de promotor lezen-maar van vector-sequentie, waar kolonies te hebben ondergaan, waar-cassette uitwisseling bevatten RFP met alleen haar directe promotor zonder read-through van de lac promotor in de vector, die afwezig is.).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
<li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li>
<li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li>
<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
<li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li>
<li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19%3A+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li>
<li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase%2Finvertase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li>
<li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+mobilizable+cosmid+vector%2C+pRK7813%2C+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li>
<li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li>
<li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+theatre%3A+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li>
<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De IMCE techniek maakt het mogelijk voor de efficiënte integratie van een enkele attB geflankeerd DNA-cassette in de LP-locus van een eerder ontworpen stam. Zodra de gewenste construct wordt gekloond in plaats van RFP aan de donor cassette te creëren, is de techniek niet nodig latere DNA-zuivering en transformatie, waardoor het zeer robuust. Het is cruciaal dat goede groei controles zijn opgenomen, om zeker te zijn van de resistentie tegen antibiotica is het gevolg van het ontstaan ​​van trans-integran...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Streptomycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Bacteriologische kwaliteit agar </td><td&gt; Bioshop Canada Inc </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypton </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Gist Extract </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-Gluc </td><td> Goud Biotechnology Inc </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli stam MT616 </td><td> Beschikbaar op aanvraag </td><td></td><td> Wordt ook gebruikt buiten ons lab </td></tr><tr><td> E. coli stam pJC2 </td><td> In huis, op aanvraag beschikbaar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli stam pJH110 </td><td> In het huis, beschikbaar gesteld door request </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 stam </td><td> In huis, op aanvraag beschikbaar </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specifieke bacteriële chromosoom engineering: Φc31 integrase mediated cassette exchange (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

De bacteriële chromosoom kan worden gebruikt om vreemd DNA stabiel te houden in de mega-base bereik 1. De integratie in het chromosoom omzeilt onderwerpen als plasmide replicatie, plasmide stabiliteit, plasmide onverenigbaarheid, en plasmide aantal kopieën variantie. Deze methode maakt gebruik van de site-specific integrase van de Streptomyces faag (Φ) C31 2,3. De ΦC31 integrase katalyseert een directe recombinatie tussen twee specifieke DNA-sites: attB en attP (34 en 39 bp, respectievelijk) 4. Dit recombinatie stabiel is en niet terug 5. Een &quot;landingsplaats&quot; (LP) sequentie bestaande uit een spectinomycine-resistentiegen, aada (SPR) en E. coli ß-glucuronidase gen (uidA) geflankeerd door attP plaatsen is geïntegreerd in de chromosomen van Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi en Agrobacterium tumefaciens in een intergene regio, de ampc locus en de TETA locus respectievelijk. S. meliloti wordt in dit protocol. Mobiliseerbare vectoren die donor attB flankeren een stuffer rood fluorescent eiwit (RFP) gen en een antibioticumresistentiegen zijn aangelegd. In dit voorbeeld gentamicine resistente plasmide pJH110 gebruikt. De RFP gen 6 kan worden vervangen door een gewenste construct met Sphl en Pst I. Als alternatief kan een synthetische construct geflankeerd door attB sites kunnen sub-gekloneerd is in een mobiliseerbare vector, zoals pK19mob 7. De expressie van het ΦC31 integrase gen (gekloneerd pHS62 8) wordt aangedreven door de lac-promotor, een mobiliseerbare breed gastheerbereik plasmide pRK7813 9. Een tetraparental koppelen protocol wordt gebruikt om de donor cassette over in de LP stam en vervangt de merkers met de LP sequentie met de donor cassette. Deze cellen zijn trans-integranten. Trans-integranten gevormd met een typische rendement van 0,5%. Trans-integranten zijn kenmerkend in de eerste 500-1000 kolonies gescreend met antibiotica gevoeligheid of blauw wit screenen met 5-bromo-4-chloor-3-indolyl-ß-D-glucuronzuur (X-Gluc). Dit protocol bevat de paren en de selectieprocedures voor het maken en isoleren van de trans-integranten.

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Het bacteriële chromosoom kan worden gebruikt om vreemd DNA in de megabase-range stabiel te behouden1. Integratie in het chromosoom omzeilt problemen zoals ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gewenst DNA-construct te integreren in het bacteriële chromosoom op een vooraf bepaald locus. Dit wordt bereikt via een paringsprotocol met vier gemodificeerde bacteriële stammen. De recipientstam heeft een landing pad-sequentie die bestaat uit een spectinomycine-resistentiegen en het e coli bèta-glucuronidase-gen, geflankeerd door ATP-sites die in het chromosoom zijn geïntegreerd.De donorstam P JH one 10 draagt een plasmide dat B-sites bevat die een stuffer-gen voor een rood fluorescent eiwit en een antibioticumresistentiegen flankeren. De donorstam PJC two draagt een plasmide met de site-specifieke integrase van de streptomyces-faag C 31 onder controle van de LAC-promotor. De vierde stam MT 616 levert de transfergenen die nodig zijn voor conjugatie, waarbij plasmiden van cel naar cel worden overgedragen, wat resulteert in de creatie van trans via de recipientstammen.Verkrijging van de twee plasmiden die nodig zijn voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling. De uitwisseling van de donorcassette van het PJ H one 10-plasmide met de markers van de landing pad-cassette op het chromosoom resulteert in het verlies van de landing pad-markers, SPR en UIDA, en het behoud van de donorcassette RFP en GMR in de resulterende trans-immigrant. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals homologe recombinatie, is het gemak en de efficiëntie van het protocol.Het is bovendien overdraagbaar op een diverse reeks bacteriën. De acceptorstam die in deze video wordt gebruikt, is een S. milli latte-stam. Inoculeer twee dagen vóór de paringsprocedure voor het creëren van trans-integrines vanuit één enkele kolonie in vijf milliliter TY-medium met spectinomycine. Incubeer de S. milli-stam twee dagen bij 30 °C onder schudcondities. Inoculeer de dag vóór de paringsprocedure elk van de volgende E. coli-stammen in vijf milliliter vloeibaar LB-medium aangevuld met het juiste antibioticum: DH5α met het integrase-expressieplasmid in medium met tetracycline, MT616 (de mobilisator) in medium met chloremphenicol en DH5α met het donorcassette-plasmid in medium met gentamycine. Incubeer de drie E. coli-stammen overnight bij 37 °C onder constante schudcondities. Om de cellen voor te bereiden op de paringsprocedure, brengt u 1,5 milliliter van elk van de vier culturen over in een buis en centrifugeert u deze bij 17.000 ×g gedurende 30 seconden om de celpellet te verzamelen. Verwijder het medium en resuspendeer elke celpellet in één milliliter steriele 0,85% natriumchloride. Centrifugeer de buizen opnieuw en resuspendeer na het verwijderen van het supernatant elke pellet in 100 µL steriele 0,85% natriumchloride. Pipetteer individueel 10 µL gewassen cultuur van elke stam op een gewone TY-agarplaat.Deze spots zijn controle-spots. Voeg vervolgens 40 µL van elke stam, exclusief de e coli DH5α met Pjc2, toe aan een steriele buis en meng dit door herhaaldelijk te pipetteren. Spot 120 µL van dit mengsel op de blanco TY-agarplaat. Deze spot is de negatieve controle zonder integrase.Voeg ten slotte 40 µL van elk van de vier stammen toe in een steriele mengbuis en spot 160 µL van dit mengsel op dezelfde TDY-agarplaat. Deze spot is de paringsspot voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling.Plaats de plaat in een laminaire flowkap en laat de spots daarna ongeveer 20 minuten drogen. Verzegel de plaat en incubeer deze de dag na het mating-protocol overnight bij 30 °C. Strijk de twee controle-spots en de IMCE-mating-spot uit op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine en gentamicine.De S milli acceptorstam draagt een mutatie die een hoge mate van resistentie tegen streptomycine verleent voor de berekening van de IMCE-efficiëntie. Resuspendeer ongeveer een kwart van de IMCE-paringsspot in 500 µL steriele 0,85% natriumchloride. Maak tienvoudige seriële verdunningen tot 10⁻⁷. Plaats verdunningen van 10⁻² tot 10⁻⁵ op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine, gentamycine en xgl om trans-immigranten te selecteren. Plaats verdunningen van 10⁻³ tot 10⁻⁷ op TY-agarplaten, aangevuld met streptomycine en xgl om zowel trans-immigranten als potentiële recipienten te selecteren. IE totale recipienten. Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 30 °C.Bekijk RFP trans onder groen licht en door een rood filter; bereken het percentage IMCE-efficiëntie als CFU van trans-immigranten vergeleken met de CFU van het totaal aantal recipiënten. Ongeveer de helft van de trans-cellen zal een werkelijke uitwisseling hebben ondergaan, waardoor ze wit en ongevoelig worden na drie dagen incubatie op Ty aangevuld met streptomycine en gentamycine. Er mag geen groei zijn in de volgende controlestammen: no-integrase controle s milli latte UW 2 27, controle e coli MT 616, controle e coli DH five alpha bevattend P JH one 10 controle en e coli DH five alpha bevattend PJC two controle. In tegenstelling hiermee moet de IMCE-uitstrijk uit de paringsspot confluente groei vertonen op de hoofduitstrijk en vele kolonies op de tweede uitstrijk. De volgende twee afbeeldingen tonen resuspensies van een 10⁻² verdunning van de paringsspot op TY streptomycine xgl agar, en op TY streptomycine gentamycine xgl agar op de TY streptomycine gentamycine xgl agar.De blauwe kolonies zijn enkelvoudige recombinanten. Terwijl de witte kolonies trans-integrines zijn die een werkelijke cassette-uitwisseling hebben ondergaan wanneer ze onder groen licht en door een rood filter worden bekeken, vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus-suspensie op TY strept cin xgl agar geen fluorescentie. Daarentegen vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus-suspensie op Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar twee niveaus van fluorescentie.De helderdere kolonies komen overeen met blauwe kolonies en vertonen een hogere RFP-expressie, vermoedelijk door een read-through vanaf de LAC-promotor in de vector. De minder heldere kolonies komen overeen met witte kolonies, waarbij een daadwerkelijke cassette-uitwisseling heeft plaatsgevonden en die RFP bevatten met enkel de directe promotor en zonder read-through vanaf de LAC-promotor. Deze trends suggereren dat deze kolonies ook spectinomycine-gevoelig zouden moeten zijn.De efficiëntie van de trans-integratie, uitgedrukt als het percentage trans-immigranten ten opzichte van het totaal aantal recipienten, moet in de range van 0,5% liggen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe bacteriële conjugatie met behulp van onze gemodificeerde stammen kan worden gebruikt om DNA-constructen in het bacteriële chromosoom in te voegen.

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate phiC31-mediated site-specific transgene integration in the Anopheles embryo via microinjection. This method helps introduce desired genes into a host system for research and industrial applications.

phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: A Microinjection Technique for Site-Specific Transgene Integration into an Anopheles Vector

Dit protocol beschrijft de detectie van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in levensmiddelen.

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Hier presenteren we een protocol om een gen van belang dat betrokken is bij plasmide-conjugatie uit te schakelen en vervolgens het effect van het ontbreken ervan te analyseren met behulp van paringstests. De functie van het gen wordt verder onderzocht tot een specifiek gebied van zijn sequentie met behulp van deletie- of puntmutaties.

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.

Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem

We hebben een gedecellulariseerde long extracellulaire matrix en nieuwe biomimetische bioreactor die kunnen worden gebruikt om functionele longweefsel te genereren. Door zaaien cellen in de matrix en het kweken in de bioreactor, genereren wij weefsel dat effectieve gasuitwisseling laat zien wanneer transplanted in vivo voor een korte periode van tijd.

Procedure voor Lung Techniek

Leer hoe je DNA-constructen site-specifiek integreert in bacteriële chromosomen met behulp van ΦC31-integrase en geëngineerde landing pad-stammen. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie mogelijk.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Meer video's verkennen