Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen
December 12th, 2011
Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.
Het algemene doel van het volgende experiment is om antilichamen tegen adventitieuze besmettelijke agentia in laboratoriumdieren te detecteren. Dit wordt bereikt door test serum te incuberen met antigeen gecoate microsferen. Vervolgens wordt het serum geïncubeerd met een biotinylerend gelabelde soortspecifiek anti-immunoglobuline, die eventuele antigeen-antilichaam immuuncomplexen detecteert.
Vervolgens wordt een streptavidine gelabelde FICO eryn Fluor kracht oplossing toegevoegd om eventuele biotinylerende immunoglobuline resultaten te detecteren die positieve of negatieve antilichaamstatus voor veelvoorkomende agentia in laboratoriumknaagdieren tonen op basis van multiplex fluorens, immunoassay net score, fluorescerende steekproefwaarden. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek boven de bestaande methode zoals Eliza, is dat MFIA een multiplex assay is. Dit stelt een onderzoeker in staat om tot honderd verschillende assays in één test te screenen.
Nou, deze techniek vermindert de hoeveelheid serumregio's en wegwerpartikelen die in de bestaande methoden worden gebruikt, terwijl de hoeveelheid informatie die uit één test wordt gegenereerd wordt verhoogd. Nou, we hadden eerst het idee om deze methode te gebruiken toen we een groot aantal Sera-monsters voor meerdere agentia testten en zowel de arbeid als de testtijd wilden verminderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Donna Cohen, een senior technoloog van ons lab Om te beginnen, heb twee buffers klaar die vereist zijn voor de multiplex, fluorens, immunoassay of MFIA procedure.
De eerste is een primaire verdunning, die verkrijgbaar is bij Charles River en bevat eigenaardige blokkeringsmiddelen om niet-specifieke interacties voor de assay wasbuffer te verminderen. Bereid een oplossing van PBS met 1% BSA pH 7.4 om deeltjes te verwijderen. Filter de buffer door een 0,2 micron fles bovenunit in steriele gelabelde containers met behulp van assay wasbuffer.
Bereid twee x-concentraties van biotinylerende antis-soorten, IGG of BAG en strep AVID en FICO alles of SPE, die zullen worden gebruikt om de antigeen-antilichaam complexen te labelen die worden gevormd tijdens de test serum incubatiestap om monsters van de volgende materialen en wegwerpartikelen te bereiden: geassembleerde multi- en enkelkanaals micropipetten en tips en 96-well laag-eiwit bindende microtiter platen voor eiwitverdunning. Na het verzamelen van bloedmonsters en het isoleren van serum, vortex het serum kort voordat de monsters worden verdund in primaire verdunning in een 96-well microtiter plaat om een goede en uniforme weevacuatie te verzekeren. Vooraf nat elke well van de 96-well testplaat met assay wasbuffer langzaam de oplossing gedurende de gehele assay aspireren.
Aspiratie moet vijf tot tien seconden duren om parelketting en compactering van de parels in de filtermembraan te voorkomen, die beide kunnen leiden tot langere leestijd aan het einde van de assay. Controleer dat de vloeistofafvoer is gestopt door de onderkant van de testplaat met papieren handdoeken af te deppen. Het is belangrijk om de testplaat na elke wasstap af te deppen om te voorkomen dat er vocht uit de wells wordt opgezogen tijdens de incubatie.
Om de parels voor te bereiden, begint u met het vortexen van de voorraad gekoppelde parel suspensie. Daarna soniceer ze ze kort in een bad. Het is cruciaal om de parels goed op te schorten om geaggregeerde parelclusters te voorkomen, die kunnen leiden tot langere leestijd.
Vervolgens, doseer de 20 x voorraadopschorting tot een twee x werkende parel oplossing in primaire verdunning. Doe vervolgens 50 microliters van de twee x parelsuspensie in elk assay well van de vooraf nat gemaakte testplaat. Pipetteer 50 microliters van elke twee x test en controle serum naar de testplaat op basis van een vooraf gedefinieerde plaatkaart.
Bevestig het deksel op de plaat. Bedek het met aluminiumfolie en incubeer de testplaat gedurende 60 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur. Om verdamping van oplossingen te voorkomen die het succes van de assay kunnen verhinderen. Houd de testplaat gedurende alle incubatiestappen bedekt met het plaatdeksel.
Daarnaast moet de snelheid van schudden groter zijn dan 400, maar minder dan 700 RPM's, zodat de parels in suspensie blijven om de serumantilichamen toegang te geven tot alle oppervlakken van de gekoppelde antigenen. Na het wassen van de plaat in opeenvolgende incubaties van de parels met BAG en SPE, was de monsters opnieuw. Hersuspenseer vervolgens de parels door 125 microliters assay, was, buffer toe te voegen en twee minuten te schudden om de plaat te lezen.
Plaats het in de assay reader binnen 10 minuten na het herschorten van de parels, de parels passeren een voor een een detector waar ze worden blootgesteld aan twee lasers. Een laser exciteert de interne kleurstoffen die de parel kleurset identificeren en de andere exciteert de FICO alles reporter kleurstof. De intensiteit van de FICO alles fluorens voor een vooraf bepaald aantal parels wordt gerapporteerd als de FM FI lezing. De eerste well wordt geverifieerd om te controleren of het geselecteerde parelpaneel overeenkomt met het parelprofiel in de test wells.
Als er parels vallen buiten hun aangewezen parelregio op het protocolscherm, is er een onjuiste profielselectie gemaakt. Parels die goed zijn herschort, zullen hun aangegeven regio's vullen zoals aangegeven in de assay reader software. Als de parels geaggregeerd zijn, zullen ze hun regio's met een langzame snelheid vullen.
U kunt de testplaat uit de reader verwijderen en de wells handmatig herschorten om de parels te scheiden. Verwijder de testplaat uit de reader en gebruik een multikanaals pipetteerder om elke well drie tot vier keer te ratelen. Breng vervolgens de testplaat terug naar de reader en ga door met het onderzoeken van de resultaten.
Rapporteer fouten zoals onvoldoende pareltellen of vallende IgG anti IgG parelscores, en herhaal de assay voor deze monsters. Na het exporteren van de gegevens naar Excel en het berekenen van de net MFI, bepaal of een van de testplaat assay controles (met uitzondering van de hoge bereik immuunserum) is mislukt. Eventuele mislukte controles zijn onaanvaardbaar en de assay moet worden herhaald.
Deze tabel vertegenwoordigt gegevens voor test serum en assay controles van een typische
Overzicht
Deze studie presenteert de ontwikkeling van de Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) met behulp van Luminex Corporation’s xMAP-technologie voor serosurveillance bij laboratoriumdieren. De MFIA maakt de gelijktijdige detectie van antilichamen tegen meerdere infectieuze agentia mogelijk, wat de efficiëntie verbetert en het gebruik van middelen bij het testen vermindert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Serologisch testen
- Gezondheid van laboratoriumdieren
Achtergrond
- Traditionele serologische methoden zoals ELISA zijn tijdrovend en resource-intensief.
- MFIA maakt multiplexing mogelijk, waardoor het mogelijk is om talrijke assays tegelijkertijd te screenen.
- Deze methode beoogt de detectie van antilichamen bij laboratoriumdieren te verbeteren.
- Efficiënt gebruik van serummonsters en beschikbare materialen is een belangrijk voordeel van MFIA.
Doel van de studie
- Om een efficiëntere methode te ontwikkelen voor het detecteren van antilichamen tegen infectieuze agentia bij laboratoriumdieren.
- Om de arbeid en testtijd geassocieerd met traditionele methoden te verminderen.
- Om een uitgebreide beoordeling van de antilichaamstatus in een enkele test te bieden.
Gebruikte methoden
- Incubatie van test-serum met antigeen-gecoate microspheres.
- Gebruik van biotinyleren anti-immunoglobuline om antigeen-antilichaamcomplexen te detecteren.
- Toepassing van streptavidin-gelabelde detectieoplossingen voor fluorescentiemeting.
- Multiplex assay setup met behulp van een 96-well microtiterplaat formaat.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van antilichamen tegen verschillende infectieuze agentia bij laboratoriumdieren.
- Gedemonstreerde vermindering van serumvolume en gebruik van beschikbare materialen vergeleken met traditionele assays.
- Kwantitatieve resultaten geleverd door multiplex fluorescentieanalyse.
- Geïdentificeerde potentiële problemen met kralenaggregatie die de assayprestaties beïnvloeden.
Conclusies
- MFIA is een haalbaar alternatief voor traditionele serologische methoden.
- Deze techniek verbetert de efficiëntie van serosurveillance in laboratoriumomgevingen.
- Verdere optimalisatie kan nodig zijn om technische uitdagingen aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) addresses the need for high-throughput serosurveillance in preclinical research by enabling simultaneous detection of antibodies against multiple infectious agents. This capability reduces sample consumption, reagent use, and assay time while increasing data density per test well. For biopharma R&D, MFIA supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative immune status data from limited preclinical sample volumes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through broad pathogen exposure profiling in animal models.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying confounding variables from adventitious infections.
- Predictive Confidence: Enhances portfolio triage by identifying models with compromised immunological integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through rigorous health status verification.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal control beads (tissue, IgG, and system suitability controls).
- Scalability: Enables screening readiness for up to 100 assays per well, improving platform reuse in antibody screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by ensuring animal models are free from confounding infectious agents that could skew phenotypic readouts.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by maintaining model integrity across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on serological health status before compound administration.
Pipeline & Workflow Integration
MFIA fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, serving as a gatekeeping step for model suitability before compound screening or efficacy testing.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by verifying that observed phenotypes are not driven by subclinical infections.
- Screening: Describes assay readiness through quantitative net MFI outputs and built-in controls that ensure data reliability.
- Analytics: Highlights multiplex fluorescence measurements and net score calculations that enable comparison across test conditions and antigen panels.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by ensuring that disease-relevant systems remain immunologically naive or appropriately characterized.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for ongoing colony health monitoring across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity from infectious confounders.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via multiplexed bead-based detection and internal controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk from undetected pathogen exposure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on verified animal model health.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunoassay principles, Luminex technology, and multiplex data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including a Luminex reader, plate shaker, and fluorescence detection system.
- Cross-team standardization requirements for reagent preparation, bead handling, and wash protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, including species-specific antigen selection and control bead validation.
- Practical limitations supported by source material: bead aggregation affecting read times and the necessity of proper resuspension to avoid false negatives or elevated background.
