Name: Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer de multiplexed fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serosurveillance bij laboratoriumdieren. Deze methode detecteert gelijktijdig antilichamen tegen meerdere infectieuze agentia met fluorescerende microsferen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het hier gepresenteerde onderzoek werd ondersteund door Charles River.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

Alle auteurs werken voor Charles River RADS, een belangrijke leverancier van dierlijke serologie testen en reagentia.

De MFIA testproces is zeer efficiënt, die minder apparatuur en kleinere monster en reagens volumes dan de traditionele singleplex tests. De functionaliteit van het multiplex systeem geeft de gebruiker de flexibiliteit om gelijktijdig screenen van meerdere serotypen of stammen van gemeenschappelijke middelen in laboratorium-knaagdieren (bijvoorbeeld Coronavirus, parvovirussen etc.). Dit stelt ons voor afgestemde bead panelen ontwerpen gebaseerd op het interessegebied (dwz specifieke virusfamilie) en is aanpasbaar aan screening andere biomoleculen zoals cytokines en andere biomarkers. Daarnaast kunnen we een aantal interne controle assays te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Een weefsel controlekorrel detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline en αIg bead control bevestigtdat serum is toegevoegd en bevat een voldoende concentratie immunoglobuline. Een andere controle kraal, bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en analyse lezer naar behoren functioneren. Andere in de handel verkrijgbare multiplex formaat serologische assays (bijv. microarrays, Immunocomb) mag niet bieden deze hetzelfde niveau van resultaat bevestiging. De mogelijkheid om een ​​beperking van de mogelijke bron van test falen voorafgaand aan de nacontrole kan helpen een onderzoeker besparen op tijd en materiaal. Kritische aspecten van het MFIA moet worden bevestigd voordat men een mislukte monster. Aangezien de test wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur moet worden nagegaan of het laboratorium temperatuur ongeveer 27 ° C ± 2 ° C, hogere temperaturen kan leiden tot lager dan verwachte scores voor controles en monsters. Wassen is wellicht de meest kritische stap in de assay. Verzekeren dat de testplaat goed gewassen, afgevloeid en geresuspendeerd kan eliminerende meeste steekproeffouten door lage bead count (door geaggregeerde kralen) of onvoldoende reagens (verloren wicking van testplaat filterbodem). We routinematig tellen 25 kralen per assay (agent) en hebben geen statistisch verschil in de resultaten op te tellen groter aantal kralen die ook leidt tot een langere leestijd voor de plaat. Wij hebben uitgebreide validatie studies van MFIA op verschillende soorten van de meest gebruikte proefdieren (muis, rat, hamster, cavia en konijn) om diagnostische nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid aan te tonen door het testen van grote aantallen bekende positieve en negatieve serummonsters, en vergelijking van de ELISA, IFA en MFIA resultaten. De detectiegrenzen (bijvoorbeeld standaard immune serum titratie eindpunten) van MFIA waren vergelijkbaar met, en in sommige gevallen overtrof, bij overeenkomstige ELISA. Diagnostische specificiteit, gemeten met SPF knaagdier sera, meer dan 99%, de totale correspondentie between ELISA en MFIA uitgevoerd op bekende positieve en negatieve sera bekende bedroeg meer dan 95%. Kortom, deze resultaten bleek dat multiplex MFIA is een goed alternatief voor de singleplex ELISA, en is geschikt voor het beoogde gebruik, dat wil zeggen in de routine serologische tests van laboratorium dieren kolonies.

multiplexed fluorometrische immunoassay methodiek en problemen oplossen

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Om de kwaliteit van diermodellen gebruikt bij biomedisch onderzoek dat we hebben een aantal diagnostische teststrategieën en methoden te bepalen of dieren blootgesteld aan onvoorziene infectieuze agentia (virussen, mycoplasma en andere veeleisende micro-organismen). Infecties van immuuncompetente dieren zijn over het algemeen van voorbijgaande aard, maar toch serumantistofresponsen voor infecties vaak kunnen worden opgespoord binnen enkele dagen tot weken aanhouden en gedurende de gehele levensduur van de gastheer. Serologie is de primaire diagnostische methode waarmee proefdieren worden gecontroleerd. Historisch de indirecte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de belangrijkste screeningswerkwijze voor serologische tests. De ELISA wordt uitgevoerd als een singleplex, waarin een microbiële antigen-antilichaam reactie wordt per well gemeten. In vergelijking de MFIA uitgevoerd als een gemultiplexte assay. Aangezien de microsferen zijn in 100 verschillende kleurenschema&#39;s kunnen wel 100 verschillende assays worden uitgevoerd simultaaneously in een microplaat goed. Deze innovatie vermindert de hoeveelheid serum, reagentia en disposables vereist voor routinetests terwijl de hoeveelheid van informatie uit een monsterkamer. Daarnaast zijn wij in staat om meerdere interne controle kralen te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Zoals in de ELISA en IFA, de weefselcontrole detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline. De αIg controle (Serum controle) bevestigt dat serum is toegevoegd en bevat een voldoende immunoglobuline concentratie terwijl de IgG-controle kraal (System Geschiktheid controle), bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en Luminex lezer naar behoren functioneren.

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Om de kwaliteit van diermodellen die in biomedisch onderzoek worden gebruikt te waarborgen, hebben wij een aantal diagnostische teststrategieën en methoden ontwikkeld om vast te stellen of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van antilichamen tegen adventieus infectieuze agentia in laboratoriumdieren. Dit wordt bereikt door testserum te incuberen met antigeen-gecoate microsferen. Vervolgens wordt het serum geïncubeerd met een biotinyleerde, soortspecifieke anti-immunoglobuline, die eventuele antigeen-antilichaam-immuuncomplexen detecteert.Vervolgens wordt een streptavidine-gelabelde FICO eryn Fluor force-oplossing toegevoegd om eventuele gebiotinyleerde immunoglobulinen te detecteren. De verkregen resultaten tonen een positieve of negatieve antilichaamstatus aan voor veelvoorkomende agentia in laboratoriumknagers, gebaseerd op multiplex fluorescentie, de netto score van de immunoassay en fluorescente monsterwaarden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ELISA, is dat MFIA een multiplex assay is. Hierdoor kan een onderzoeker tot honderd verschillende assays in één enkele test screenen.Deze techniek vermindert de hoeveelheid serumregio's en wegwerpmaterialen die in de bestaande methoden worden gebruikt, terwijl de hoeveelheid informatie die uit één test wordt gegenereerd, wordt verhoogd. We kregen voor het eerst het idee om deze methode te gebruiken toen we een groot aantal serummonsters testten op meerdere agentia en de arbeid en de testtijd wilden verminderen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Donna Cohen, een senior technoloog uit ons laboratorium. Zorg bij aanvang dat de twee buffers die nodig zijn voor de multiplex fluorescentie-immunoassay (MFIA)-procedure klaarstaan.De eerste is een primair verdunningsmiddel, verkrijgbaar bij Charles River, dat eigen blokkeringsmiddelen bevat om aspecifieke interacties voor de wasbuffer van de assay te verminderen. Bereid een PBS-oplossing met 1% BSA pH 7,4 om particulatele resten te verwijderen. Filtreer de buffer door een 0,2 micron bottle top unit in steriele, gelabelde containers met gebruik van de assay wasbuffer.Bereid twee x concentraties voor van gebiotineerde antispecies, IgG of BAG, en strep avidine en FICO-erytrocyten of SPE, die worden gebruikt om de antigeen-antilichaamcomplexen die tijdens de incubatiestap van het testserum zijn gevormd te labelen. Bereid monsters van de volgende materialen en wegwerpartikelen: geassembleerde multi- en enkelkanaals micropipetten en tips, en 96-wells microtiterplaten met lage eiwitbinding voor eiwitverdunning. Na het verzamelen van bloedmonsters en het isoleren van serum wordt het serum kort gevortext voordat de monsters in primaire verdunningsvloeistof in een 96-wells microtiterplaat worden verdund om een juiste en uniforme vulling van de wells te garanderen. Voorbevochtig elke well van de 96-wells testplaat met assay-wasbuffer en aspireer de oplossing gedurende de gehele assay langzaam.De aspiratie moet vijf tot 10 seconden duren om aggregatie van beads en het samendrukken van beads in het filtermembraan te voorkomen; beide kunnen de leestijden aan het einde van de assay vertragen. Controleer of de vloeistofafvoer is gestopt door de onderkant van de testplaat af te drogen met papieren handdoeken. Het is belangrijk om de testplaat na elke wasstap af te drogen om het uitknipperen van vloeistof uit de putjes tijdens de incubatie te voorkomen.Om de beads voor te bereiden, begint u met het vortexen van de stock-suspensie van de gekoppelde beads. Soniceren ze vervolgens kort in een bad. Het is cruciaal om de beads correct te resuspenderen om geaggregeerde bead-clusters te voorkomen, wat kan leiden tot langere leestijden.Dispenseer vervolgens de 20 x voorraadsuspensie in een twee x werkoplossing van beads in primaire verdunningsvloeistof. Dispenseer daarna 50 µL van de twee x bead-suspensie in elke assay-put van de vooraf bevochtigde testplaat. Pipetteer 50 µL van elk twee x test- en controleserum op de testplaat op basis van een vooraf gedefinieerde plaatkaart.Sluit het deksel van de plaat stevig. Dek deze af met aluminiumfolie en incubeer de testplaat gedurende 60 minuten op een orbitale schudmachine bij kamertemperatuur om verdamping van de oplossingen te voorkomen, wat het succes van de assay in gevaar kan brengen. Houd de testplaat tijdens alle incubatiestappen afgedekt met het plaatdeksel.Bovendien moet de schudsnelheid groter zijn dan 400, maar minder dan 700 RPM, zodat de beads in suspensie blijven en de serumantilichamen toegang hebben tot alle oppervlakken van de gekoppelde antigenen. Nadat de plaat is gewassen in opeenvolgende incubaties van de beads met BAG en SPE, moeten de monsters opnieuw worden gewassen. Resuspendeer daarna de beads door 125 µL assay-wasbuffer toe te voegen en schud gedurende twee minuten voordat de plaat wordt afgelezen.Plaats het binnen 10 minuten na het resuspenderen van de beads in de assayreader; de beads passeren één voor één een detector waarbij ze worden blootgesteld aan twee lasers. Eén laser exciteert de interne kleurstoffen die de kleurset van de beads identificeren en de andere exciteert de FICO erything reporterkleurstof. De intensiteit van de FICO erything fluorescentie voor een vooraf bepaald aantal beads wordt gerapporteerd als de FM FI; lees de eerste put uit om te verifiëren dat het geselecteerde bead-panel overeenkomt met het bead-profiel in de testputten.Als er kralen buiten hun aangewezen kralengebied op het protocolscherm vallen, is er een onjuiste profielselectie gemaakt. Kralen die correct zijn geresuspendeerd, zullen hun gespecificeerde gebieden vullen zoals aangegeven in de software van de assay-lezer. Als de kralen geaggregeerd zijn, zullen ze hun gebieden in een langzaam tempo vullen.U kunt de testplaat uit de reader halen en de wells handmatig resuspenderen om de beads te scheiden. Verwijder de testplaat uit de reader en pipetteer elke well drie tot vier keer met een multichannel pipet. Plaats de testplaat vervolgens terug in de reader en ga verder met het analyseren van de resultaten.Meld fouten zoals onvoldoende kraalentellingen of dalende IgG anti-IgG kraalscores, en herhaal de assay voor deze monsters. Nadat de gegevens naar Excel zijn geëxporteerd en de netto MFI is berekend, moet worden bepaald of er assay-controles van de test zijn mislukt, met uitzondering van het immuunserum met hoog bereik. Eventuele mislukte controles zijn onaanvaardbaar en de assay moet worden herhaald.Deze tabel bevat gegevens van testserum en assay-controles van een typische assayplaat. Alle IgG-controles waren geslaagd. De testresultaten voor deze plaat geven aan dat talrijke weefselreactieve monsters en IgG-controlemonsters niet zijn geslaagd, zoals te zien is in de oranje wells.A1C een en F1 duiden op een reactief falen van TC-weefsel waarbij de TC-score tussen haakjes wordt weergegeven; Wells B een en E een illustreren de twee typen falen van de IgG-interne controle, respectievelijk onvoldoende testantilichaam of testreagentia, BAG of SPE. De resultaten van de testplaat worden alleen geïnterpreteerd als de systeemgeschiktheidscontrole en de serumcontrole voldoen aan de hier getoonde acceptatiecriteria. Microsferen gecoat met soortspecifiek anti-testserumimmunoglobuline kunnen falende scores vertonen door de toevoeging van een onvoldoende monster, een te hoge monsterverdunning, een onjuiste soort, of testserum van een immuundeficiënte gastheer.Indien de resultaten van de test-assay-controle bevredigend zijn, worden de individuele assay-scores als volgt geclassificeerd. Na deze procedure dienen aanvullende methoden zoals Eliza, IFA en/of Western blot te worden gebruikt om de initiële onverwachte of positieve bevindingen te bevestigen. Het is cruciaal om deze resultaten te verifiëren voordat er beslissingen worden genomen over het beheer van de dieren.Dit kan worden gedaan door verschillende methodologieën toe te passen op hetzelfde monster of op aanvullende monsters van dezelfde kolonie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de multiplex fluoro-metrische immunoassay uitvoert en hoe u de in uw faciliteit behaalde resultaten interpreteert. Dit stelt u in staat om de arbeid te verminderen terwijl u meer informatie verzamelt uit elke testmonsterput.

multiplexed-fluorometric-immunoassay-testing-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source:Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company, Austin.This video demonstrates multiplexed quantitative bacterial detection employing carboxylated magnetic polystyrene microspheres dyed into distinct sets. The procedure encompasses the formation of bead-bacteria complexes, magnetic separation, and flow-based analysis, enabling precise and simultaneous quantification of multiple bacteria in the same reaction well.

Multiplexed Quantitative Bacterial Detection using Dye-Labeled Magnetic Microspheres

In het huidige klimaat van schaarse middelen, ontstaan er nieuwe technologieën die het onderzoekers mogelijk maken om studies goedkoper, sneller en met meer precisie uit te voeren. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een kralen-gebaseerde speekselantilichaam multiplex immunoassay om de blootstelling van mensen aan meerdere omgevingspathogenen gelijktijdig te meten.

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.

Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia's, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.

Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie

Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.

Gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring van vier endometriumimmuunceltypen bij terugkerende miskraam

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

Leer de multiplexed fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serosurveillance bij laboratoriumdieren. Deze methode detecteert gelijktijdig antilichamen tegen meerdere infectieuze agentia met fluorescerende microsferen.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Meer video's verkennen