Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van het gebruik van een lateral flow-apparaat voor de snelle detectie van aspergillus-diagnostisch antigeen in menselijk serum en BAL-vloeistoffen. Dit wordt bereikt door eerst het serum- of BAL-monster aan te brengen op de releaseport van het lateral flow-apparaat. De tweede stap is om de oplossing langs het membraan te laten migreren.

De volgende stap is om te bepalen of de test geldig is door de internecontrollijn te controleren. De laatste stap is het interpreteren van het testresultaat door de testlijn te bekijken. Uiteindelijk wordt het lateral flow-apparaat gebruikt om de aanwezigheid van het aspergillus-diagnostisch antigeen in serum of BAL-vloeistoffen aan te tonen.

De aspergillus LFD kan worden gebruikt als aanvullende test voor de diagnose van invasieve pulmonale aspergillose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de aspergillus, galacto, Manan enzym-immunoassay, panf, fundal, beta-glucaan assay en de aspergillus PCR-test, is dat het een snelle point-of-care diagnostische test is die minimale laboratoriumfaciliteiten en training vereist. Hoewel de LFD is ontwikkeld voor de detectie van aspergillus-soorten, kan de lateral flow-technologie ook worden toegepast op de detectie van andere infectieuze pathogenen, zoals cetosporium, fusarium en riser-soorten.

Door monoklonale antilichamen te gebruiken die specifiek zijn voor deze organismen, is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Aangezien de interpretatie van LFD-resultaten gewenning aan het assay-formaat vereist. Om serum te verkrijgen uit onbehandelde bloedmonsters, laat het bloed stollen bij 4 °C; serum en broncho-alveolaire lavage, of BAL-vloeistoffen, moeten vóór gebruik als aliquoten worden bewaard bij -20 °C. Bewaring als aliquoten beperkt de kans op degradatie van het doelantigeen door herhaaldelijk ontdooien van monsters tijdens herhaald testen. Om serum- en BAL-monsters voor testen voor te bereiden, ontdooi de monsters bij kamertemperatuur en bewaar deze vervolgens op ijs. Meng grondig door middel van vortexen en centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 14.000 RPM. Voor routineonderzoek van menselijke monsters wordt het serum één-op-één verdund met weefselkweekmedium. Om het doelantigeen alternatief te dissociëren van serum-immuuncomplexen, wordt het serum één-op-twee verdund met PBS bevatten 4% EDTA; verhit gedurende drie minuten in een kokend waterbad en centrifugeer vijf minuten bij 14.000 RPM.

Menselijke BAL-vloeistoffen vereisen geen voorbehandelingen. Een BAL-monster dat is ontdooid, gevortext en gecentrifugeerd is een zuiver monster dat direct op de lateral flow-device kan worden aangebracht. Voor het testen worden de lateral flow-devices of LFD's bewaard bij kamertemperatuur of 23 °C, waarbij ze 12 maanden stabiel blijven.

Om de analyse te starten, haalt u de apparaten uit hun verpakking en plaatst u deze op een vlak oppervlak. Breng met een steriele pipetpunt binnen enkele seconden 100 microliters voorbehandeld serum aan op de vulpoort van het apparaat. De vloeistof moet door capillaire werking langs het nitrocellulosemembraan in het observatievenster migreren.

Breng op dezelfde wijze 100 µL van een onverdund BAL-monster aan op de releaseport van het apparaat. Laat de assay 15 minuten lopen bij kamertemperatuur, waarna de testresultaten moeten worden genoteerd. De test mag niet langer dan 15 minuten duren voordat de resultaten worden geregistreerd.

Aangezien dit de interpretatie van de resultaten kan beïnvloeden, zal een zwakke reactie niet worden versterkt door de incubatieperiode te verlengen. De LFD bestaat uit een interne controlelijn, aangegeven met de letter C op de plastic behuizing, en een testlijn, aangegeven met de letter T. De controlelijn moet altijd verschijnen, ongeacht de aanwezigheid van aspergillus-antigeen in het serum of het BAL-monster. Dit toont aan dat de assay correct is verlopen indien het aspergillus-antigeen aanwezig is in het serum of het BAL-monster.

De testlijn zal ebenfalls binnen 15 minuten na toevoeging van de monsterapplicatie verschijnen. De intensiteiten van de test- en Lyme-reacties zijn proportioneel aan de concentraties van het doelantigeen in de serum- en VAL-monsters. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de interpretatie van de testresultaten.

De LFD-resultaten moeten na 15 minuten worden afgelezen en het testresultaat moet worden vergeleken met het hier getoonde representatieve voorbeeld. In deze figuur zijn representatieve voorbeelden te zien van zwak positieve, matig positieve en sterk positieve LFD-resultaten met BAL- en serummonsters. Elke positieve testlijn in het serummonster, ongeacht de intensiteit, zou wijzen op invasieve pulmonale aspergillose of IPA-ziekte vanwege de aanwezigheid van circulerend aspergillus-antigeen in de bloedbaan. Positieve BAL-reacties, ongeacht de intensiteit, zouden wijzen op kieming van sporen en de ontwikkeling van potentieel pathogene hyfen in de longen.

In de afwezigheid van aspergillus-antigeen verschijnt er geen testlijn en wordt het resultaat als negatief geregistreerd. Deze tabel toont de resultaten van LFD-tests met behulp van BAL-vloeistoffen van patiënten met acute myeloïde leukemie of ML, gediagnosticeerd volgens de diagnostische criteria van de European Organization for Research and Treatment of Cancer en de National Institute of Allergy and Infectious Diseases Study Group. In deze tabel zijn de overeenkomstige klinische en psychologische gegevens opgenomen, evenals de resultaten van een ASPERIA-specifieke PCR-test voor elke patiënt.

Volgens de E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen uit 2002 kregen patiënten 12, 13 en 16 de diagnose mogelijke IPA op basis van gastheerfactoren en klinische criteria of GM-positiviteit. Volgens de herziene E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen uit 2008 zouden gastheerfactoren en GM-positiviteit alleen, of gastheerfactoren en klinische criteria alleen, niet wijzen op een mogelijke invasieve schimmelinfectie, tenzij deze respectievelijk gepaard gingen met ondersteunend bewijs uit klinische gegevens en mycologie. Patiënt zes kreeg onder zowel de richtlijnen van 2002 als 2008 de diagnose waarschijnlijke IPA vanwege gastheerfactoren, majeure en mineure klinische kenmerken en GM-positiviteit.

Ten slotte dient te worden opgemerkt dat, hoewel noch de LFD-assay noch de PCR-assay momenteel is opgenomen in de E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen voor de BAL-monsters van patiënt zes en 12, er na het volgen van deze procedure een sterke overeenstemming is tussen beide assays en de commerciële galactomannan-test, wat duidt op de aanwezigheid van aspergillus-antigeen en nucleïnezuren. Andere methoden, zoals de Platelia Galactomannan enzyme immuno assay, panf, schimmel bèta-glucaan test of aspergillus PCR-tests, kunnen parallel worden uitgevoerd om invasieve schimmelinfecties te bevestigen. Vergeet niet dat het werken met menselijk bloedserum en BAL-vloeistoffen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat operators van het apparaat altijd gevaccineerd moeten zijn tegen ziekten zoals hepatitis B en tuberculose.I.