Name: Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een snelle laterale-flowtest voor invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische patiënten. Deze methode detecteert Aspergillus-antigenen in serum en BAL-vloeistof binnen 15 minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering van Dr Thornton van Pfizer Limited wordt dankbaar erkend.

1. Inzameling, opslag en voorbereiding van het serum en bronchoalveolaire lavagevloeistof <ol><li> Verzamelen serum van onbehandelde bloedmonsters doordat bloedstolling bij 4 ° C en opslaan serum als aliquots bij -20 ° C voorafgaande aan gebruik. Bronchoalveolaire lavage vloeistoffen (BAL) moet worden opgeslagen aliquots bij -20 ° C. Let op: Opslag van serum en BAL als aliquots het potentieel voor afbraak van het doelantigeen door herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van monsters tijdens de test herhaald beperkt. </li><li> Ontdooi monsters en meng het serum en BAL monsters door vortexen en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 rpm. </li><li> Voor routineonderzoek van humane serummonsters verdunnen serum 1:1 (v / v) met weefselkweekmedium (TCG). TCG uit RPMI-1640 medium, 10% (v / v) foetaal kalf serum, 1% (v / v) van 200 L-glutamine oplossing en natriumazide (0,02% w / v) als conserveermiddel. Het medium wordt bereid vooraf worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden. Breng 100 ul van de diluted serum om de LFD. </li><li> Voor menselijke BAL vloeistoffen, en voor BAL vloeistoffen uit dierlijke modellen, van toepassing 100 ul nette monster aan de LFD, zonder voorbehandeling. </li><li> Voor serum van diermodellen verdund serum 1:2 (v / v) met fosfaat gebufferde zoutoplossing bevattende 4% (w / v) EDTA, hitte 3min in een kokend waterbad gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 14.000 rpm en toepassing 100 ul supernatant nette de toestel LFD. </li></ol> 2. Toepassing van serum en BAL aan de laterale-flow-apparaat <ol><li> Bewaar de laterale-flow-apparaten bij kamertemperatuur (23 ° C). Bij deze temperatuur inrichtingen stabiel gedurende 12 maanden. Verwijder de apparaten uit het zakken en leg ze op een vlakke ondergrond. </li><li> Een steriele pipet van toepassing 100 ul voorbehandelde serum of als zodanig BAL monster het vrijkomen poort van de inrichting. </li><li> Laat de assay uitgevoerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, waarna de resultaten van de tests worden geregistreerd. Let op: Binnen enkele seconden de vloeistof zal zijn seen tot migratie door capillaire werking langs de nitrocellulose membraan in het kijkvenster. </li></ol> 3. Opnemen en interpreteren LFD resultaten <ol><li> De LFD bestaat uit een interne controle lijn (aangegeven met de letter C op het kunststof) en een test lijn (aangegeven met de letter T). De controle regel moet altijd, ongeacht van Aspergillus antigeen in het serum of BAL monster. Dit toont aan dat de test correct is uitgevoerd. </li><li> Als de Aspergillus antigeen aanwezig is in het serum of BAL monster, zal de test lijn verschijnen ook binnen 15 minuten van het monster applicatie. Omdat de intensiteit van de test lijn is evenredig met de hoeveelheid van Aspergillus antigeen in het monster, de test lijn kan worden weergegeven als een zwak positief (+), een gematigd positief (+ +) of een sterk positief (+ + +) . Echter, een positieve controle lijn, ongeacht intensiteit zou de aanwezigheid van Aspergillus antigeen in het monster. In ee afwezigheid van Aspergillus antigeen worden geen testlijn verschijnen, en het resultaat wordt als negatief (-). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Representatieve voorbeelden van negatieve zwak positief matige positief en sterke positieve LFD resultaten BAL en serummonsters worden in figuur 1. Resultaten van antigeen-positieve LFD tests (sterke en zwakke) of negatief LFD proeven met BAL vloeistoffen van acute myeloïde leukemie (AML) patiënten die gediagnosticeerd volgens EORTC / MSG diagnostische criteria worden getoond in Tabel 1. Inbegrepen in deze tabel zijn de bijbehorende klinische en mycologische (galactomannan en cultuur) gegevens en resultaten van een Aspergillus-specifieke PCR-test ontwikkeld aan de St. Bartholomews Ziekenhuis 8, voor elke patiënt. De diagnose van de ziekte is gebaseerd op gastheer factoren (neutropenie, langdurig gebruik van corticosteroïden, de behandeling met andere erkende T-cel immunosuppressants), klinische criteria en GM positiviteit voor de BAL (hier gedefinieerd als een GM-index waarde&gt; 0,8). Onder de 2002 EORTC / MSG richtlijnen 10, patiënten van 12, 13 en 16 werden gediagnosticeerd met &#39;mogelijk&#39; IA op basis van de gastheer factoren en klinische criteria of GM positiviteit. Volgens de herziene (2008) EORTC / MSG richtsnoeren 2, gastheer factoren en GM positiviteit alleen of gastheer factoren en klinische criteria alleen niet geven &#39;mogelijk&#39; invasieve schimmelinfectie, tenzij vergezeld van bewijsstukken van de klinische gegevens en mycologie respectievelijk. Patiënt 6 werd gediagnosticeerd met &#39;waarschijnlijk&#39; IA onder zowel 2002 en 2008 richtlijnen als gevolg van gastheer factoren, grote en kleine klinische kenmerken en GM positiviteit. Let op, dat terwijl noch de LFD of PCR-testen worden op dit moment opgenomen in EORTC / MSG richtlijnen, is er een sterke overeenkomst tussen de twee assays en de commerciële galactomannan-test wijst op de aanwezigheid van Aspergillus antigeen en nucleïnezuur in de BAL-monster<html> s patiënten 6 en 12. Bijkomende resultaten van de proeven tonen de effectiviteit van de LFD en PCR assays diagnose IPA vindt in Johnson et al. 8. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figuur 1. Negatieve (controle lijn) en positieve (controle en test lijn) resultaten van LFD tests met het serum en BAL. De intensiteit van de testlijn reacties zijn evenredig met de concentraties van de doel-antigeen in het serum en BAL monsters. Reacties typisch variëren van zwak (+) door matig (+ +) aan sterke (+ + +). Ongeacht testlijn intensiteit zou drie serum positieve reacties vermeld invasieve pulmonale ziekte aspergillose door de aanwezigheid van circulerende Aspergillus antigeen in de bloedstroom. Positieve BAL reacties (zwak, matig of sterk) zou wijzen op ontkieming van sporen en de ontwikkeling van potentieel pathogene hyfen in de longen. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Patiënt niet. </td><td> PatiENT informatie </td><td> Klinische criteria 1 </td><td> BAL cultuur 2 </td><td> GM MER-index 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR-resultaat </td><td> LFD resultaat </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Major CT tekenen (nodule en halo) en een kleine </td><td> Negatief </td><td> 0,9 (positief) </td><td> Waarschijnlijk </td><td> Waarschijnlijk </td><td> Positief </td><td> Zwak positief (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Verondersteld vorige schimmelinfectie </td><td> Geen grote, een kleine </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (sterk positief) </td><td> Mogelijk </td><td> Geen </td><td> Positief </td><td> Sterk positief (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Coagulase-negatieve stafylokokylococcus en E. coli in bloed </td><td> Geen grote, twee kleine </td><td> Negatief </td><td> 0,25 (negatief) </td><td> Mogelijk </td><td> Geen </td><td> Negatief </td><td> Negatieve (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Borst infectie </td><td> 3 minder belangrijke criteria, waaronder nieuwe infiltreren plus meervoud effusie </td><td> Negatief </td><td> 0,16 (negatief) </td><td> Mogelijk </td><td> Geen </td><td> Negatief </td><td> Negatieve (-) </td></tr></tbody></table> 1 knobbeltjes of halo&#39;s op een CT-scan is suggestief voor schimmelinfectie 2 Candida glabrata in BAL-vloeistof zou worden beschouwd als zijnde een verontreiniging als het is de tweede meest voorkomende geïsoleerde gist, als onderdeel van de normale menselijke flora 9 3 Een index van&gt; 0,8 in de GM EIA-test van de BAL is een indicatie van Aspergillus-infectie 4 Gebaseerd op de 2002 EORTC / MSG diagnostische criteria voor &#39;mogelijk te bedienene &#39;,&#39; waarschijnlijk &#39;of&#39; bewezen &#39;invasieve schimmelziekte 10 5 Op basis van de herziene (2008) EORTC / MSG diagnostische criteria voor &#39;mogelijk&#39;, &#39;waarschijnlijk&#39; of &#39;bewezen&#39; invasieve schimmelziekte 2 Tabel 1. Resultaten van LFD tests van BAL monsters van acute myeloïde leukemie patiënten met een waarschijnlijke IPA en van de controle AML patiënten (geen bewijs van infectie), en de EORTC / MSG diagnose van de infectie.

<ol><li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive aspergillosis.</a> Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).</li>
<li>De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+definitions+of+invasive+fungal+disease+from+the+European+Organization+for+Research+and+Treatment+of+Cancer%2FInvasive+Fungal+Infections+Cooperative+Group+and+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+Mycology+Study+Group+%28EORTC%2FMSG%29+concensus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+emerging+human+pathogen+Pseudallescheria+boydii+by+using+highly+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).</li>
<li>Pickering, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assay+for+diagnosis+of+invasive+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immunochromatographic+lateral-flow+device+for+rapid+serodiagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).</li>
<li>Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+with+galactomannan+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Issues with galactomannan testing.</a> Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).</li>
<li>Wiederhold, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lateral+flow+technology+and+galactomannan+and+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assays+for+detection+of+invasive+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).</li>
<li>Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspergillus+in+broncho-alveolar+lavage+fluid+using+two+biological+assays%3B+evidence+of+active+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection.</a> Mycoses. 54, Suppl 2. 130-131 (2011).</li>
<li>Malani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata+fungemia%3A+experience+in+a+tertiary+care+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre.</a> Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).</li>
<li>Ascioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infection+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+concensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus.</a> Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).</li>
<li>Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Early diagnosis of invasive aspergillosis.</a> Lancet. 355, 423-424 (2000).</li>
<li>Greene, R., Shibuya, K., Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+R+%22Aspergillus+fumigatus+and+Aspergillosis%22">Aspergillus fumigatus and Aspergillosis</a>. Latge, J. -P., Steinbach, W. J. , ASM Press. 353-363 (2009).</li>
<li>Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Aspergillus+antigen+detection+in+specimens+other+than+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).</li>
<li>Iweala, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+diagnostic+tests%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">HIV diagnostic tests: an overview.</a> Contraception. 70, 141-147 (2004).</li>
<li>Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+performance+of+a+rapid%2C+lateral+flow+assay+for+the+detection+of+antibodies+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acquir.+Immune+Defic.+Syndr%22%5BJournal%5D)">Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).</li>
<li>Moody, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnostic+tests+for+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnostic tests for malaria parasites.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).</li>
<li>Parkash, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+lateral+flow+test+for+the+detection+of+leprosy+patients+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India.</a> J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).</li>
<li>Sharma, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lateral-flow+Clostridium+botulinum+neurotoxin+detection+kits+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).</li>
<li>Smits, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral-flow+assay+for+rapid+serodiagnosis+of+human+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).</li>
<li>Faulstich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaulstich%2C+K+%22Lateral+Flow+Immunoassay%22">Lateral Flow Immunoassay</a>. Wong, R., Tse, H. , Humana Press. 157-185 (2009).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De definitieve identificatie van IPA kan pas echt worden bereikt door isolatie van de etiologische middel van biopsie monsters, maar het herstel van monsters die is vaak niet mogelijk bij erg zieke patiënten en Aspergillus is zelden vergoeding in aanmerking komen uit het bloed. Terwijl de grote vooruitgang geboekt in het gebruik van de berekende tomografische het scannen van de kist in IPA diagnose, kenmerken die wijzen op pulmonale IPA zoals het &quot;halo&quot; of &quot;air-halve maan&quot; tekenen zijn of van voorbijgaande aard of kunnen worden toegeschreven aan de ademhaling artefacten of schimmelinfecties 11,12. Deze gegevens worden daarom aangevuld met serologische technieken die gericht zijn op handtekening moleculen (GM-en β-glucan) identificeren van schimmels die circuleren in het serum van de patiënt of die aanwezig zijn in BAL vocht, sputum of urinemonsters 13. Hoewel deze tests weer te geven voldoende gevoeligheid, zij niet over voldoende specificiteit of last heeft van interferentie onder bepaalde voorwaarden 1,6 </sup&gt;. De LFD-test voor detectie IPA hier gepresenteerde kan de &#39;point-of-care&#39; diagnostiek van IPA en exploits technologie die is gebruikt om in tests op heden voor de detectie van virussen, bacteriën, parasieten en toxines 14-19 en, zoals bekend, voor het huis zwangerschap test voor het eerst geïntroduceerd door Unipath in 1988. In de Aspergillus LFD hier beschreven, wordt de Aspergillus-specifieke MAb JF5 geïmmobiliseerd op een opname zone (de test lijn) op een poreuze nitrocellulose membraan. Anti-muis immunoglobuline geïmmobiliseerd op het membraan in een aparte zone diende als een interne controle (controlelijn). Bij toevoeging van serum of BAS vloeistof de introductie poort MAb JF5-conjugaat in het vrijkomen pad bindt aan het doelantigeen en complexer dan passeert langs het poreuze membraan door capillaire werking. MAb JF5 geïmmobiliseerd in de vangst zone bindt aan de JF5-colloïdaal goud-antigen complex met als gevolg een rode testlijn. Elke niet-gebonden JF5-colloïdaal goudconjugaat bindt aan de interne controle te geven dat de test correct is uitgevoerd. Dit resulteert in een rode stuurleiding. De test is snel, het nemen van slechts 15 minuten uit te voeren, is goedkoop in vergelijking met serum en BAL tests op basis van GM en de β-glucan detectie, en vereist geen dure apparatuur of uitgebreide laboratoriumfaciliteiten te lopen. Bovendien heeft MAb JF5 geen kruisreactie met de drugs of verontreinigende stoffen waarvan is aangetoond dat tot vals-positieve reactie in de GM-en β-glucan testen 1,4,6 veroorzaken. Een bijkomend groot voordeel ten opzichte van de huidige diagnostische tests is de LFDs mogelijkheid om activiteiten die een indicatie van invasieve groei van Aspergillus soorten op te sporen. Een kritische stap in de LFD procedure is de noodzaak om te lezen van de resultaten 15 min na het aanbrengen van het serum of BAL monster naar het apparaat. De test moet niet langer dan 15 min voor het opnemen van de resultaten, omdat dit een vertekend beeld van resultaat interpretatiop. Een zwakke reacties niet worden versterkt door verlenging van de incubatietijd. Warmtebehandeling van serum van diermodellen van infectie is gebleken testgevoeligheid verbeteren. Een beperking van de test is dat het kwalitatief is, en is afhankelijk van de operator om een ​​subjectieve beoordeling van positiviteit te maken. De intensiteit van de test lijn afhankelijk van het antigeen inhoud van serum en BAL monsters (figuur 1). Echter, een positieve reactie (bepaald in vergelijking met bekende negatieven) geeft de aanwezigheid van Aspergillus antigeen en derhalve infectie. Om de subjectiviteit van LFD testen te beperken, hand-held apparaten beschikbaar die het mogelijk maken kwantificering van LFD testlijn intensiteiten en kan de vaststelling van drempelwaarden voor antigeendetectie 20. Toekomstige ontwikkelingen van de LFD zijn onder meer de commercialisering en de ontwikkeling van een multiplex LFD dat simultane detectie van andere invasieve pathogene schimmels kunnenmet zeer specifieke MAbs 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Universiteit van Exeter </td><td></td><td> Verkrijgbaar bij de corresponderende auteur op aanvraag </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Andere bronnen van foetaal kalfsserum worden gebruikt bij de bereiding van TCG </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasieve aspergillose pulmonale (IPA) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij hematologische maligniteit patiënten en hematopoietische stamceltransplantatie afnemers 1. Detectie van IPA staat voor een enorme diagnostische uitdaging en, bij gebreke van een &#39;gouden standaard&#39;, is gebaseerd op een combinatie van klinische gegevens en de microbiologie en de histopathologie waar mogelijk. De diagnose van IPA moet voldoen aan de Europese Organisatie voor Onderzoek en behandeling van kanker en het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten Mycologie Study Group (EORTC / MSG) consensus definitie van &quot;bewezen&quot;, &quot;waarschijnlijk&quot;, en &quot;mogelijk&quot; invasieve schimmelinfecties 2 . Momenteel zijn er geen op nucleïnezuur gebaseerde tests zijn extern gevalideerd voor IPA-detectie en zo polymerase chain reaction (PCR) is niet opgenomen in de huidige EORTC / MSG diagnostische criteria. Identificatie van Aspergillus in histologische coupes is problematisch omdat van Simimatigheden in hyphal morfologie met andere invasieve pathogene schimmels 3, en bewezen identificatie vereist isolatie van de etiologische agent in zuivere cultuur. Cultuur-gebaseerde benaderingen afhankelijk van de beschikbaarheid van biopsiemonsters, maar deze zijn niet altijd toegankelijk bij zieke patiënten, en niet altijd opleveren levensvatbare propagulen voor cultuur wanneer het verkregen. Een belangrijk kenmerk in de pathogenese van Aspergillus is angio-invasie, een eigenschap die mogelijkheden om de schimmel immunologisch te volgen met behulp van tests die kenmerkende antigene handtekeningen moleculen te detecteren in het serum en bronchoalveolaire lavage (BAL) vocht levert. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van de Platelia enzymimmunoanalyse (GM-mer) die Aspergillus galactomannan en een pan-schimmel &#39;assay (Fungitell test) dat het geconserveerde schimmel celwandcomponent detecteert (1 → 3)-β-D-detecteert glucan, maar niet in de mucorales deze component in de celwanden 1,4 ontbreekt. Isklaagt rond de nauwkeurigheid van deze testen 1,4-6 heeft geleid tot de recente ontwikkeling van de volgende generatie monoklonale antilichaam (Mab)-gebaseerde testen die surrogaat-markers van infectie 1,5 op te sporen. Thornton 5 Onlangs beschreef het genereren van een Aspergillus-specifieke Mab (JF5) met behulp van hybridoma-technologie en het gebruik van een immuno-chromatografische laterale-flow-apparaat (LFD) voor de point-of-care (POC) diagnose van IPA te ontwikkelen. Een groot voordeel van de LFD is de mogelijkheid om te detecteren, omdat MAb JF5 bindt aan een extracellulair glycoproteïne antigeen dat wordt uitgescheiden tijdens actieve groei van de schimmel slechts 5. Dit is een belangrijke overweging bij het ​​gebruik van vloeistoffen, zoals long-BAL voor het diagnosticeren van IPA, omdat Aspergillus sporen zijn een gemeenschappelijke component van de ingeademde lucht. Het nut van het apparaat in het diagnosticeren van IPA is aangetoond met behulp van een diermodel van infectie, waar de LFD weergegeven verbeterde gevoeligheid en specificity opzichte van de Platelia GM en Fungitell (1 → 3)-β-D-glucanen assays 7. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om LFD Aspergillus antigeen te detecteren in menselijk serum en BAL vloeistoffen. De snelheid en nauwkeurigheid biedt een nieuwe adjunct point-of-care test voor de diagnose van het IPA in hematologische maligniteit patiënten.

Een snelle en accurate point-of-care test voor invasieve pulmonale aspergillose wordt gepresenteerd. Het maakt gebruik van laterale-flow technologie met een specifiek monoklonaal antilichaam dat bindt aan een<em&gt; Aspergillus</em&gt; Antigeen uitgescheiden tijdens longinfecties. De test is compatibel met serum en brochoalveolar lavage en vertegenwoordigt een nieuwe adjunct-test voor de diagnose van de ziekte.

Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Invasieve pulmonale aspergillose (IPA) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met hematologische maligniteiten en na een hematopoëtische stamceltransplantatie...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van het gebruik van een lateral flow-apparaat voor de snelle detectie van aspergillus-diagnostisch antigeen in menselijk serum en BAL-vloeistoffen. Dit wordt bereikt door eerst het serum- of BAL-monster aan te brengen op de releaseport van het lateral flow-apparaat. De tweede stap is om de oplossing langs het membraan te laten migreren.De volgende stap is om te bepalen of de test geldig is door de internecontrollijn te controleren. De laatste stap is het interpreteren van het testresultaat door de testlijn te bekijken. Uiteindelijk wordt het lateral flow-apparaat gebruikt om de aanwezigheid van het aspergillus-diagnostisch antigeen in serum of BAL-vloeistoffen aan te tonen.De aspergillus LFD kan worden gebruikt als aanvullende test voor de diagnose van invasieve pulmonale aspergillose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de aspergillus, galacto, Manan enzym-immunoassay, panf, fundal, beta-glucaan assay en de aspergillus PCR-test, is dat het een snelle point-of-care diagnostische test is die minimale laboratoriumfaciliteiten en training vereist. Hoewel de LFD is ontwikkeld voor de detectie van aspergillus-soorten, kan de lateral flow-technologie ook worden toegepast op de detectie van andere infectieuze pathogenen, zoals cetosporium, fusarium en riser-soorten.Door monoklonale antilichamen te gebruiken die specifiek zijn voor deze organismen, is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Aangezien de interpretatie van LFD-resultaten gewenning aan het assay-formaat vereist. Om serum te verkrijgen uit onbehandelde bloedmonsters, laat het bloed stollen bij 4 °C; serum en broncho-alveolaire lavage, of BAL-vloeistoffen, moeten vóór gebruik als aliquoten worden bewaard bij -20 °C. Bewaring als aliquoten beperkt de kans op degradatie van het doelantigeen door herhaaldelijk ontdooien van monsters tijdens herhaald testen. Om serum- en BAL-monsters voor testen voor te bereiden, ontdooi de monsters bij kamertemperatuur en bewaar deze vervolgens op ijs. Meng grondig door middel van vortexen en centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 14.000 RPM. Voor routineonderzoek van menselijke monsters wordt het serum één-op-één verdund met weefselkweekmedium. Om het doelantigeen alternatief te dissociëren van serum-immuuncomplexen, wordt het serum één-op-twee verdund met PBS bevatten 4% EDTA; verhit gedurende drie minuten in een kokend waterbad en centrifugeer vijf minuten bij 14.000 RPM.Menselijke BAL-vloeistoffen vereisen geen voorbehandelingen. Een BAL-monster dat is ontdooid, gevortext en gecentrifugeerd is een zuiver monster dat direct op de lateral flow-device kan worden aangebracht. Voor het testen worden de lateral flow-devices of LFD's bewaard bij kamertemperatuur of 23 °C, waarbij ze 12 maanden stabiel blijven.Om de analyse te starten, haalt u de apparaten uit hun verpakking en plaatst u deze op een vlak oppervlak. Breng met een steriele pipetpunt binnen enkele seconden 100 microliters voorbehandeld serum aan op de vulpoort van het apparaat. De vloeistof moet door capillaire werking langs het nitrocellulosemembraan in het observatievenster migreren.Breng op dezelfde wijze 100 µL van een onverdund BAL-monster aan op de releaseport van het apparaat. Laat de assay 15 minuten lopen bij kamertemperatuur, waarna de testresultaten moeten worden genoteerd. De test mag niet langer dan 15 minuten duren voordat de resultaten worden geregistreerd.Aangezien dit de interpretatie van de resultaten kan beïnvloeden, zal een zwakke reactie niet worden versterkt door de incubatieperiode te verlengen. De LFD bestaat uit een interne controlelijn, aangegeven met de letter C op de plastic behuizing, en een testlijn, aangegeven met de letter T. De controlelijn moet altijd verschijnen, ongeacht de aanwezigheid van aspergillus-antigeen in het serum of het BAL-monster. Dit toont aan dat de assay correct is verlopen indien het aspergillus-antigeen aanwezig is in het serum of het BAL-monster.De testlijn zal ebenfalls binnen 15 minuten na toevoeging van de monsterapplicatie verschijnen. De intensiteiten van de test- en Lyme-reacties zijn proportioneel aan de concentraties van het doelantigeen in de serum- en VAL-monsters. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de interpretatie van de testresultaten.De LFD-resultaten moeten na 15 minuten worden afgelezen en het testresultaat moet worden vergeleken met het hier getoonde representatieve voorbeeld. In deze figuur zijn representatieve voorbeelden te zien van zwak positieve, matig positieve en sterk positieve LFD-resultaten met BAL- en serummonsters. Elke positieve testlijn in het serummonster, ongeacht de intensiteit, zou wijzen op invasieve pulmonale aspergillose of IPA-ziekte vanwege de aanwezigheid van circulerend aspergillus-antigeen in de bloedbaan. Positieve BAL-reacties, ongeacht de intensiteit, zouden wijzen op kieming van sporen en de ontwikkeling van potentieel pathogene hyfen in de longen.In de afwezigheid van aspergillus-antigeen verschijnt er geen testlijn en wordt het resultaat als negatief geregistreerd. Deze tabel toont de resultaten van LFD-tests met behulp van BAL-vloeistoffen van patiënten met acute myeloïde leukemie of ML, gediagnosticeerd volgens de diagnostische criteria van de European Organization for Research and Treatment of Cancer en de National Institute of Allergy and Infectious Diseases Study Group. In deze tabel zijn de overeenkomstige klinische en psychologische gegevens opgenomen, evenals de resultaten van een ASPERIA-specifieke PCR-test voor elke patiënt.Volgens de E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen uit 2002 kregen patiënten 12, 13 en 16 de diagnose mogelijke IPA op basis van gastheerfactoren en klinische criteria of GM-positiviteit. Volgens de herziene E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen uit 2008 zouden gastheerfactoren en GM-positiviteit alleen, of gastheerfactoren en klinische criteria alleen, niet wijzen op een mogelijke invasieve schimmelinfectie, tenzij deze respectievelijk gepaard gingen met ondersteunend bewijs uit klinische gegevens en mycologie. Patiënt zes kreeg onder zowel de richtlijnen van 2002 als 2008 de diagnose waarschijnlijke IPA vanwege gastheerfactoren, majeure en mineure klinische kenmerken en GM-positiviteit.Ten slotte dient te worden opgemerkt dat, hoewel noch de LFD-assay noch de PCR-assay momenteel is opgenomen in de E-O-R-T-C-M-S-G-richtlijnen voor de BAL-monsters van patiënt zes en 12, er na het volgen van deze procedure een sterke overeenstemming is tussen beide assays en de commerciële galactomannan-test, wat duidt op de aanwezigheid van aspergillus-antigeen en nucleïnezuren. Andere methoden, zoals de Platelia Galactomannan enzyme immuno assay, panf, schimmel bèta-glucaan test of aspergillus PCR-tests, kunnen parallel worden uitgevoerd om invasieve schimmelinfecties te bevestigen. Vergeet niet dat het werken met menselijk bloedserum en BAL-vloeistoffen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat operators van het apparaat altijd gevaccineerd moeten zijn tegen ziekten zoals hepatitis B en tuberculose.I.

detection-invasive-pulmonary-aspergillosis-haematological-malignancy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een protocol om antifungale activiteit van primaire menselijke immuuncellen te beoordelen in real-time met behulp van fluorescente Aspergillus reporter conidia in combinatie met live-cell video microscopie en flowcytometrie. Gegenereerde data inzicht in gastheer Aspergillus cel-interacties zoals fungicide werking, fagocytose, celmigratie remming van de schimmelgroei.

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Hier beschrijven we een protocol om te bepalen van pulmonaire schimmel last in muizen met invasieve aspergillose door kwantificering van Gomori van gemodificeerde methanamine zilver kleuring in histologische secties. Gebruik van deze methode resulteerde in vergelijkbare resultaten met minder dieren in vergelijking met de beoordeling van schimmel last van kwantitatieve PCR van longkanker schimmel DNA.

Histologische kwantificering te bepalen van de schimmel last long in experimentele aspergillose

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.

Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong

Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.

Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde methode op basis van een microfluidische chip en LAMP, die point-of-care detectie mogelijk maakt van 15 pathogenen die lagere luchtweginfecties veroorzaken bij IC-patiënten binnen één uur.

Snelle point-of-care detectie van pathogenen voor infecties van de onderste luchtwegen bij IC-patiënten

We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Dit protocol beschrijft in het bijzonder de winning van het totaal IgY uit eidooier door middel van polyethyleenglycol neerslag en geeft algemene informatie over IgY technologie.

IgY Technologie: Extractie van Antilichamen Kip uit eidooier door polyethyleenglycol (PEG) Neerslag

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte...

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Leer een snelle laterale-flowtest voor invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische patiënten. Deze methode detecteert Aspergillus-antigenen in serum en BAL-vloeistof binnen 15 minuten.

Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Meer video's verkennen