Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Deze video demonstreert een protocol voor de isolatie en fenotypische karakterisering van hematopoëtische progenitorcellen met behulp van scheiding op basis van magnetische beads en fluorescence activated cell sorting. Eerst worden het achterpootje, het femur, de tibia en het ruggenmerg gedisseceerd uit een muis en gehomogeniseerd om een beenmergcel-suspensie te genereren. De populatie wordt vervolgens verrijkt met cellen die C kit tot expressie brengen met behulp van een stroom van magnetische microbeads.

Cytometrische analyse van de verrijkte populatie toont aan dat deze methode zeer gezuiverde hematopoëtische lijnen, progenitoren en hematopoëtische stamcellen oplevert, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vitro en in vivo functionele studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals bone flushing, is dat het een efficiëntere en snellere terugwinning van beenmergcellen mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van ontsteking, auto-immuniteit, immunodeficiënties, degeneratieve ziekten, metabole stoornissen en kanker-immuunmodellen, omdat het de fenotypische karakterisering en ex vivo functionele analyse van hematopoëtische progenitoren mogelijk maakt.

Deze methode kan dus inzicht bieden bij het monitoren van hematopoëse onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Het kan ook worden gebruikt om de celbiologische signaaltransductie en de ontwikkelingsgestuurde genexpressie in specifieke progenitor-subsets te bestuderen. Begin met het plaatsen van een geëuthanaseerde muis in een roestvrijstalen pan.

Besproei de buik en rug met 70% ethanol om de botten te verzamelen die als celbron zullen dienen. Gebruik een schaar om twee kleine openingen in de huid bij de achterpoten te maken; ontwricht vervolgens het dijbeen met behulp van een pincet, draai de muis om en snijd de huid in de lengte open. Verwijder de wervelkolom om deze bloot te leggen.

Verwijder vervolgens met een scherppuntige schaar voorzichtig alle resten van zacht weefsel van de wervelkolom. Gebruik gaas om weefselresten van het femur en de tibia te verwijderen.

Plaats de botten vervolgens in een conische buis van 50 milliliter met 30 milliliter aangevuld RPMI.Medium. Plaats enkele steriele filters van vier vijfde in een steriele vijzel. Draag de botten vervolgens met een pincet over naar de vijzel en bedek ze met een andere laag filters om een wrijvingsvlak te creëren.

Plaats vervolgens een cellenfilter van 40 micron in een conische buis van 50 milliliter. Verbrijzel daarna de botten met een stamper totdat een homogene cellsuspensie is verkregen. Breng de suspensie vervolgens met een pipet over in het cellenfilter.

Voeg vervolgens vijf milliliter vers aangevuld RPMI toe aan de vijzel om de resterende cellen te wassen en te oogsten door herhaaldelijk op te zuigen en uit te stoten met een pipet. Voeg daarna het RPMI toe aan de buis met het filter. Herhaal de laatste twee stappen totdat de gehomogeniseerde botten helder lijken.

Zodra de oplossing door het filter is gegaan, brengt u deze over naar een nieuwe buis van 50 milliliter en filtert u deze opnieuw om het resterende weefseldebris te verwijderen. Centrifugeer de buis bij 500 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat het celpellet niet wordt verstoord.

De volgende stap van de procedure is het karakteriseren van de fenotypes van hematopoëtische progenitorcellen. Begin met het resuspenderen van het celpellet van elke muis in 15 milliliters PBS en 2%FBS. Centrifugeer de buis vervolgens bij 500 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie.

Verstoor de pellet niet. Resuspendeer de pellet in vijf milliliters PBS en 2%FBS en tel de cellen met een hemocytometer. Zodra de celconcentratie is bepaald, brengt u 100 µL van de cellen over naar elke put van een 96-wells ronde bodemplaat.

Centrifugeer de plaat vervolgens 5 minuten bij 500 ×g. Bereid tijdens het centrifugeren een mengsel voor van monoklonale antilichamen tegen de hier vermelde oppervlaktemarkers in PBS en 2% FBS om de cellen te kleuren. Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u het supernatant door de plaat om te keren en voegt u 50 µL van het antilichaammengsel toe aan elke well.

Gebruik vervolgens een meerkanaals pipet om door op en neer te pipetteren de cellen te dissociëren tot enkelcel-suspensies. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 °C. Was de cellen na de incubatie tweemaal met 150 µL PBS en 2% FBS. Centrifugeer de plaat vervolgens bij 500 ×g gedurende vijf minuten.

Verwijder vervolgens de senna door de plaat om te keren. Voeg daarna 50 µL verdunde 1:300 AP three size seven streptavidine in PBS met 2% FBS toe aan elke put en dissocieer deze door middel van pipetteren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in het donker bij 4 °C na de incubatie.

Was de cellen tweemaal met 150 µL PBS en 2% FBS. Na het centrifugeren van de plaat wordt het supernatant verwijderd en worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 100 µL PBS en 2% FBS; analyseer de monsters vervolgens via cytometrie. Om vervolgens geselecteerde subpopulaties hematopoëtische cellen te sorteren, wordt magnetische verrijking uitgevoerd op het beenmerg om secret-positieve cellen te verrijken. Suspendeer de celpellet van beenmerg afkomstig van ten minste 10 muizen in 1 mL bufferoplossing die C-kit monoklonaal antilichaam bevat, geconjugeerd aan PC en verdund 1:50.

Incubeer de cellen na de incubatie gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Was de cellen tweemaal met 40 milliliter buffersolution. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant door aspiratie.

Voeg vervolgens 50 µL anti-A PC microbeads per muis direct toe aan het pellet. Meng goed en incubeer 20 minuten in het donker bij 4 °C, gevolgd door de incubatiewasstappen en centrifugeer de cellen zoals voorheen. Resuspendeer het celpellet vervolgens in 4 mL buffersolution. Plaats voor elke drie muizen MaxLS-kolommen in het magnetische veld van een geschikte Max Separator.

Bereid de kolommen voor door ze te spoelen met vier liter bufferoplossing. Breng vervolgens de celsuspensie aan en vang de ongemerkte cellen die passeren op in een opvangbuis. Was de kolom drie keer met vier liter bufferoplossing.

Voeg nieuwe buffer toe wanneer het kolomreservoir leeg is. Zodra de volledige oplossing is doorgelopen, wordt het doorstroomvolume weggegooid; verwijder de kolommen uit de separator en plaats elke kolom bovenop een conische buis van 15 milliliter. Pipetteer vier milliliter bufferoplossing op elke kolom en spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk uit door de zuiger in de kolom te duwen.

Centrifugeer de buisjes bij 500 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig via aspiratie. Resuspendeer elk pellet in één milliliter bufferoplossing en voeg de pellets samen in één conische buis van 15 milliliter.

Zodra de sea kit-positieve celpopulatie is verrijkt, worden de cellen gekleurd en gesorteerd op basis van feiten. Hematopoëtische progenitoren en hematopoëtische stamcellen uit een beenmergsuspensie, verrijkt voor sea kit-positieve cellen met behulp van magnetische kralen en LT HSC en THSC, werden gesorteerd op basis van de expressie van oppervlaktemoleculen zoals beschreven in deze video. Deze figuur toont een voorbeeld van de elektronische gating-procedure om common lymphoid progenitors te scoren als linin.

Zie de low interleukin seven R positieve cellen. Lin minus see it positieve scar one positieve en linin see kit positieve scar one. Low cellen uit de SEE kit positieve gate.

Gemeenschappelijke myeloïde progenitoren worden geïdentificeerd als FC gamma R.Low CD 34 positieve cellen. Ook vanuit de C kit positieve gate worden granulocyt-monocyt progenitoren geïdentificeerd als FC gamma are high CD 34 positieve cellen en megakaryocyt-erytrocyt progenitoren als FC gamma are low CD 34 negatieve cellen. Vanuit de LKS worden L-T-H-S-C en S-T-H-S-C respectievelijk geïdentificeerd als CD 34 negatieve en CD 34 positieve cellen. Zo worden twee verrijkte en hooggezuiverde populaties verkregen die fysiologisch in geringe aantallen aanwezig zijn, om de impact van auto-immuniteit op de hematopoëse van HSC's uit controlemuizen en muizen met inflammatoire darmziekte te onderzoeken.

Er is gekleurd met KI 67-antilichaam en DPI, zoals hier te zien is. Cyclerende cellen zijn nauwelijks, indien überhaupt, detecteerbaar in het LKS CD 34-negatieve hematopoëtische stamcelcompartiment van gezonde controles. In contrast hiermee is dezelfde celpopulatie significant verhoogd tijdens IBD en wordt een aanzienlijk aantal HSC's gedetecteerd in de SG 2M-fasen van de celcyclus.

Dit suggereert dat T-cel-gemedieerde chronische ontsteking de intrede van HSC's in de celcyclus bepaalt. Om de aanwezigheid van ATP opgeslagen in blaasjes te beoordelen, werden CD 34-negatieve cellen van gezonde muizen gekleurd met de nucleotide-bindende verbinding kinine; analyse via live-cell confocale microscopie met Nuclear Red onthult dat in HSC's, maar niet in GMP's, kinine-positieve blaasjes zichtbaar zijn in het cytoplasma. Om vast te stellen of HSC's reageren op extracellulaire ATP, werd de calciumrespons van gesorteerde hematopoëtische stamcellen geladen met 4 0 2 en gestimuleerd met ATP en ionomycine geanalyseerd, zoals hier te zien is. Sporen van calciumstijging in individuele cellen geven aan dat er een toename was van cytosolisch calcium in LT HSC door activatie van pure anergische P2-receptoren.

Bij blootstelling aan een TP, aangezien cytosolische calciumverhogingen de afgifte van vesiculair ATP induceren. Dit experiment suggereert dat een TP zijn eigen afgifte uit HSC's kan reguleren en demonstreert dat deze procedure kan worden gebruikt voor functionele studies van HSC's. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe neurone topo stamcellen en lineage-gecommitteerde progenitoren kunnen worden geïsoleerd voor functionele assays. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals reconstitutie van niet-bestraalde recipiënte muizen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het reconstitutiepotentieel van hematopoëtische stamcellen gezuiverd uit een C-toestand of een inflammatoire omgeving.