Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van image stream-technologie aan te tonen voor het kwantificeren van cellulaire mechanismen van primaire immuuncellen uit goed gedefinieerde patiëntcohorten. Dit wordt bereikt door eerst perifere mononucleaire bloedcellen of pbmc te isoleren uit bloedmonsters die zijn verkregen van patiënten of gezonde vrijwilligers. Na isolatie worden de cellen geactiveerd en vervolgens fluorescent gelabeld.

Vervolgens worden de cellen hydrodynamisch gefocust, geëxciteerd met laserlicht en afgebeeld met time-delay integration. CCD-camera. Ten slotte worden de beelden verkregen met de image stream cytometer en volgt de kwantificering van NF kappa b.

Translocatie in elke cellulaire afbeelding wordt uitgevoerd met de ideas-software. Uiteindelijk kunnen de verschillen tussen elke proefpersoonsgroep worden bepaald door analyse van dotplots, histogrammen en celafbeeldingen. Het voordeel van de imagestroom is dat het feiten en immunofluorescentie combineert.

We zijn in staat om cel-signaleringsroutes op een lineage-specifieke manier te bestuderen, zowel op single-cell- als populatieniveau, beginnend met slechts een kleine bloedmonster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale wetenschappelijke vragen door signaleringsintermediairen te lokaliseren en te kwantificeren. Zo kan het bijvoorbeeld worden gebruikt om de actie-gemedieerde nucleaire translocatie van transcriptiefactoren te onderzoeken of om de effecten van veroudering op de celbiologie te bestuderen.

Een medewerker van mijn laboratorium demonstreert de techniek na het isoleren van perifere mononucleaire bloedcellen die zijn verkregen van menselijke vrijwilligers. Resuspendeer de teruggewonnen pBMC's op een concentratie van 3 × 10⁶ cellen per 0,6 ml medium en breng de celsuspensie vervolgens over in 1,5 ml buisjes. Stimuleer daarna een deel van de cellen met een activerend agens, zoals het hier getoonde TLR8-agonist R848, en incubeer vervolgens alle cellen gedurende 10 tot 60 minuten bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.

Pellet na de incubatieperiode de cellen gedurende vijf minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en label de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C met een cocktail van oppervlakte-antilichamen specifiek voor monocyten- of DC-lijnen, inclusief buisjes met cellen gelabeld met enkelvoudige kleurconjugaten om als compensatiecontroles te dienen. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA in PBS. Na het centrifugeren van de cellen gedurende 10 minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur, worden de PBMC resuspendreerd in vriesbuffer en worden de cellen bewaard bij -80 °C tot de dag van de analyse.

Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C en permeabiliseer ze vervolgens met 100 µL BD perm wash buffer na centrifugatie om de vriesbuffer te verwijderen. Label ze daarna gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met antilichamen tegen intracellulaire signaalcomponenten, zoals de hier getoonde anti NF kappa BP 65-antilichamen. Resuspendeer de cellen na het pelleten in 100 µL BD perm wash buffer die geiten anti-rabbit IgG bevat.

Alexa 6 47 en incubeer de pbmc nog 20 minuten bij kamertemperatuur. Zet de cellen direct voor het imagen tegen met een kernkleuring; begin met het inschakelen van ImageStream en start vervolgens de Inspire-software op. Klik daarna op 'load default template' en selecteer vervolgens 'initialize fluidics'.

Klik vervolgens op het menu van de afbeeldingsgalerij en selecteer alles. Druk nu op 'run set up' om te beginnen met het afbeelden van de beads en selecteer daarna het bright field-kanaal. Zodra de speed beads lopen, klikt u onder het tabblad 'assist' op 'start all' om het instrument te kalibreren en te testen.

Nadat het ImageStream-systeem is gekalibreerd, drukt u op flush, lock and load om het helderste monster in het apparaat te laden. Stel vervolgens de lasersterkte zo in dat elke fluorochroom een maximale pixelwaarde heeft tussen de 104.000 counts, zoals gemeten in de dot plots. Stel daarna de criteria voor de celclassificatie in.

Klik nu op 'run, acquire' om de experimentele datafile te verzamelen en op te slaan. Om de datafiles te analyseren, opent u eerst de analyse-software. Maak gecompenseerde image-files aan en selecteer vervolgens de events met een normale nucleaire kleurintensiteit en een hoge nucleaire kleur-aspectratio. Om enkelvoudige cellen in de R1-gate te onderscheiden van debris of multicellular events, worden monocyten aangetroffen binnen de gate voor CD14-positieve cellen; myeloïde dendritische cellen, die hoog zijn voor CD11C en laag voor CD4 en lin1-markers, bevinden zich in de R3-gate.

Gebruik tot slot Ideas-software om de colokalisatie van de cytoplasmatische transcriptiefactor NF kappa B met de nucleaire kleurstof te bepalen. Een hoge correlatie tussen NF kappa B en de nucleaire kleurstof, wat duidt op colokalisatie van de twee markers, wordt weerspiegeld in een hoge similarity score en geeft de mate van activering van de cel aan. Het percentage gebeurtenissen met een hoge similarity tussen verschillende behandelingsgroepen of patiëntenpopulaties kan worden vergeleken om de relatieve functionele efficiëntie van de cellen te evalueren.

Software kan vervolgens worden gebruikt om afbeeldingen van cellen uit belangrijke segmenten van populatiehistogrammen weer te geven. ImageStream maakt het mogelijk om subsets van cellen direct uit pbmc te gaten en om celresponsen af te beelden van gegate, maar niet gesorteerde celpopulaties. Hier werd het effect van TLR-signalering op de nucleaire lokalisatie van NF kappa BP 65 in lin one, negatieve CD four, dim CD 11 C positieve myeloïde dcs bij de nulmeting gekwantificeerd.

Er werd een hoog percentage ongestimuleerde cellen waargenomen met de transcriptiefactor NF kappa BP 65 in het cytoplasma. Na stimulatie bleek dat de behandelde cellen een significant hogere similarity score hadden van NF Kappa BP 65 met de nucleaire kleuring PI, wat erop wijst dat NF Kappa BP 65 na stimulatie naar de kern transloceerde. Gelijktijdig verzamelde digitale beelden van de onbehandelde en de met R 8 48 gestimuleerde celpopulaties tonen representatieve cellen en de intensiteit van NF kappa B die naar de celkern transloceerde. Let op de helderdere intensiteit van de NF Kappa B- en PI-kleuring in de met R 8 48 gestimuleerde groep in vergelijking met de onbehandelde cellen.

We hebben deze techniek toegepast op cellen van donoren van verschillende leeftijden en hebben verschillen aangetoond in de TLR-gemedieerde NF kappa B-activeringspaden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen één dag worden uitgevoerd, exclusief de extra tijd voor beeldanalyse, wat zowel verschillende lokalisatiebeelden als populatiestatistieken mogelijk maakt. Bovendien kunnen we responsen direct afbeelden van meerdere celpopulaties zonder fysieke scheiding. Image stream kan breed worden toegepast op een reeks cellulaire mechanismen en zou zeer waardevol kunnen zijn in translationeel onderzoek.