Name: Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer hoe je ImageStream-technologie gebruikt om immuuncelmechanismen te kwantificeren in PBMC's van patiëntencohorten. Deze methode combineert flowcytometrie met beeldanalyse voor translational onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door het NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, en de NCRR / GCRC Program M01-RR00125). De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen en dank dr. Mark Shlomchik, directeur van het Yale Cell Sorter Core Facility.

1. Isolatie en stimuleren van immuuncellen <ol><li> Zorg voor 10-50 ml heparine bloed van gezonde vrijwilligers na schriftelijke toestemming volgens de richtlijnen van de lokale Institutional Review Board. Voor studies van het ouder worden of ziekte pathogenese, uitsluiting en insluiting criteria voor elke vrijwilliger of patiënt moet expliciet worden bepaald. </li><li> Isoleer de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) met behulp van CPT-buisjes of Ficoll-Paque Plus volgens de instructies van de fabrikant (GE Healthcare, NJ) en gedrag experimenten op de dag van de isolatie 7 (reagentia, tabel 1). </li><li> Incubeer PBMCs (3 x 10 6 / buis) in 1,5 ml buizen 0,6 ml medium of gestimuleerd met TLR liganden of activerende middelen, zoals de TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml medium plus 0,6 ul 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, eindconcentratie 10 uM) bij 37 ° C gedurende 10-60 min (InvivoGen, CA) 9. </li></ol> 2. LaboratoriumEling van cellen <ol><li> Label cellijn en andere oppervlakte-markers op levende cellen schorsingen met fluorescent-geconjugeerde antilichamen. Label 3 x 10 6 PBMC gedurende 20 min bij 4 ° C in 100 ul PBS / 2% FBS in 1,5 ml Eppendorf buis met een cocktail van oppervlakte antilichamen specifiek voor monocyten of DC lijnen (Tabel 2). Optimale antilichaam verdunningen kan worden bepaald voorafgaande experimenten en voorbeelden worden verwerkt in batches te veel te veel variatie te minimaliseren. Voor leverancier antilichaam stock van 0,1 mg / ml gebruik 5 ul antilichaam (1:20 verdunning). Gebruik een aparte buis van cellen gelabeld met slechts een enkele kleur conjugaat het opzetten van de tl-kanalen op het instrument. </li><li> Na oppervlak etikettering vast cellen in 4% PFA / PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voor opslag tot het moment van analyse centrifuge cellen 500 xg en hersuspenderen cellen bevroren buffer (90% FBS met 10% DMSO) bij -80 ° C tot de dag van assay. </li><li> Voor de beoordeling, proces batches of onbehandeld en gestimuleerde cellen uit een groep van donoren samen om variabiliteit te minimaliseren. Op de dag van analyse, dooi cellen snel in 37 ° C waterbad, centrifugeer bij 500x g tot bevriezing buffer te verwijderen. </li><li> Cellen permeabilize voor detectie van intracellulaire cytokines of andere markeringen, hersuspenderen celsuspensies in 100 ul BD Perm / wasbuffer (BD Biosciences, NJ). Label voor intracellulaire signaleringscomponenten met bijvoorbeeld 1:20 verdunning van konijn anti-NF-kB (p65) antilichaam (uiteindelijke concentratie 10 pg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) gedurende 20 minuten bij RT, centrifuge 500 xg aspiraat supernatant en hersuspenderen cellen in 100 ul BD Perm / wassen met buffer 1:250 verdunning van geit anti-konijn IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) en geïncubeerd gedurende 20 min bij KT. </li><li> Vlak voor beeldvorming tegenkleuring kernen met DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) of propidium jodide (PI, 20 ng / ml, Invitrogen, CA). </li></ol> 3. ImageStream Analyse <ol><li>Voer beeldvorming door ImageStream op batched monsters van de variabiliteit tussen menselijke monsters te beperken. Instrument instellingen vermogen van de laser als volgt: 200 mW 488 nm, 10 mW 658 nm en 250 mW 405 nm. </li><li> (: Hoogte verhouding breedte) op enkele cellen (R1) van puin (lage PI intensiteit) of multi-cellulaire gebeurtenissen te onderscheiden (van databestanden (afb. 1), eerste, poort op evenementen met een normale PI intensiteit en hoge PI aspect ratio te analyseren hoge PI intensiteit en lage aspect ratio). Monocyten binnen een poort voor CD14 positieve cellen. mDCs zijn binnen een poort voor cellen die hoog zijn voor CD11c en laag voor CD4 (R2) en ook laag voor Lin-1 markers (R3). </li><li> Gebruik IDEAS software (Amnis, WA) een effectieve kwantitatieve meting van de mate van activatie van elke cel. Bepaal gelijkenis (of co-lokalisatie) van de cytoplasmatische transcriptiefactor NF-kB met nucleaire kleurstof PI translocatie geven in de kern (R4). Een hoge correlatie van NF-κB/PI localisatie komt tot uitdrukking in een hoge gelijkenis score en geeft de mate van activering 10. </li><li> Vergelijk de overeenkomst verhoudingen tussen behandelingsgroepen of patiëntengroepen relatieve functionele efficiëntie van de cellen te geven. Kwantificeren van gegevens tussen de monsters door middel van statistische vergelijking van de absolute waarden of voudige verschillen. Gebruik IDEEËN software om beelden van de cellen van de belangrijkste segmenten van de bevolking histogrammen (figuur 2) weer te geven. </li></ol> 4. Representatieve resultaten We hebben gekwantificeerd signaalwegen in reactie op een model virale ligand door het stimuleren PBMCs met de TLR7 / 8 ligand, R848 (Fig. 1). We hebben allebei cellulaire lokalisatie beelden en de bevolking die verzameld worden op onze steekproef groepen (afb. 2). ImageStream laat ons toe om gate cel subsets direct van PBMC&#39;s en beeld-cel responsen van een gesloten, maar ongesorteerde celpopulaties. Hier hebben we gekwantificeerd het effect van TLR&#39;signaling over nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) in Lin1-, CD4 dim, CD11c + myeloïde DCs (mDCs). Bij aanvang zagen we een hoog percentage niet-gestimuleerde cellen met de transcriptiefactor NF-kB (p65) in het cytoplasma. Na stimulatie, behandelde cellen hebben een significant hogere gelijkenis score van NF-B (p65) met nucleaire vlek PI, wat aangeeft dat NF-kB (p65) translocatie in de kern na stimulatie (mediaan gelijkenis scores zijn 1.52 en 3.01, respectievelijk Fig. 2). Soortgelijke resultaten worden vermeld in TLR5-gestimuleerde monocyten 9. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> Figuur 1. Kleuring en Poortsignalen strategie om de effecten van stimulatie te kwantificeren op de menselijke mDCs. De NF-kB transcriptiefactor reguleert expressie van een groot immuunsysteem genen. Dit onderzoek meet de nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) in mDCs afkomstig van een representatief onderwerp na TLR7 / 8 liga<html> ND stimulatie. In-richten enkele cellen werden geïdentificeerd door gating op PI positieve gebeurtenissen met een hoge nucleaire aspect ratio&#39;s (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) werden in een gesloten R3. Nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) wordt uitgezet in R4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> Figuur 2. . Translocatie van NF-kB in mDCs na stimulatie De translocatie van NF-kB (p65) in de kern na stimulatie (R4) is afgebeeld in populaties van onbehandelde en gestimuleerd mDCs, de mediaan gelijkenis score is 1,52 in de onbehandelde monster en 3,01 in de gestimuleerde monster (A). Digitale beelden tegelijkertijd verzameld van de onbehandelde of R848-gestimuleerde celpopulaties tonen vertegenwoordiger cellen en de intensiteit van de NF-B translocatie naar de celkern (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De kritische stappen in het gebruik van ImageStream voor translationeel onderzoek is de selectie van relevante vergelijking groepen en optimalisatie en validatie van antilichaamspecificiteit. Verschillen tussen subject groepen in het gemerkte doel zal snel duidelijk zijn via histogrammen en mobiele beelden. In combinatie met een grondige analyse van wijzigingen in relevante receptoren en signaalwegen, zullen deze gegevens een waardevol inzicht verschaffen in mechanismen die immuun ontregeling ten grondslag liggen in ges...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> Elektronen Microscopie Wetenschappen </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Wash </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> konijn anti-NF-kB (p65) </td><td> Santacruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 geit anti-konijn IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia en materialen. <table border="1"><tbody><tr><td> Celtype </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monocyt </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-kB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> mDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> pDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Antilichaam paneel voor cellijn kleuring van signaleringsroutes Monocyten: CD14 + mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (lineage) marker omvat CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers voor monocyten, NK-cellen, T &amp; B-cellen.

quantitative imaging van lineage-specifieke toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individuele variaties in het immuunsysteem van status te bepalen reacties op infectie en bij te dragen tot ernst van de ziekte en het resultaat. Veroudering gaat gepaard met een verhoogde gevoeligheid voor virale en bacteriële infecties en verminderde gevoeligheid voor vaccins met een goed gedocumenteerde daling van de humorale en cellulaire immuunrespons 1,2. We hebben onlangs onderzocht de effecten van de vergrijzing op de Toll-like receptoren (TLR), de belangrijkste componenten van het aangeboren immuunsysteem dat microbiële besmetting en trekker antimicrobiële afweer reacties 3 op te sporen. In een groot cohort van gezonde donoren, hebben we aangetoond dat perifere bloed monocyten van de ouderen hebben expressie en functie van bepaalde TLR 4 en soortgelijke verminderde TLR niveaus en signalering reacties in dendritische cellen (DC&#39;s) is gedaald, antigeen-presenterende cellen die cruciaal zijn in het verband tussen aangeboren en adaptieve immuniteit 5. We hebben aangetoond ontregeling van TLR3 in macrofagen eend een lagere productie van IFN door DCs van ouderen donoren in reactie op infectie met het West Nile virus 6,7. Paramount aan ons begrip van immunosenescence en therapeutische interventie is een gedetailleerd inzicht in specifieke celtypes reageert en het mechanisme (s) van signaaltransductie. Traditionele studies van immuunresponsen door middel van beeldvorming van primaire cellen en landmeetkundige cel markers door FACS of immunoblot gevorderd ons begrip significant, echter, deze studies over het algemeen zijn technisch beperkt door de kleine steekproef beschikbare volume van patiënten en het onvermogen om complexe laboratorium technieken uit te voeren op meerdere menselijke monsters. ImageStream combineert kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking en dus vergemakkelijkt onderzoek in meerdere celpopulaties gelijktijdig voor een efficiënte opname van de patiënt gevoeligheid. Hier laten we zien het gebruik van ImageStream in de ontwikkelingslanden te beoordelen TLR7 / 8activatie-gemedieerde toename van fosforylering en nucleaire translocatie van een belangrijke transcriptiefactor NF-kB, die de transcriptie van vele genen die essentieel zijn voor de immuunrespons 8 initieert. Met behulp van deze technologie, hebben we onlangs ook blijk gegeven van een eerder opgenomen wijziging van TLR5 signalering en de NF-kB route in monocyten van oudere donoren die kunnen bijdragen aan veranderde immuunrespons bij veroudering 9.

We beschrijven het gebruik van ImageStream technologie (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Die een combinatie van kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking, te kwantificeren cellulaire mechanismen van primaire immuun cellen van goed gedefinieerde patiënten cohorten. Onze studies geven een blauwdruk voor translationeel onderzoek naar lineage specifieke cellulaire respons in kleine steekproeven kwantificeren van onder cohorten.

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Individuele variaties in de immuunstatus bepalen de reacties op infecties en dragen bij aan de ernst en de uitkomst van ziekten. Veroudering is geassocieerd met een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van image stream-technologie aan te tonen voor het kwantificeren van cellulaire mechanismen van primaire immuuncellen uit goed gedefinieerde patiëntcohorten. Dit wordt bereikt door eerst perifere mononucleaire bloedcellen of pbmc te isoleren uit bloedmonsters die zijn afgenomen van patiënten of gezonde vrijwilligers. Na isolatie worden de cellen geactiveerd en vervolgens fluorescent gelabeld.Vervolgens worden de cellen hydrodynamisch gefocust, geëxciteerd met laserlicht en afgebeeld via time delay integration. CCD-camera. Ten slotte worden de beelden verkregen met de image stream cytometer en vindt kwantificatie van NF kappa b plaats.Translocatie in elke cellulaire afbeelding wordt uitgevoerd met behulp van de ideas-software. Uiteindelijk kunnen de verschillen tussen elke proefgroep worden bepaald via analyse van dot plots, histogrammen en celafbeeldingen. Het voordeel van de imagestroom is dat het feiten en immunofluorescentie combineert.We zijn in staat om cel-signaleringspaden op een lineage-specifieke manier te bestuderen, zowel op enkelvoudig celniveau als op populatieniveau, en dit startend met slechts een kleine bloedmonster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale kennisvragen door signaalintermediaten te lokaliseren en te kwantificeren. Zo kan het bijvoorbeeld worden gebruikt om de door actie gemedieerde nucleaire translocatie van transcriptiefactoren te onderzoeken of om de effecten van veroudering op de celbiologie te bestuderen.Een medewerker van mijn laboratorium demonstreert de techniek na het isoleren van perifere bloedmononucleaire cellen die zijn verkregen van menselijke vrijwilligers. Resuspendeer de teruggewonnen pBMC's op een concentratie van 3 × 10⁶ cellen per 0,6 milliliter medium en breng de celsuspensie vervolgens over in 1,5 milliliter buisjes. Stimuleer daarna een deel van de cellen met een activerend middel, zoals de hier getoonde TLR8-agonist R848, en incubeer vervolgens alle cellen gedurende 10 tot 60 minuten bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.Pelleteer na de incubatieperiode de cellen gedurende vijf minuten bij 500 ×g op kamertemperatuur, verwijder het supernatant en label de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C met een cocktail van oppervlakte-antilichamen specifiek voor monocyten- of DC-lijnen, inclusief buisjes met cellen gelabeld met enkelvoudige kleurconjugaten om als compensatiecontroles te dienen. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA-PBS. Na het centrifugeren van de cellen gedurende 10 minuten bij 500 ×g op kamertemperatuur, resuspenderen de PBMC in vriesbuffer en bewaren de cellen bij -80 °C tot ze op de dag van de assay worden geanalyseerd.Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C en permeabiliseer ze na centrifugatie om de vriesbuffer te verwijderen met 100 µL BD perm wash buffer. Label ze vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met antilichamen tegen intracellulaire signaalcomponenten, zoals de hier getoonde anti NF kappa BP 65-antilichamen. Na het pelleten van de cellen resuspenderen ze in 100 µL BD perm wash buffer die goat anti rabbit IgG bevat.Alexa 6 47 en incubeer de pbmc nog 20 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de cellen vlak voor de beeldvorming tegen met een kernkleurstof; begin met het inschakelen van de image stream en start vervolgens de inspire-software. Klik daarna op 'load default template' en selecteer vervolgens 'initialize fluidics'.Klik vervolgens op het menu van de afbeeldingsgalerij en selecteer 'alles'. Druk nu op 'run set up' om te beginnen met het imagen van de beads en selecteer daarna het bright field-kanaal. Zodra de speed beads draaien, klikt u onder het assistentie-tabblad op 'start all' om het instrument te kalibreren en te testen.Nadat het ImageStream-systeem is gekalibreerd, drukt u op flush, lock and load om het helderste monster in het apparaat te laden. Stel vervolgens de laserkracht zo in dat elke florachroom een maximale pixelwaarde heeft tussen 104.000 counts, zoals gemeten in de dot plots. Stel daarna de criteria voor de celclassificatie in.Klik nu op 'run, acquire' om het experimentele databestand te verzamelen en op te slaan. Om de databestanden te analyseren, opent u eerst de analyse-software. Er worden gecompenseerde afbeeldingsbestanden gemaakt en vervolgens wordt er gegated op events met een normale nucleaire kleurstofintensiteit en een hoge nucleaire kleurstof-aspectratio. Om enkelvoudige cellen in de R1-gate te onderscheiden van debris of multicellular events, worden monocyten gevonden binnen de gate voor CD14-positieve cellen; myeloïde dendritische cellen, die hoog zijn voor CD11C en laag voor CD4 en lin1-markers, bevinden zich in de R3-gate.Gebruik ten slotte IDEAS-software om de colocalisatie van de cytoplasmatische transcriptiefactor NF kappa B met de nucleaire kleuring te bepalen. Een hoge correlatie tussen NF kappa B en de nucleaire kleuring, wat wijst op colocalisatie van de twee markers, wordt weerspiegeld in een hoge similarity score en geeft de mate van activering van de cel aan. Het percentage events met een hoge similarity tussen verschillende behandelingsgroepen of patiëntenpopulaties kan worden vergeleken om de relatieve functionele efficiëntie van de cellen via IDEAS te evalueren.Software kan vervolgens worden gebruikt om beelden te tonen van cellen uit belangrijke segmenten van populatiehistogrammen. ImageStream maakt het mogelijk om cel-subsets direct uit pbmc te gatten en celresponsen te beelden van gegatte, maar niet gesorteerde celpopulaties. Hier werd het effect van TLR-signalering op de nucleaire lokalisatie van NF kappa BP 65 in lin one, negatieve CD four, dim CD 11 C positieve myeloïde dcs bij de baseline gekwantificeerd.Er werd een hoog percentage niet-gestimuleerde cellen waargenomen met de transcriptiefactor NF kappa BP 65 in het cytoplasma. Na stimulatie bleek dat de behandelde cellen een significant hogere similarity score hadden van NF Kappa BP 65 met de nucleaire kleuring PI, wat aangeeft dat NF Kappa BP 65 na stimulatie naar de nucleus is getransloceerd. Tegelijkertijd verzamelde digitale beelden van de onbehandelde en de met R 8 48 gestimuleerde celpopulaties tonen representatieve cellen en de intensiteit van de translocatie van NF kappa B naar de celkern. Let op de hogere intensiteit van de NF Kappa B- en PI-kleuring in de met R 8 48 gestimuleerde groep in vergelijking met de onbehandelde cellen.We hebben deze techniek toegepast op cellen van donoren van verschillende leeftijden en verschillen aangetoond in de TLR-gemedieerde NF kappa B-activatiepaden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen één dag worden uitgevoerd, exclusief de extra tijd voor beeldanalyse, wat zowel diverse lokalisatiebeelden als populatiestatistieken mogelijk maakt. Bovendien kunnen we responsen direct visualiseren van meerdere celpopulaties zonder fysieke scheiding. Image stream kan breed worden toegepast op een aantal cellulaire mechanismen en zou zeer waardevol kunnen zijn in translationeel onderzoek.

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dendritische cellen opname van antigenen en migreren naar immuun organen verwerkte antigenen presenteren aan T-cellen. Qdot nanokristallen etiket zorgt voor een langdurige en stabiele fluorescerende signaal. Dit maakt het volgen van dendritische cellen om verschillende organen van fluorescentie microscopie.

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.

Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Leer hoe je ImageStream-technologie gebruikt om immuuncelmechanismen te kwantificeren in PBMC's van patiëntencohorten. Deze methode combineert flowcytometrie met beeldanalyse voor translational onderzoek.

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed (Video) | JoVE Journal

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Meer video's verkennen