Name: Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer hoe je exocytose en membraandynamiek in levende hippocampale neuronen visualiseert met FRAP en fotobleektechnieken. Deze methode onthult eiwittrafficking en insertiepatronen in het plasmamembraan.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor de Wellcome Trust en de ERC voor financiële steun. IMGG is een EMBO Fellow. KLH is een BBSRC gefinancierde promovendus. Wij danken Philip Rubin en Patrick Tidball voor technische en celkweek ondersteuning en dr. Andrew Doherty voor het onderhoud en hulp bij de microscopen.

1. Cultuur van de Cel, virale transductie, en eiwitexpressie <ol><li> Cultuur met een hoge dichtheid hippocampale neuronen uit embryonale dag 18 (E18) jonge ratten op poly-L-lysine-gecoate dekglaasjes voor 14-25 dagen in vitro (DIV). </li><li> 6-24 uur voorafgaand aan de live-experimenten, transduceren cellen met een verzwakte Sindbis virus met het membraan eiwit van belang, gelabeld met de super-ecliptica pHluorin (SEP). </li><li> Direct Voeg de pseudovirion-bevattende medium om de dekglaasje met 1 ml van de geconditioneerde media en keerde terug naar de cultuur incubator. De titer en tijd na virale eiwitexpressie transductie afhankelijk van de virusbatch en worden voor elke partij alvorens aan levende cellen experimenten. </li></ol> 2. FRAP-FLIP live cell imaging <ol><li> Apparatuur set-up <ol><li> Breng het dekglaasje aan de beeldvorming kamer van een Zeiss Axiovert LSM 510 META confocale microscoop.Om schommelingen in de spanning te minimaliseren tijdens de beeldvorming, zorgen voor de microscoop is ingeschakeld, met 100% laser output, gedurende tenminste 20 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. </li><li> Onmiddellijk vervangen kweekmedium met voorverwarmd (37 ° C) extracellulaire oplossing die 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH ingesteld op 7,4 met NaOH) en plaats de kamer op de voorverwarmde fase (37 ° C) van de Zeiss Axiovert. Zorgen de osmolariteit van het extracellulaire oplossing wordt tot binnen 10 mOsm van kweekmedium. Mits geen significante verdamping plaatsvindt tijdens het tijdsverloop van het experiment CO 2 onafhankelijke oplossing geschikt is voor korte experimenten (&lt;10 uur). Aan te vullen met 1-2 mM natrium-bicarbonaat wordt aanbevolen. </li></ol></li><li> Het definiëren van de beeldvorming capture parameters <ol><li> Eerst identificeren van een neuron expressie van het recombinante proeiwit van interesse en breng het in beeld. </li><li> Met een 63x olie bezwaar, krijgen een beeld van de hele cel met behulp van 488nm laserlicht excitatie bij lage laservermogen. Het minimaliseren van fotobleken, gebruik maken van een snelle nominale snelheid (7-9) en lage pixel resolutie (512-512) het bijhouden van de totale scan snelheid &lt;1 seconde. </li><li> Selecteer een deel van dendriet om beeld en zoom in op een frame met daarin de ROI (~ 1.5-2.5 x optische zoom) vast te leggen. Indien mogelijk voor het gezichtsveld bevat verschillende processen is dat metingen uit referentie dendrieten kunnen worden verkregen, om te bepalen of niet-specifieke photobleaching door verwerving optreedt. </li><li> Pas de filters, pinhole-, scan-snelheid en de detector winst voor maximale fluorescentie in staat stellen van minimale laser excitatie, maar met beperkte verzadiging. Een grote pinhole diameter wordt aanbevolen om foton collectie te maximaliseren (2 pm is geschikt voor stekels en ternaire dendrieten). De detector winst moet sterk genoeg zijn om kleine fluorescentie stappen op te sporen,zodanig dat de eerste beelden voor het fotobleken niet meer dan 10% verzadigde pixels overwinnen. </li><li> Sla deze configuratie worden gebruikt voor het pre-/ na bleken en herstel fasen van het experiment. </li><li> Vervolgens bepalen de photobleach regio&#39;s; het selecteren van een ROI voor de eerste photobleach en flankerende gebieden voor de volgende repetitieve fotobleken fase. Zorg ervoor dat de flankerende gebieden zijn breed genoeg om het herstel te voorkomen door diffusie tussen de scans (typisch 5 micrometer, zie Fig. 2). </li><li> Pas het bleekmiddel parameters voor beide photobleach ROI. De eerste photobleach dient snel (0,1-0,5 sec) die tussen 1-5 iteraties, afhankelijk van de optische en het volume van de ROI. Voor de flankerende gebieden dient de laser excitatie aangepast continue fotobleken van de flankerende gebieden waarborgen zonder fototoxisch schade. </li><li> Als leidraad gebruiken we 100% laser excitatie voor de eerste photobleach, en 10% voor de repetitieve fotobleken phase. </li></ol></li><li> Beeldacquisitie <ol><li> Als alle parameters zijn ingesteld, voert u de FRAP-FLIP experiment als een variabele time-lapse beeld sequentie, die in de 4 blokken hieronder: VAK 1: 3-10 pre-bleach baseline beelden, bij lage laservermogen, geen tijd vertraging Blok 2: Photobleach de centrale ROI op volle laservermogen, 1-5 herhalingen BLOCK 3: 3-10 na bleken herstel beelden Blok 4: Repetitive photobleach van de flankerende gebieden op medium laservermogen met het vastleggen van beelden op een typische tijdsinterval van 1 - 5 seconden, afhankelijk van de opbrengst van het eiwit in onderzoek. </li><li> Tenslotte de extracellulaire oplossing opname gebufferd op PH6 met 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15mm glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20 tot 25 mM MES (tot doven fluorescentie) of aangevuld met 50 mM NH4Cl met 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucose, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mMMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (de eiwitten tonen in een lage pH intracellulaire voorraad) (zie Fig. 2). </li><li> Verzamelen ten minste 10 tot 20 gegevens voor elk recombinant eiwit, statistische analyse mogelijk. Om vertekening resultaten te voorkomen, zorgen voor beeldvorming omstandigheden worden gehandhaafd consistent repliceert. Gooi alle gegevenssets waarbij onvolledige bleken, belangrijke focal plane drift of fototoxische celbeschadiging in acht worden genomen. </li></ol></li></ol> 3. Data-analyse <ol><li> Open de beelden met ImageJ software. </li><li> Lijn de stapels om rekening te houden voor kleine fluctuaties in het xy-vlak die zich hebben voorgedaan in de tijdreeksen met behulp van de STACKREG plugin (Plugins → STACKREG → transformatie: stijve carrosserie → <ok> ). </ok></li><li> Voor foto&#39;s gemaakt op Zeiss confocale, gebruik maken van de LSM Toolbox plugin om de tijd die waarden als een tekstbestand (Plugins → LSM Toolbox → Toon LSM Toolbox melden → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),en importeer deze waarden in een analyse spreadsheet. </apply></apply></li><li> Om de fluorescentie schommelingen tijdens de FRAP-FLIP experiment te meten, verdelen de photobleached segment in afzonderlijke pixel regio&#39;s (~ 20pixels) en meet de gemiddelde fluorescentie van deze ROI op elk tijdstip (F). Om snel te verkrijgen van deze waarden, selecteert u meerdere ROI met behulp van de ImageJ &#39;ROI Manager&#39; analyse-instrument (Analyze → Extra → ROI Manager) en rapporteert de gemiddelde fluorescentie per pixel met behulp van de &#39;Plot Z-as profiel&#39; opdracht (Afbeelding → Stacks → Plot Z -as profiel). </li><li> Herhaal deze stap om de fluorescentie-intensiteit van een achtergrond, niet fluorescerende regio te meten. </li><li> Normaliseren de fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip door het aftrekken van de achtergrondwaarden van experimentele ruis te verwijderen, en alle waarden te delen door de gemiddelde pre-gebleekt nulmeting. </li><li> Meet de fluorescentie-intensiteit van naburige niet-photobleached dendrieten tot het niveau van niet-specifieke beoordelenfotobleken tijdens de overname. Correctie voor niet-specifieke fotobleken wordt afgeraden voor interpretatie van &#39;FRAP-FLIP&#39; gegevens en moeten zoveel mogelijk worden vermeden. </li><li> Om te berekenen wanneer een significant herstel heeft plaatsgevonden in een ROI, af te trekken van het gemiddelde van afgelopen 5-10 maatregelen van de volgorde van het gemiddelde van de eerste 5-10 maatregelen (AF) en bepalen van de statistische significantie. Categoriseren de herstellende en niet-herstellende ROI om het patroon van exocytose (dat wil zeggen exocytose hotspots of wervelkolom vs as herstel) te beoordelen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Het resultaat van typische FRAP-FLIP experiment wordt getoond in Fig. 2. Hier is een neuron de uiting van de GluA2 subeenheid van AMPA het type glutamaat receptor, gelabeld met SEP is selectief photobleached langs een regio van dendriet. Figuur 2.A illustreert de regio dendriet die is afgebeeld en geeft aan dat de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken (witte doos regio&#39;s). The grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, gemarkeerd met dubbele geleide blauwe pijlen. De rode pijl geeft de gemeten ROI, te zien in een hoge vergrotingsfactor in de onderste panelen. Figuur 2.B, toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI over de tijd loop van het experiment. In dit voorbeeld werd een minuut herstelperiode opgenomen na de eerste photobleach om ongebleekt receptoren het rendement door laterale diffusie voeren. Wanneer de flankerende regio&#39;s photobleached wordt het fluorescentiesignaal van deze zeer beweeglijke deel van receptoren opgesloten uit het centrale gebied en die binnen de regio verdund uit. De toename van de fluorescentie (AF) die gedurende de &#39;Flip&#39; sequentie kan dus worden toegeschreven aan het inbrengen van SEP-GluA2 in de dendritische as. De lage pH was-en pH 7,4 + NH4Cl Daarnaast respectievelijk bevestigen dat de gemeten fluorescentie is afgeleid van het oppervlakeiwitten en onthullen het aandeel van de intracellulaire, afgezonderd eiwitten binnen het gemeten ROI. In tegenstelling tot FRAP Deze werkwijze isolaten herstel door exocytose, waardoor een sterk verminderde mate van fluorescentieherstel in de photobleached regio. Om geen betrouwbare wiskundig model op heden is ontwikkeld om te passen en het herstel sporen geregistreerd met behulp van deze selectieve bleken techniek te analyseren. Het is echter mogelijk om het herstel spoor te voorzien van een mono-exponentiële herstel: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) Wanneer F (t) fluorescentie op tijdstip t, s A is steady state waarde A 0 is de verschuiving op tijdstip 0 τ de tijdconstante. Het herstel groei wordt bevestigd met een bepaald percentage om een ​​evenwicht te bereiken, overeenkomend met een steady state tussen het inbrengen en diffusie. Belangrijk is dat de tijdkonstante uit deze eenNALYSE geeft niet de tijdconstante van exocytose en kan alleen worden gebruikt voor vergelijkende behandelingen voor een individuele eiwit. Bovendien is het verwachte patroon van fluorescentie herstel waarschijnlijk acht te worden genomen in sub-domeinen langs de photobleached regio. Analyse van kleine ROI binnen photobleached segment kan essentieel zijn om exocytose &quot;hotspot&quot; tonen en is het raadzaam om delen van vergelijkbare lengten de variabiliteit van de dichtheid van deze vlekken bij het analyseren dendrieten de berekende snelheid beïnvloeden. Figuur 3 toont een uitbreiding van dit protocol, waarbij de photobleach te groot gedeelte ROI met meerdere dendrieten in het gezichtsveld, gevolgd door selectief herhaalde bleken slechts een dendrieten. Deze benadering maakt traditionele &#39;FRAP&#39; en &#39;FRAP-FLIP&#39; data te verkrijgen in parallel. In dit voorbeeld zijn hippocampale neuronen geïnfecteerd met glutamaat receptor subeenheid van het kaïnaat klasse SEP-gelabeld GluK2. Prior om beeldvorming, werden neuronen-deze behandeld met cylcohexamide (2 uur op 200μg/ml), om de eiwitsynthese te blokkeren. Als zodanig, fluorescentie herstel in de respectieve gemeten ROI (Fig 3.B) toont het aandeel van herstel als gevolg van laterale diffusie en recycling in de standaard FRAP dendriet versus recycling alleen in de dendriet onderworpen aan de &#39;FRAP-FLIP&#39; protocol. Het vergelijken van de AF waarden uit de FRAP versus &#39;FRAP-FLIP&#39; herstel bochten, de relatieve bijdragen van recycling (AF rec = 11,05%) ten opzichte van laterale diffusie (AF diff = 9,35%) kan worden afgeleid. Anders figuur 2, het herstel niet een gelijkmatige state maar meer, de remming van de eiwitsynthese toont een tijdelijke toename en daaropvolgende afname in signaal, dat overeenkomt met uitputting van de beschikbare receptor pool (ongeveer 20% waargenomen daling gedurende de opname periode). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Figuur 1. Schematische voorstelling van de principes van FRAP vs FRAP-FLIP protocollen Dit schema illustreert de resultaten van een regelmatige FRAP versus protocol een &#39;FRAP-FLIP&#39;, met behulp van SEP-gelabeld receptoren. Fluorescentieherstel in traditionele FRAP wordt op links. Gemeten fluorescentieherstel in de centrale ROI wordt toegeschreven aan een combinatie van laterale diffusie f niet photobleached SEP-gelabeld receptoren buiten photobleached ROI en insertie van receptoren door recycling en / of de novo exocytose de dendritische as. Daarentegen, de repetitieve photobleached van de flankerende ROI geïllustreerd in uw rechterhand, laat zien hoe dit gewijzigde &#39;FRAP-FLIP&#39; protocol stiltes herstel als gevolg van laterale diffusie. Als zodanig kan iedere gemeten fluorescentieherstel worden toegeschreven aan directe insertie in de ROI. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Figuur 2.Het inbrengen van SEP-GluA2 in de plasmamembraan van de dendritische as A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluA2, selectief photobleached langs een regio van dendriet. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl de bovenste linker paneel wijst op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. De grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, gemarkeerd met dubbele geleide blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendriet voorafgaand aan fotobleken. De rode pijl geeft de gemeten ROI, te zien in een hoge vergrotingsfactor in de onderste panelen. B) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet grijsniveau de ROI (niet genormaliseerd). De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF geeft aan ee toename van de fluorescentie waargenomen gedurende de herstelperiode, als gevolg van het inbrengen van SEP-GluA2 in de dendritische as. Na een lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Figuur 3. Recycling en laterale diffusie vs Recycling van SEP-GluK2 op de dendritische as na cyclohexamide behandeling A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluK2, selectief photobleached met parallelle FRAP en &#39;FRAP-FLIP&#39; nuttige toepassing protocollen uitgevoerd langs verschillende dendritische ROI. Dit neuron werd onderworpen aan een voorbehandeling met cyclohexamide te eiwitsynthese (2 uur bij 200 pg / ml) blokkeert. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl het linkerpaneel wijzen op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. The grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, van de lagere dendriet alleen gemarkeerd met een dubbele leiding blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendrieten voorafgaand aan fotobleken. Rode pijlen wijzen op de ROI getoond in een sterke vergroting in B) ter illustratie van de fluorescentie herstel van de traditionele FRAP versus protocol de &#39;FRAP-FLIP&#39;. Vergelijking van niveaus van fluorescentie-intensiteit in de late fase van herstel (derde panelen) tonen de bijdrage van laterale diffusie en recycling versus recycling alleen. C) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet genormaliseerde intensiteit waarden. De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF rec geeft aan dat het van voorbijgaande aard herstel als gevolg van receptor recycling, bepaald door de FRAP / FLIP dendriet, terwijl AFdiff meet de bijdrage van laterale diffusie van SEP-GluK2 in de dendritische as in de &#39;FRAP slechts&#39; ROI. De tijdelijke verhoging wordt gevolgd door geleidelijke daling signaal overeenkomt met de afdaling beschikbare receptoren als gevolg van cyclohexamide behandeling. De daaropvolgende lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren.

<ol><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+green+outside%3A+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li>
<li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells%3A+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li>
<li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li>
<li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li>
<li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschrijven een innovatieve strategie om de componenten van plasma membraaneiwit handel te visualiseren. De combinatoriële benadering van fotobleken technieken met SEP-gemerkte eiwit maakt selectief plasmamembraan inbrengen gebeurtenissen worden beoordeeld. Door voortdurend fotobleken het membraan eiwitten in flankerende gebieden tijdens het herstel, de &#39;FRAP-FLIP-methode beoordeelt de bijdrage van vesiculair transport naar fluorescentie herstel. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk direct de opname van eiwit membraan inbrengen, waardoor zowel het aantal sub-compartimenten waarin het herstel wordt waargenomen en de amplitude van het herstel (AF) op de steady-state te bepalen. Verder vergelijking FRAP met en zonder FLIP kan het percentage herstel toe te schrijven aan laterale diffusie worden berekend. Bovendien hetzelfde experiment kan gebieden niet photobleached dendrieten naast de flankerende regio&#39;s photobleachedkwalitatief beoordeeld tijdens het herstel; fluorescentie verlies waargenomen in deze regio&#39;s zal als gevolg van laterale diffusie van photobleached receptoren in deze niet-photobleached segmenten van de dendriet. Deze selectieve fotobleken protocol kan worden gebruikt om verschillende cellulaire transport processen zoals kenmerkend excocytosis de plasmamembraan in bepaalde deelgebieden (bijvoorbeeld dendrieten of ruggen) of waarin de bijdrage van laterale diffusie vs aanbrengen door een parallel FRAP en &quot;FRAP onderzoeken -Flip &#39;protocollen langs aangrenzende dendrieten (afb. 3). Het is duidelijk dat, terwijl de specifieke richtlijnen zijn gepresenteerd, zal elk lab nodig optimaliseren van de beeldvorming parameters volgens specifieke monsters en apparatuur. Belangrijk alle oppervlakte receptoren in de ROI moeten photobleached, onafhankelijk van de z-as brandvlak zonder aanzienlijke beschadiging fototoxische of niet-specifieke fotobleken. Onsers dienen voorzichtigheid te betrachten bij een poging dit protocol in de cel soma, zoals het hoge percentage van relatief lage pH intracellulaire compartimenten meestal resulteert in een hoge achtergrond fluorescentie in deze regio&#39;s. En hoewel we hebben aangetoond hoe deze techniek kan worden toegepast op verschillende manieren, alvorens aan selectieve fotobleken experimenten op nieuwe SEP-gelabelde construeren raden dat een eerste karakterisering van de gemerkte receptor eerst uitgevoerd zoals beschreven door Ashby et al. 2. Over het geheel genomen is deze methode een krachtige en veelzijdige aanpassing van de standaard FRAP-protocol, waardoor het inbrengen gebeurtenissen in plasmamembraan te worden geëvalueerd in de buurt van real-time.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Naam van het serum</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Opmerkingen (optioneel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm glas dekglaasjes</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-lysine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml in boraatbuffer voor het coaten van dekglaasjes</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Medium</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% in neuronale beplating en het voeden van medium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilline Streptomycine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% in neuronale beplating en het voeden van medium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamine</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2mm / 0,8 mm in plating / voeden medium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paard Serum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% in neuronale plating media alleen</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 kloneringsvector</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Bij Sindbis virusproductie</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META confocale systeem</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Afbeelding J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Open Access-software. Alle plugins die hierin worden beschreven zijn beschikbaar op<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

laterale diffusie en exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van fluorescence recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Membraan eiwitten zoals receptoren en ionkanalen ondergaan actieve handel in neuronen, die sterk gepolariseerd en morfologisch complex. Deze gerichte mensenhandel is van fundamenteel belang te leveren, te onderhouden of te verwijderen synaptische eiwitten.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-ecliptica pHluorin (SEP) is een pH-gevoelige derivaat van EGFP dat op grote schaal gebruikt voor beeldvorming van levende cellen van plasmamembraaneiwitten<sup&gt; 1-2</sup&gt;. Bij een lage pH, protonering van SEP vermindert foton absorptie en elimineert fluorescentie-emissie. Aangezien de meeste intracellulaire gebeurtenissen in de handel compartimenten lage pH, waar september fluorescentie verduisterd het fluorescentiesignaal van SEP-gemerkte eiwitten overwegend van de plasmamembraan waar SEP wordt blootgesteld aan een neutrale pH extracellulaire omgeving. Als deze brandt, bij hoge intensiteit SEP, zoals elke fluorescerende kleurstof, is onomkeerbaar photodamaged (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Belangrijk, want een lage pH-foton absorptie lest, alleen aan de oppervlakte uitgedrukt SEP kan worden photobleached dat de intracellulaire SEP is niet beïnvloed door de hoge intensiteit verlichting<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (Fluorescence Recovery After fotobleken) van SEP-gemerkte eiwitten is een handige en krachtige techniek voor de beoordeling van eiwit dynamiek op de plasmamembraan. Bij het fluorescent gemerkte eiwitten zijn photobleached in een regio van belang (ROI) het herstel van de fluorescentie optreedt als gevolg van de beweging van ongebleekte SEP-gemerkte eiwitten in het gebleekte gebied. Dit kan gebeuren door laterale diffusie en / of exocytose van niet-photobleached receptoren hetzij door<em&gt; De novo</em&gt; Synthese of recycling (zie Fig. 1). De fractie van immobiele en mobiele eiwit kan worden bepaald en de mobiliteit en de kinetiek van de diffundeerbare fractie kan worden verhoord onder basale als de gestimuleerde aandoeningen zoals agonist toepassing of neuronale activatie stimuli zoals NMDA of KCl toepassing<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; We beschrijven photobleaching technieken ontworpen om selectief te visualiseren het herstel van de fluorescentie toe te schrijven aan exocytose. In het kort wordt een ROI keer photobleached als met standaard FRAP protocollen, volgde, na een korte herstel, door repetitieve bleken van de flankerende gebieden. Deze &#39;FRAP-FLIP&#39; protocol, ontwikkeld in ons lab, is gebruikt om AMPA receptor mensenhandel te kwalificeren dendritische spines<sup&gt; 10</sup&gt; En is van toepassing op een breed scala van mensenhandel studies om de intracellulaire mensenhandel en exocytose te evalueren.</p

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membraaneiwitten, zoals receptoren en ionkanalen, ondergaan actief transport in neuronen, die sterk gepolariseerd en morfologisch complex zijn. Dit ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de insertie van neuronale eiwitten in het plasmamembraan. Dit wordt bereikt door eerst gecultiveerde hippocampale neuronen te infecteren met een sinusvirus om het eiwit van belang tot expressie te brengen, dat is gelabeld met super ecliptic, Florin of sep. Vervolgens wordt een regio van belang of ROI gefotobleekt.Vervolgens worden de flankerende segmenten herhaaldelijk fotogebleekt, terwijl het oorspronkelijke interessegebied fluorescent kan herstellen. Ten slotte wordt het fluorescentieherstel in het interessegebied geanalyseerd. Uiteindelijk wordt deze aanpassing van conventionele FRAP-experimenten gebruikt om het patroon van exocytose-gebeurtenissen van het doeleiwit in het plasmamembraan aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals oppervlakte-biotinylering of antilichaam-feeding, is dat het mogelijk maakt om de dynamiek van membraaninsertie-gebeurtenissen te visualiseren. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over proteintransport, zoals waar en hoe exocytose-gebeurtenissen plaatsvinden. Ik kreeg het idee voor deze methode toen ik zocht naar een alternatief voor turf-aging om exocytose-gebeurtenissen in spines te kunnen bestuderen in experimenten met levende cellen. Begin met het kweken van hoog-densiteit hippocampale neuronen van pups van embryonale dag 18 op met poly-L-lysine gecoate glazen dekglasjes gedurende 14 tot 25 dagen in vitro, 6 tot 24 uur voorafgaand aan het live experiment.Transduceer de cellen met het symbis-virus dat het membraaneiwit van belang codeert, getypeerd met de SUP ecliptic fluorine osep. Voeg het pseudo-virion, inclusief medium, direct toe aan het dekglas dat één milliliter geconditioneerd medium bevat en plaats de cellen terug in de kweekincubator. Om de cellen te beelden, schakelt u een zes axia vert LSM vijf 10 meta confocale microscoop in met 100% laseroutput gedurende ten minste 20 minuten vóór het beelden.Om stroomschommelingen tijdens de beeldvorming te minimaliseren en de tafel voor te verwarmen. Wanneer de microscoop gereed is, selecteert u het 63x objectief, brengt u vervolgens het dekglas over naar de beeldvormingskamer en vervangt u onmiddellijk het cultuurmedium door voorverwarmde extracellulaire registratieoplossing.Plaats de kamer op de voorverwarmde microscooptafel. Het moeilijkste aspect van deze procedure is ervoor zorgen dat de conditie van de cellen niet in gevaar komt tijdens het opnameproces. Aangezien dit protocol uitgebreid fotobleken vereist om succes te garanderen, dient u er zeker van te zijn dat alle beeldvormingsparameters zijn geoptimaliseerd voordat u begint met grootschalige experimenten, waarbij de voorkeur moet uitgaan naar snelle acquisitie boven beelden van hoge kwaliteit.Om de parameters voor de beeldvastlegging te bepalen, identificeert u een neuron dat het recombinant eiwit van belang tot expressie brengt en stelt u dit scherp. Scan de gehele cel met een 488 nanometer laser bij een laag vermogen om fotobleken te minimaliseren.Gebruik een hoge nominale snelheid en een lage pixelresolutie. Houd de totale scansnelheid onder de ene seconde. Selecteer een deel van de dendriet om te beelden en gebruik een optische zoom van 1,5 tot 2,5.Leg een frame vast met het interessegebied om te bepalen of er aspecifieke fotobleaching optreedt. Probeer ervoor te zorgen dat het gezichtsveld verschillende uitlopers bevat, zodat metingen van referentiedendrieten kunnen worden verkregen. Pas met behulp van een bereikindicatorpalet de beeldvormingsparameters aan om maximale fluorescentie mogelijk te maken bij minimale laser-excitatie, maar met beperkte verzadiging.Een grote pinhole-diameter wordt aanbevolen om de fotoncollectie te maximaliseren. De detectorversterking moet sterk genoeg zijn om kleine fluorescentietoenames te detecteren, zodanig dat de allereerste beelden vóór het fotobleken niet meer dan 10% verzadigde pixels bevatten. Stel de focus in om er zeker van te zijn dat het midline brandvlak is bereikt.Sla de configuratie na het instellen op, zodat deze gebruikt kan worden voor de fasen van herstel vóór en na de bleking tijdens het experiment. Definieer vervolgens de fotobleak-gebieden door een region of interest (ROI) te selecteren voor de initiële fotobleak en flankerende gebieden voor de daaropvolgende repetitieve fotobleak-fase.Voor het initiële fotobleken worden zowel de centrale als de flankerende ROI's gefotobleekt. Voor het repetitieve fotobleken worden echter alleen de flankerende ROI's geselecteerd. Zorg ervoor dat de flankerende regio's breed genoeg zijn om herstel door diffusie tussen de scans te voorkomen.Pas de bleekparameters aan voor beide photobleach ROI's. De initiële fotobleking moet snel zijn en vereist tussen de één en vijf iteraties, afhankelijk van de optische zoom en het volume van de ROI. Voor de flankerende regio's moet de laserstimulatie worden aangepast om continue fotobleking te waarborgen, maar zonder fototoxische schade. Zodra de parameters zijn ingesteld, wordt een FRA flip-experiment uitgevoerd als een tijdreeks van beelden met variabele intervallen, waarbij eerst drie tot 10 preble baseline-beelden worden opgenomen bij een laag laservermogen zonder tijdsvertraging.Fotobleach vervolgens de centrale ROI bij volledig laservermogen gedurende één tot vijf iteraties. Neem daarna drie tot 10 recovery-beelden na het bleken op. Voer een repetitieve fotobleaching uit van de flankerende regio's met een medium laservermogen, waarbij de beelden worden vastgelegd met een typisch tijdsinterval van één tot vijf seconden, afhankelijk van de recovery-snelheid van het onderzochte eiwit.Vervolgens, om de fluorescentie te doven, vervangt u de extracellulaire registratie-oplossing door een registratie-oplossing gebufferd bij pH 6, of om het eiwit in intracellulaire depots met een lage pH zichtbaar te maken, gebruikt u een buffer aangevuld met 50 millimol ammoniumchloride. Verzamel ten minste 10 tot 20 datasets voor elk recombinant eiwit om statistische analyse mogelijk te maken en bevooroordeelde resultaten te voorkomen; zorg ervoor dat de beeldvormingscondities constant blijven over de replicates. Open de afbeeldingen om deze te analyseren.Lijn de stacks uit met de Image J-software om rekening te houden met kleine fluctuaties in het XY-vlak die gedurende de tijdserie kunnen zijn opgetreden. Gebruik voor beelden die met een zes-confocale microscoop zijn gemaakt de stack reg-plugin, en gebruik de LSM toolbox-plugin om de tijdwaarden als tekstbestand te exporteren; importeer deze waarden vervolgens in een analyse-spreadsheet om de fluorescentiefluctuaties te meten. Verdeel tijdens het FRA-flip-experiment het fotobleeksegment in individuele pixelregio's met de ROI manager-analyse tool om meerdere ROI's te selecteren.Gebruik vervolgens het commando plot Z axis profile om de gemiddelde fluorescentie per pixel op elk tijdstip te meten. Herhaal dit proces om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een niet-fluorescerend achtergrondgebied te meten. Normaliseer de fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip door de achtergrondwaarden af te trekken om experimentele ruis te verwijderen, en deel vervolgens alle waarden door de gemiddelde baseline-meting vóór het bleken of door de waarde direct na het bleken.Bestudeer het herstelverloop voor elke ROI uitgezet tegen de tijd om te berekenen of er sprake is van significant herstel. Bereken in een ROI delta F door het gemiddelde van de eerste vijf tot 10 metingen van de fotobleach-herstelreeks af te trekken van het gemiddelde van de laatste vijf tot 10 metingen. Bepaal vervolgens de statistische significantie van delta F en karakteriseer de herstellende en niet-herstellende ROI's om het patroon van exocytose te beoordelen.Dat zijn exocytose-hotspots of herstel van de spine versus de shaft. Deze video toont het representatieve resultaat van een typisch FRAP-experiment met behulp van SERP-lijm. Een twee.Een gebied van een dendriet wordt eenmaal fotogebleekt, gevolgd door een herstelperiode van één minuut. Vervolgens wordt het herhaaldelijk fotobleken van de flankerende regio's gestart, aangegeven door de blauwe pijlen. De rode pijl markeert een klein gebied van belang waar herstel van fluorescentie wordt waargenomen, vergroot weergegeven in het rechterpaneel van het scherm.Het herstel wordt bijgehouden in de onderstaande grafiek, waarbij de totale toename in fluorescentie wordt aangeduid als delta F. De toename in fluorescentie die over deze reeks is waargenomen, kan worden toegeschreven aan de insertie van glue A two in de dendritische schacht. De grote veranderingen in fluorescentie-intensiteit aan het einde van het experiment tonen het effect van de lage pH en de wasbeurten met pH 7,4 plus ammoniumchloride op het sep-fluorescentiesignaal. In dit voorbeeld zijn de neuronen geïnfecteerd met SEP glue K two.Hier is een grote ROI met meerdere dendrieten in het gezichtsveld gefotobleekt, gevolgd door selectieve herhaalde fotobleking van slechts één dendriet. Deze neuronen werden twee uur vóór de beeldvorming behandeld met cycloheximide om de eiwitsynthese te blokkeren. Hierdoor onthult het fluorescentieherstel in de respectievelijk gemeten ROI's het aandeel van het herstel door laterale diffusie en recycling in de standaard FRAP-dendriet, tegenover recycling alleen in de dendrieten die zijn onderworpen aan het FRAP-FLIP-protocol.Door de delta F-waarden van de frap- versus de frap flip-herstelcurves te vergelijken, kunnen de relatieve bijdragen van recycling versus laterale diffusie worden afgeleid vanwege de inhibitie van de eiwitsynthese. Het herstel vertoont een daaropvolgende afname van het signaal naarmate de beschikbare receptorpool wordt uitgeput. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u succesvolle imaging-experimenten in neuronen opzet, uitvoert en analyseert.Door gebruik te maken van deze combinatie van fotobleaching-technieken kunt u bewijs verzamelen voor de membraaninsertie van uw eiwit van belang.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

FRAP is gebruikt om de mobiliteit van de groene fluorescentie Protein (GFP)-gemerkte eiwitten in gekweekte cellen te kwantificeren. We hebben de mobiele / immobiele fracties van de GFP onderzocht door het analyseren van de fluorescentie herstel na fotobleken percentage. In deze studie werd uitgevoerd op FRAP stekels van hippocampale neuronen.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Leer hoe je exocytose en membraandynamiek in levende hippocampale neuronen visualiseert met FRAP en fotobleektechnieken. Deze methode onthult eiwittrafficking en insertiepatronen in het plasmamembraan.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken (Video) | JoVE Journal

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Meer video's verkennen