Name: Voorbereiding van een Awake Muis voor opnemen Neurale Reacties en injecteren van Tracers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Leer een methode voor het opnemen van neurale reacties bij wakke muizen met behulp van stereotaxische chirurgie en elektroden. Deze techniek maakt nauwkeurige studies van hersenfunctie zonder invloed van anesthetica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NSF subsidie ​​0920060, NIH-subsidie ​​DC004395, NHMRC subsidie ​​1.009.482, Zuid-Holland Office of Science and Medical Research, en de Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Hoofdsteunen Overzicht <ol><li> Om een custom-built hoofd-bericht samen te stellen, &quot;loodrecht RVS roll-pin in een gat geboord in een 3/32&quot; Steek een 1/16 roestvrij stalen staaf aan een kruis te vormen. De verticale stuk van het hoofd-post moet ongeveer 20 mm en een horizontale dwarsstuk ongeveer 15 mm zijn. Raak een uiteinde van de verticale staaf een # 1-72 schroef accepteren. (Fig. 1). </li><li> Tijdens de operatie en de opname wordt de hoofd-post bevestigd in een op maat gemaakte messing of aluminium montage-bar met een # 1-72 schroef (afb. 2). De lange stuk van de montage-bar moet ongeveer 90 mm lang en 5-10 mm breed. Het hoofd-bericht past in een gleuf die in een 15 mm verlenging uit de lange bar die een hoek van 45 graden. Rotatie van het hoofd, de dwarsbalk van de kop-post ingebed voorkomen in een kleine groef in de onderzijde van de montageplaat bar. </li><li> De montage-bar in dan bevestigd aan een op maat gemaakte aluminium montage blokk (Fig. 3). De montageblok ongeveer 30 mm x 30 mm x 25 mm. Dit montageblok is aangesloten op een micromanipulator zodat de positie van het hoofd-na nauwkeurig worden geplaatst langs de middellijn en bregma. De montage blok uit twee delen met schroeven aangebracht. Een uitsparing in het blok kan de montage balk te glijden in en vastgezet worden met de schroeven. De montage bar evenwijdig aan het tafelblad. Tijdens het opnemen, zet de bar in een aangepaste stereotaxisch frame (afb. 4). De stereotax is ontworpen om de bar monteren in dezelfde positie in het montageblok tijdens chirurgie. Deze regeling zorgt ervoor dat de muis altijd worden afgestemd op de stereotaxisch frame over experimentele sessies. </li><li> Snij een wolfraam stift (diameter 0,010 &quot;) tot ongeveer 5 mm lengte met ongeveer 1 mm gebogen bij 45 °. Deze stang dient als de aardpen (Fig. 1). </li></ol> 2. Stereotaxische Alignment voor craniotomie Opmerking: Alle procedures die de onderstaande standaard aseptische chirurgische technieken en zijn goedgekeurd door de Washington State University Animal Care en gebruik Comite en het Dier Ethische Commissie van het Garvan Instituut. <ol><li> Verdoof de muis door het plaatsen van een inductie kamer met 5% isofluraan. Het ontbreken van een reactie op staart en / of toe pinch zodat het dier volledig verdoofd. </li><li> Plaats de muis in een knaagdier stereotaxisch frame uitgerust met een muis adapter (Stoelting). Te oriënteren de muis goed, plaats de tanden in het gat van de beet bar en draai de neus klem, zodat het stevig vast zit. Plaats de muis zo recht mogelijk in de bijt bar en neus klem. Plaats een masker gemaakt uit een stuk latex handschoen over de neus van de muis, en houd de isofluraan bij 5% tot de muis ademhaling is ongeveer 1 adem / sec. Draai de isofluraan tot 1,5 - 2,0%. Zet de kop met tHij oor-bars let daarbij goed op niet doorboren het trommelvlies. Bars moet goed aansluiten, maar niet binnen te dringen te diep in de gehoorgang. </li><li> Plaats een verwarmingselement onder de muis. </li><li> Breng oogzalf om de ogen niet uitdrogen. </li><li> Scheer de hoofdhuid van tussen de oren tot aan de ogen met een klein scheerapparaat of fijn-punt schaar. </li><li> Reinig en ontsmet de hoofdhuid schoon met chloor-hexidine (of betadine) scrub, gevolgd door alcohol spoelen 3 keer wordt herhaald. </li><li> Om de huid te verwijderen over de bovenkant van de schedel een insnijding over de middellijn vanaf de achterkant van het hoofd naar de ogen. </li><li> Schraap de periosteum de randen van de insnijding met een scalpel. Indien nodig (afhankelijk van de experimentele doel), voorzichtig terug te trekken de spieren aan de achterkant van de nek met een pincet, waardoor de spier te scheuren langs de bundels te bloeden te minimaliseren. Breng gelfoam onder hoofdhuid weefsel om zo weinig mogelijk vocht en te voorkomen dat de huid kan bewegen over de schedel. </li><li> Droog de schedel oppervlak met een wattenstaafje bevochtigd met isopropylalcohol om de visualisatie van de schedel bezienswaardigheden te verbeteren. </li><li> Lijn de schedel met standaard stereotaxische coördinaten 13. Steek een fijne-point sonde in de elektrode houder en bevestig deze aan de stereotaxische micromanipulator. Een scherp draadmetaal goed werkt voor dit doel (Fig. 5). </li><li> Gebruik het punt om bregma (Fig. 5A) en Lambda (Fig. 5B) te identificeren op de schedel. Beweeg de sonde heen-en-weer tussen deze punten, te controleren of de laterale-mediale coördinaat voor elke locatie een verschil van niet meer dan 50 urn. Plaats het hoofd indien nodig door voorzichtig losmaken van de oor-bars, het verschuiven van het hoofd en oor-bars lateraal, en natrekken van de oor-bars. </li><li> Controleer de rug-ventrale hoogte op elke plaats verschilt niet meer dan 50 pm. De hoogte van de neus-klem, die de schedel roteren rond de as van het oor-bars,om de toonhoogte van de schedel indien noodzakelijk niveau. De hoogte van de oor-bar zou ook moeten worden aangepast. </li><li> Gebruik een atlas 13 tot en met de coördinaten van de doelstelling van belang (Fig. 5C) ten opzichte van bregma te identificeren. Markeer de schedel boven de doelstelling (bijvoorbeeld een &quot;X&quot; of gebruik maken van Oost-Indische inkt op dot vier hoeken van een vierkant) waar een craniotomie zal worden gemaakt (afb. 5D). </li></ol> 3. Head-post en Ground Pin Installatie <ol><li> Gebruik etsen gel om de schedel te reinigen. Gebruik de applicator te schrobben en etsen gel verspreid over het oppervlak (10 sec). Wassen met water en drogen. Breng de primer voor tandheelkundige cement aan de schedel oppervlak met behulp van de applicator. Verspreid lijm met nieuwe applicator. Cure de lijm met een UV-licht-gun (1 cyclus). </li><li> Kies een locatie voor de aardingspin die distaal van de beoogde site. Voorzichtig droeg een klein gaatje in de schedel met behulp van de punt van een # 65 miniblade scalpel net breed genoeg voor de korte einde van de grond pin binnen te komen en rusten op de hersenvliezen. De aardpen moet gericht, zodat deze wijzen van bregma en de toekomst kop-post (Fig. 6A). </li><li> Zet de kop-post aan de montage bar en te blokkeren en hechten aan de micromanipulator. Door het verplaatsen van de micromanipulator in drie dimensies, de positie van de kop-post over bregma, alleen het aanraken van de schedel (Fig. 6B). De basis van het hoofd-post moet plat op de schedel. </li><li> Met behulp van dissectie probes, een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement rond het hoofd-post en op de grond pin (Fig. 6C). Druk cement tot een goed contact met de schedel verzekeren. Let op: Gebruik niet te veel cement of het zal niet uitharden gelijkmatig. Cure het cement met een UV-licht-gun (3-4 cycli vanuit meerdere hoeken). </li><li> Breng de tweede fase van cement en de opbouw van de bodem rond het hoofd-post en dekken de groeven van het hoofd-post (fig. 6D). </li></ol> 4. Craniotomie <ol><li> Zoek de craniotomie referentie-merk, die gedeeltelijk zal worden gestoord door de primer. Gebruik een # 65 scalpel op een 3 mm markeren x 3 mm vierkant rond op deze site en een daling van lidocaïne om de gevoeligheid te verminderen en om het bloeden te minimaliseren toe te passen. </li><li> Maak meerdere scores aan beide zijden van het plein (zoveel als 10), zorg dat u dwars door het bot en in de hersenen (fig. 7A). </li><li> Zodra het bot klep los komt te zitten, gebruik dan de punt van het scalpel om het te wrikken op, het verlaten van de dura mater intact (afb. 7B). </li><li> Bedek met been was. </li></ol> 5. Post-operatie <ol><li> Schakel gas verdoving en verwijder de muis van de stereotaxisch frame. </li><li> Gebruik een wattenstaafje om Lidocaïne zalf toe te passen rond de blootgestelde huid te verdoven gevoel rond wond. Gebruik een ander wattenstaafje toe te passen Neosporin op de blootgestelde huid. Injecteer ketoprofen (5 mg / kg IM of IP op basis van voorkeur van de individuele IACUC dierenartsen) alseen post-operatie analgeticum. Mouse zal in het algemeen en die zich binnen minuten van gas stoppen. </li><li> Plaats de muis in een warme kooi en de monitor totdat het klaar is om terug te keren naar huisvesting van dieren. </li><li> Het dier worden gecontroleerd op ten minste eenmaal per dag is hersteld operatie. Let op tekenen van slecht eten en / of drinken en lusteloos gedrag. Als de pijn wordt vermoed, om te voorzien ketoprofen elke 24 uur (dezelfde dosis als aan het eind van na de operatie) tot verlicht. Lidocaïne kan lokaal worden toegepast op de wond als het dier wordt krassen of tekenen van ongemak. Dieren meestal te herstellen van een operatie zonder complicaties of pijn. </li></ol> 6. Opnemen en Dye Injectie <ol><li> Wacht minstens een dag na hoofd-na de operatie voor het gebruik van de muis voor de opnames. </li><li> Plaats de muis in een schuim-remmende apparaat gegoten om het lichaam van de muis. De muis is reeds aangepast aan deze inrichting, waardoor de angst. Typische aanpassing isom de muis te verwerken elke dag na het spenen en voor ongeveer een week voorafgaand aan de operatie en experimenten, plaatst u de muis in het schuim apparaat voor 1-5 minuten. Suspendeer apparaat in de stereotaxisch frame (Fig. 4). </li><li> Beveiligde kop post-baar, dat nu is bevestigd aan het stereotaxisch frame (Fig. 4). </li><li> Maak verbinding met de grond pin met een draad afgesloten met een stompe 22-gauge injectienaald tip. </li><li> Verwijder het bot was over de craniotomie. Verwijder de dura indien nodig met behulp van de punt van een miniblade scalpel. </li><li> Rijd elektrode om de juiste stereotaxische locatie en beginnen met opnemen (fig. 8). Voor slechts elektrofysiologische opnamen kan verschillende elektroden worden gebruikt. De keuze van elektrode is afhankelijk van de plaats en vorm van de vereiste opnamen. De keuze van de elektrode voor de bewuste muis opnamen hetzelfde als wat een onderzoeker gebruikt in een verdoofde muis. Voor gecombineerde elektrofysiologische opnamen metkleurstof / tracer injecties wordt een micropipet elektrode gebruikt 10. De micropipet wordt gevuld met de kleurstof / tracer keuze zodat het iontophoretically worden geïnjecteerd aan het eind van elektrofysiologische experimenten. Multibarrel elektroden kan ook zodanig worden gebruikt dat farmacologische manipulaties kan worden. De multibarrel elektrode is bevestigd op een opname micropipet (Fig. 8). Deze technieken zijn standaard in de literatuur en niet verschillend voor anesthesie versus wakker opnamen. </li><li> Opnames kunnen worden gemaakt voor 4-5 uur gedurende 3-4 opeenvolgende dagen. </li><li> Aan het einde van de opnamesessie kan de kleurstof / tracer worden geïnjecteerd. Omdat er geen pijn receptoren in de hersenen, de iontoforetische injectie van de kleurstof of de tracer in de hersenen is het onwaarschijnlijk dat ongemak veroorzaken. Echter, zodra de elektrofysiologische respons-eigenschappen van de regio waar de injectie moet worden gemaakt worden gekenmerkt, kan het dier verdoofd met isofluraan fof injectie. Dat zou een einde eventuele ongewenste sensaties. Doordat de kleurstof / tracer is al in de micropipet, kan de actieve en massakabels omgeschakeld worden van de elektrofysiologische opname set-up van de huidige generator om iontophoretically injecteren de kleurstof / tracer. Gebruik geschikte protocol voor de kleurstof / tracer in de elektrode. Haal het dier uit de headpost terughoudendheid en lichaam beheersen en terug te keren naar zijn kooi. </li><li> Aan het einde van het experiment, volg juiste protocol voor euthanasie en weefsel verwerking plaats van de injectie en de etikettering te herstellen. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Succesvolle installatie van het hoofd-post kan de experimentator moet enkel-en meervoudige antwoorden opnemen vanaf een unanesthetized, wakker muis over meerdere dagen. Het beveiligingssysteem zorgt voor een stabiele elektrofysiologische opnamen van enkele neuronen in de hersenen. Uitstekende isolatie van afzonderlijke eenheden en sterke reacties to stimuli worden opgenomen van dezelfde hersenstructuur over meerdere dagen, bijvoorbeeld in de muis lage colliculus (Fig. 9A, dag, Figuur 9B, dag twee). Met een goede kop-post installatie, zal elke muis steeds worden afgestemd op de stereotaxische apparatuur en de muis stereotaxische atlas, 13 wat resulteert in betrouwbare lokalisatie van bepaalde hersenkernen. Deze betrouwbare lokalisatie zorgt voor een injectie van kleurstoffen en tracers in specifieke structuren na meerdere opname dagen. Bijvoorbeeld, om te beoordelen aflopende projecties van de auditieve middenhersenen naar de auditieve hersenstam, gebiotinyleerd dextraan amine (gevisualiseerd met behulp van diaminobenzidine als chromageen) kan worden geïnjecteerd in de muis colliculus inferior (Fig. 10A) na elektrofysiologische het identificeren van neuronale respons-eigenschappen op de plaats van injectie (in Fig. 10A een neuron is opgenomen met een beste frequentie van 51 kHz) en na verwerking weefsel eennterograde etikettering in de contralaterale dorsale cochleaire nucleus kan zijn gevisualiseerd en uitgezet (Fig. 10B). Microfoto&#39;s met een hogere resolutie kan ook worden verkregen op anterogradely gelabeld axonen en terminals (Fig. 10C) te bekijken. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figuur 1. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figuur 2. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figuur 3. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figuur 4. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figuur 5. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <sTrong&gt; Figuur 6. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figuur 7. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figuur 8. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figuur 9. <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figuur 10.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li>
<li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li>
<li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li>
<li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li>
<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Het voordeel van het hoofd-post beveiligingssysteem voor elektrofysiologische en neuroanatomische experimenten in de muis is dat experimenten kunnen worden uitgevoerd met unanesthetized, wakker muizen, waardoor de potentiële reactie verontreiniging als gevolg van anesthetica. Bovendien is de opstelling kan worden over meerdere dagen een efficiëntere huisdieren. De meeste onderdelen voor het hoofd-post zijn off-the-shelf. Alleen het hoofd-post en montage apparaten zijn op maat gemaakt, die be...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Etch gel voor het reinigen van de schedel voorafgaand aan de tandheelkundige cement </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk met 1,2 ml spuiten </td></tr><tr><td> Primer voor tandheelkundige cement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25881 </td><td> 8 ml fles </td></tr><tr><td> Lijm voor tandheelkundige cement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25882 </td><td> 8 ml fles </td></tr><tr><td> Applicators voor tandheelkundige cement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Dental Cement </td><td> Charisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> 4gm Spuit Refill </td></tr><tr><td> Tungsten Rod (Ground Pin) </td><td> AM Systems </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;diameter </td></tr><tr><td> Economie UV uithardingslamp </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Head-bericht </td><td> Gebouwd in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montage bar </td><td> Gebouwd in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montageblok </td><td> Gebouwd in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxisch frame </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Muis en neonatale rat Adapter </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> Deltaphase Isothermische Pad </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van een awake muis voor opnemen neurale reacties en injecteren van tracers

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Het is algemeen bekend dat verdoving neurale respons-eigenschappen verandert in verschillende regio&#39;s van de hersenen. 13. In het auditieve systeem, zijn fundamentele antwoord eigenschappen van neuronen hersenstam inclusief drempel, frequentie specificiteit en remmende zijbanden veranderd in belangrijke opzichten onder narcose 1-2. Deze waarnemingen gevraagd fysiologen zoeken naar manieren om van enkele neuronen op te nemen zonder de vervuilende effecten van narcose te zoeken. Het resultaat was een decerebratie preparaat, waarbij de hersenstam volledig was doorsneden ter hoogte van de middenhersenen 4. De nadelen van dit preparaat zijn een formidabele chirurgie, de eliminatie van dalende projecties van de voorhersenen, en een onvermogen om zintuiglijke stimulatie te gebruiken om structuren te onderzoeken boven de middenhersenen. Een andere strategie is om chronisch implanteren elektrode arrays op te nemen van enkele neuronen en meervoudige clusters, terwijl het dier wakker is en / of gedraagt ​​5,6 </sup&gt;. Deze technieken zijn echter niet compatibel met het injecteren van tracer kleurstoffen na de eerste elektrofysiologische eigenschappen van een hersenstructuur. Om te voorkomen dat te veranderen neurale respons-eigenschappen met anesthetica tijdens het opnemen van elektrofysiologische respons-eigenschappen van enkele neuronen, hebben we aangepast een hoofdsteun techniek die lang gebruikt bij vleermuizen 7-9 de muis 10-12. Met behulp van deze methode zijn wij in staat om elektrofysiologische opnames uit te voeren gedurende een aantal dagen in de unanesthetized muis. Aan het einde van de opnames, kan men dan injecteren kleurstof elektrode posities opname locaties reconstrueren of tracer injecteren zodat trajecten en naar de opname loci kan worden bepaald. Deze methode zorgt voor een goed geïsoleerd enkel neuron-opnamen over meerdere dagen zonder het gebruik anesthetica.

Elektrofysiologische eigenschappen van de neuronale antwoorden is van belang voor het begrijpen van de hersenfunctie en voor het geleiden van de plaatsing van kleurstoffen voor route tracing. Er zijn echter vele studies uitgevoerd in verdoofde dieren. Om de hersenfunctie te begrijpen zonder verdoving, ontwikkelden we een methode om neuronale respons-eigenschappen op te nemen en te injecteren kleurstoffen in wakkere muis.

Voorbereiding van een Awake Muis voor opnemen Neurale Reacties en injecteren van Tracers

Het is algemeen bekend dat anesthesie de neurale responseigenschappen in verschillende hersengebieden verandert.13. In het auditieve systeem worden fundamentele responsen ...

Het algemene doel van deze procedure is om reacties van individuele neuronen in een wakker muismodel vast te leggen. Dit wordt bereikt door de muis eerst onder narcose te brengen via isofluoraan-inhalatie, de muis in een stereotaxisch frame voor knaagdieren te plaatsen en de schedel vrij te leggen. De tweede stap is het lokaliseren van het relevante hersengebied met behulp van stereotaxische coördinaten en het markeren van dit gebied voor een daaropvolgende craniotomie.Vervolgens wordt een op maat gemaakte hoofdklem op de schedel gemonteerd en wordt deze geplaatst in een bevestigingsstang die is bevestigd aan een micromanipulator op het stereotaxische apparaat. De laatste stap is het uitvoeren van een craniotomie om een elektrode in de hersenen te kunnen inbrengen. Zodra de muis hersteld is van de operatie, wordt de muis vastgezet in een schuimblok.De hoofdkop wordt teruggeplaatst in de montagebalk en bevestigd aan een op maat gemaakt stereotaxisch apparaat, waarna een micropipetelectrode in de hersenen kan worden ingebracht. Deze procedure maakt de isolatie van individuele eenheden mogelijk. Sterke reacties op stimuli kunnen over meerdere dagen vanuit dezelfde hersenstructuur worden geregistreerd, en sporen kunnen worden gebruikt om ascenderende of descenderende projecties naar fysiologisch geïdentificeerde regio's te onderzoeken, zonder dat de reacties door anesthetica worden beïnvloed.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de responseigenschappen van neuronen niet worden beïnvloed door anesthetica. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Zachary Mako, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de hoofdondersteuning voor te bereiden, stelt u eerst een op maat gemaakte hoofdpost samen door een gat te boren in een roestvrijstalen staaf van 15 millimeter en 3/32 inch. Plaats vervolgens een roestvrijstalen rolpen van 20 millimeter loodrecht in het gat.Maak een kruisdraad aan één uiteinde van de verticale staaf om een schroef van maat 1-72 op te kunnen nemen, zoals hier getoond. Bereid vervolgens de montagebalk voor. Dit onderdeel van de apparatus bestaat uit een langere koperen of aluminium balk van ongeveer 90 millimeter lang en 5 tot 10 millimeter breed, en een kortere balk van 15 millimeter lengte die onder een hoek van 45 graden aan het uiteinde van de lange balk is bevestigd.De kortere staaf heeft één inkeping aan de onderzijde en een kortere inkeping over de breedte; plaats de hoofdklem in deze inkepingen, waarbij het dwarsstuk in de kortere inkeping rust. Het montageblok bestaat uit twee stukken aluminium die met schroeven tot een blok van ongeveer 30 millimeter bij 30 millimeter bij 25 millimeter zijn samengevoegd, met een uitsparing om de montagebeugel vast te houden. Plaats de montagebeugel parallel aan het tafeloppervlak in de uitsparing van het montageblok. Bevestig het montageblok aan een micromanipulator, zodat de positie van de hoofdklem nauwkeurig langs de middenlijn en de brema kan worden geplaatst.Snijd tot slot een wolfraamstaafje met een diameter van 0,01 inch tot een lengte van ongeveer vijf millimeter, waarbij ongeveer één millimeter in een hoek van 45 graden is gebogen. Dit staafje dient als aardpen. Nadat het dier in een inductiekamer met 5% isofluraan is geplaatst, moet worden vastgesteld of het dier volledig is geanestheseerd door middel van een knijpprik in de teen en het controleren op de afwezigheid van een reactie.Zodra de muis volledig is geanestheseerd, wordt deze in het stereotactische frame voor knaagdieren, uitgerust met een muisadapter, geplaatst door eerst de tanden in het gat van de bijtstang te plaatsen en de neusklem voorzichtig aan te draaien tot deze stevig vastzit. Om ervoor te zorgen dat het dier geanestheseerd blijft, wordt een gezichtsmasker gemaakt van een stuk latex handschoen over de neus van de muis geplaatst en wordt 5% isofluorine gehandhaafd totdat de ademhalingsfrequentie ongeveer één ademteug per seconde bedraagt.Verlaag na die tijd de concentratie isofluraan naar 1,5 tot 2%. Zet nu de kop vast door de oorstaven voorzichtig in elk gehoorgang te plaatsen. Fixeer de oorstaven zodanig dat ze stevig zitten, maar zorg dat ze niet te diep in de gehoorgangen doordringen en het trommelvlies niet doorprikken. Plaats een warmtepad met gel onder de muis.Breng vervolgens voorzichtig oogsalve aan om uitdroging van de ogen te voorkomen. Gebruik hiervoor een kleine trimmer of een fijne schaar. Verwijder het haar tussen de oren tot aan de ogen.Reinig en steriliseer nu de hoofdhuid met een chlorhexidine- of Betadine-scrub, gevolgd door een alcoholspoeling die drie keer wordt herhaald. Maak een incisie langs de middellijn van de achterkant van het hoofd naar de ogen. Schraap indien nodig het periosteum tot aan de randen van de incisie met een scalpel.Trek de musculatuur in de nek voorzichtig terug met een pincet, waarbij de spier langs de fascia mag scheuren om bloedverlies te minimaliseren. Breng gel-foam aan onder het hoofdhuidweefsel om vocht te minimaliseren en te voorkomen dat de huid over de schedel verschuift. Bevochtig vervolgens een wattenstaafje met isopropylalcohol en droog het schedeloppervlak om de visualisatie van de schedelkenmerken te verbeteren.Zodra het dier is voorbereid, plaatst u een fijn puntige sonde, zoals een geslepen metalen staaf, in de電rodehouder en bevestigt u deze aan de stereotaxische micromanipulator. Beweeg de sonde heen en weer tussen bregma en lambda, waarbij u ervoor zorgt dat de lateromediale coördinaat voor elke locatie niet meer dan 50 micron verschilt.Positioneer de kop voorzichtig opnieuw met behulp van de oorstaven indien nodig. Controleer of het verschil in dorsoventrale hoogte bij Bgma en Lambda niet meer dan 50 microns bedraagt. Pas indien nodig de hoogte van de neusklem aan om de pitch van de schedel te nivelleren; mogelijk moet ook de hoogte van de oorstaven worden aangepast.Gebruik een atlas van de muizenhersenen om de coördinaten van het beoogde doelgebied ten opzichte van bgma te bepalen. Gebruik India-inkt om de schedel boven het doelgebied te markeren waar de craniotomie zal worden uitgevoerd. Maak eerst de schedel schoon door tandetsetselgel over het oppervlak te verspreiden en dit ongeveer 10 seconden lang te schrobben.Was daarna met water en droog volledig. Breng vervolgens de adhesieve primer voor het tandcement aan op het oppervlak van de schedel. Gebruik de applicator en gebruik daarna een nieuwe applicator om de adhesief te verspreiden; hard de adhesief uit met één cyclus van een UV-lamp.Identificeer een locatie distaal van de doelplaats. Gebruik voor de installatie van de aardpin de punt van een scalpel met een mini-mesje nummer 65 om voorzichtig een klein gaatje in de schedel te boren. Op dit punt moet het gat breed genoeg zijn voor het korte uiteinde van de aardpin.Plaats de geaarde pin zodanig dat deze op de meninges rust. Zorg ervoor dat de pin is georiënteerd zodat deze van bgma en de bevestigingsplaats van de hoofdpost af wijst. Verplaats nu de micromanipulator zodat de hoofdpost boven bgma is gepositioneerd en net de schedel raakt.De basis van de hoofdklem moet plat op de schedel rusten. Gebruik vervolgens dissectienaalden om een kleine hoeveelheid tandhechtcement rond de hoofdklem en de aardingspen aan te brengen. Druk het cement aan om een goed contact met de schedel te garanderen.Hard vervolgens uit met drie tot vier cycli van een UV-lamp. Breng tenslotte een tweede laag cement aan om de basis rond de hoofdpil op te bouwen, bedek de groeven van de hoofdpil en hard dit uit. Lokaliseer vooraf het referentiepunt van de craniotomie, dat gedeeltelijk door de primer zal zijn bedekt.Gebruik vervolgens een scalpellschemmetje met een mesje nr. 65 om een vierkant van drie millimeter bij drie millimeter rond deze plek te markeren. Breng een druppel lidocaïne-oplossing aan om de gevoeligheid te verminderen. Maak nu meerdere inkepingen aan elke zijde van het vierkant, waarbij u er goed op let dat u niet door het bot heen in de hersenen snijdt.Zodra de botlap losraakt, gebruikt u de punt van het scalpel om deze op te wippen, waarbij de dura mater intact blijft. Dek het gebied vervolgens af met botwas. Wanneer de operatie is voltooid, schakelt u de isofluraan uit en maakt u de muis los uit het stereotaxisch frame.Breng lidocaïne aan op de blootgestelde huid, gevolgd door het aanbrengen van neosporine, dien postoperatieve analgesie toe zoals aangegeven door de dierenarts en plaats de muis terug in de thuiskooi. Na 24 uur kan de muis worden gebruikt voor elektrofysiologische opname. Deze figuur demonstreert dat een succesvolle installatie van de hoofdpost de experimentator in staat stelt om over meerdere dagen single-unit en multi-unit responsen op te nemen bij een wakkere muis.Het fixatiesysteem maakt stabiele elektrofysiologische opnames van individuele neuronen in de hersenen mogelijk. Uitstekende isolatie van individuele eenheden en sterke responsen op stimuli kunnen gedurende meerdere dagen uit dezelfde hersenstructuur worden opgenomen. Bijvoorbeeld, in de collliculus inferior van de muis over een periode van twee dagen; het linkerpaneel toont opnames verkregen op dag één en het rechterpaneel op dag twee om descenderende projecties van het auditieve middenbrein naar de auditieve hersenstam te beoordelen. Biotinylering, dextra en amine, gevisualiseerd met Dino Benadine als chromogeen, kunnen in de collliculus inferior van de muis worden geïnjecteerd, zoals hier te zien is na elektrofysiologische identificatie van neuronale responseigenschappen op de injectieplaats en na weefselverwerking.Anterograde labeling in de contralaterale dorsale cochleairnucleus kan worden gevisualiseerd en uitgezet zoals hier wordt gedemonstreerd. Fotomicrografieën met een hogere resolutie kunnen ook worden verkregen om anterograde gelabelde axonen en terminalen te bekijken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u responseigenschappen van individuele neuronen kunt registreren en kleurstoffen of tracers kunt injecteren voor neuroanatomische studies in een wakkere muis.Deze preparatie elimineert de invloed van anesthetica op de eigenschappen van de neurale respons en maakt het mogelijk om gedurende meerdere dagen experimenten uit te voeren met hetzelfde dier. De sleutel tot de procedure is om ervoor te zorgen dat de hoofdhouder stevig op de schedel is gemonteerd en dat de muis goed is gefixeerd. Hoewel deze video heeft geïllustreerd hoe deze procedure kan worden gebruikt voor registraties van individuele neuronen in het auditieve systeem, kunnen andere hersengebieden met deze techniek worden bestudeerd.

preparation-an-awake-mouse-for-recording-neural-responses-injecting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the study of neuronal activity in a specific region of the mouse brain that processes auditory stimuli. The technique involves applying an inhibitory neurotransmission blocker and comparing neuronal responses to auditory stimuli before and after the drug is applied to the localized brain region.

Investigating Auditory Neuronal Responses in an Awake Mouse in the Presence of an Inhibitory Neurotransmitter Blocker

This video demonstrates a technique for implanting an electrode assembly into a mouse brain. The assembly contains bipolar electrodes to record activity from the hippocampus and a reference electrode to obtain baseline activity from the cerebellum. An anesthetized mouse is placed on a stereotaxic frame, and the electrode assembly is implanted in the target brain region. The animal is then allowed to recover before performing electrophysiological recording.

Implantation of an Electrode Assembly in a Mouse Brain for Electrophysiological Recording

Source: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the method of juxtacellular recording and staining in a restrained, awake rat. The procedure involves recording signals from neurons and injecting dye to precisely localize the recording site. This technique allows accurate mapping of neural activity to the brain's anatomical structure.

Juxtacellular Recording and Staining for Precise Mapping of Neural Activity in an Awake Rat 

De registratie van elektro-encefalogram (EEG) en elektromyogram (EMG) bij muizen die zich vrij kunnen bewegen, is een cruciale stap om gedrag en fysiologie te correleren met slaap en waakzaamheid. Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven, biedt een kabelgebaseerd systeem voor het verkrijgen van EEG- en EMG-opnamen bij muizen.

Huisstijlen Opname Procedure voor het meten van de Slaap in Muizen

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

We hebben een vereenvoudigde en kosteneffectieve aanpak ontwikkeld voor de fabricage van elektroden en hebben opnames gemaakt van signalen in meerdere regio's bij vrij bewegende muizen. Door gebruik te maken van optogenetica, naast elektrofysiologie in meerdere regio's en registratie van calciumsignalen, kon de onthulling van neuronale activiteiten in verschillende regio's in het aanvalsaanmaakmodel worden vastgesteld.

Een geïntegreerde methode voor het maken van flexibele en handige elektrofysiologische optrodes voor in-vivo-opname in meerdere regio's

Dit protocol beschrijft een methode om in vivo opnames van één neuron met hoge dichtheid te verkrijgen van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie. Deze benadering wordt gebruikt om het afvuren van het actiepotentiaal van neuronen in het ventrolaterale periaqueductale grijs te meten - een hersenstamgebied dat inactief is tijdens de Rapid Eye Movement (REM)-slaap - voor en tijdens algemene anesthesie.

Acute single-unit multi-elektrode-opnames van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie

Leer een methode voor het opnemen van neurale reacties bij wakke muizen met behulp van stereotaxische chirurgie en elektroden. Deze techniek maakt nauwkeurige studies van hersenfunctie zonder invloed van anesthetica mogelijk.

Voorbereiding van een Awake Muis voor opnemen Neurale Reacties en injecteren van Tracers

Meer video's verkennen