Name: Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer hoe je kolonisatie van Euprymna scolopes inktvissen door Vibrio fischeri bacteriën evalueert. Deze methode meet bioluminescentie en kolonievorming om gastheer-microbe interacties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Mattias Gyllborg voor inktvis facilitaire ondersteuning en voor reacties op dit manuscript, Michael Hadfield en de Kewalo Marine Laboratory voor hulp tijdens de veld verzamelen, en leden van de Ruby en McFall-Ngai Laboratorium voor bijdragen aan dit protocol. Werk in de Mandel Laboratorium wordt ondersteund door NSF IOS-0843633.

1. Voorbereiding van Bacteriële Inocula <ol><li> Dag 0 Twee dagen voorafgaand aan de inktvis inoculatie, het bord van de relevante bacteriestammen op LBS 13 agar. </li><li> Incubeer bacteriën bij 25-28 ° C geroerd. </li><li> Dag 1 Inoculeer 3 ml LBS medium in een glazen cultuur buis met een kolonie van elk V. fischeri stam voor infectie. Bereid dubbele buizen als back-up. </li><li> Dag 2 (Coördineren van bacteriële stappen 1.4-1.6 met inktvis stappen 3.7-3.10) 1 h vóór de inoculatie, subcultuur bacteriën 1:80 (37,5 pi) in 3 ml LBS in een glazen buis en cultuur groeien gedurende 1 uur met beluchting. </li><li> Meet de OD 600 van het monster vóór de inoculatie. Metingen zijn 0.3-0.6 afhankelijk van de stam. </li><li> Een doel inoculum van 3-5 x 10 3 CFU / ml berekenen inoculum volume als volgt: Inoculum volume (il) = 1,25 / OD 600 (bijvoorbeeld voor OD 600 = 0,5, de berekende inoculum volume = 1.25/0.5 = 2,5 pi). Dit bedrag wordt direct toegevoegd aan het zeewater met inktvis in stap 4.1. Deze berekening moet mogelijk worden aangepast voor verschillende stammen van V. fischeri of voor inoculatie met lagere of hogere niveaus dan de hier aangegeven. </li></ol> 2. Voorbereiding van Agar Platen voor de telling van de Inocula <ol><li> Voor elke behandeling, label LBS platen (2 per behandeling) tot op het bord monsters van het inoculum in stap 4.1. </li><li> Voeg 5 steriele plating kralen per plaat. </li></ol> 3. Het verzamelen van Squid Jeugdigen <ol><li> Meet het zoutgehalte van Instant Ocean met behulp van de refractometer en aan te passen tot 35 ‰. </li><li> Filter 1 L van Instant Ocean met behulp van de filtratie-eenheid en een aangrenzende vacuüm lijn of vacuümpomp, om een ​​filter gesteriliseerde Instant Ocean (FSIO) te genereren. Zuurstof in het water door het kolkende krachtig voorafgaand aan elke aflevering. The filter kan worden hergebruikt voor 2 dagen. </li><li> Aliquot 40-50 ml van FSIO in elk van twee (2) wegwerp monster kommen. Label een als primeurs en een als timelies. </li><li> Bereid een teveel aan plastic overdracht pipetten voor het verwerven van jonge inktvis door het snijden van de pipet ongeveer 1 cm van de punt, boven de laagste randen (zie figuur 3). Dit vergemakkelijkt een groter gebied, waardoor de inktvis kan passeren bij de inzameling. Gooi transferpipetten waarin een ruw oppervlak blootgesteld. </li><li> Met behulp van voorbereide overdracht pipetten, het verzamelen van E. scolopes dat &#39;s nachts uitgekomen en over te dragen aan de primeurs kom FSIO. Vroege jongen zijn in het ei-systeem voor meer dan 1 uur en zijn gevoelig voor kolonisatie door vervuilende V. fischeri het ei systeem. Gebruik geen primeurs voor gevoelige kolonisatie experimenten. </li><li> Controleer ei tanks elke 30-45 min voor de nieuwe jongen. Zorg ervoor dat alle jongen worden gewist tijdens elke check. Verwijder de jongen met een transfer pipet, en storting in de timelies kom FSIO. Dieren verzameld in een tijdig beschikbaar zijn voor kolonisatie experimenten. </li><li> Wanneer de collectie klaar is (~ 45 min na zonsondergang), over te dragen van de inktvis naar de belangrijkste laboratorium. Empirisch is het voordelig om de dieren te koloniseren onder ononderbroken laboratorium licht gedurende 3 uur injecties. </li><li> Voor elke behandeling, bereidt u een kom met 40 ml FSIO. Voeg inktvis de schalen voor de test (maximaal n = 40 per bak). </li><li> Bereid een extra kom als een aposymbiotic (negatieve) controle. </li><li> Bereid een speciale transferpipet voor elke behandeling. </li><li> Euthanaseren extra inktvis in 2% ethanol. </li></ol> 4. Squid Colonization <ol><li> Dag 2 - met een P10 Pipetman, afgezien de berekende hoeveelheid bacteriën (stap 1,5) in elke squid schaal (stap 3.8) voor elke behandeling. Start een 3 uur timer onmiddellijk nade eerste inenting. </li><li> Voor elke behandeling, maak dan een &#39;vortex&#39; in de kom met de speciale transferpipet door het plaatsen van de pipet aan de rand van de kom en en neer te pipetteren herhaaldelijk op het water en inktvis te mengen voor ongeveer 10 sec. Grondig mengen is van cruciaal belang. </li><li> Plaat 50 ul van elke kom op een LBS-agarplaat van Stap 2.2 (voor technische replica, plaat twee 50 ul platen per behandeling). Incubeer bij 25-28 ° C geroerd. </li><li> Bereid wassen kommen (100 ml FSIO / e bis) voor elke behandeling. </li><li> Bereid Drosophila flacons (4 ml FSIO / EA) voor elke inktvis. </li><li> Na precies 3 uur, over te dragen de inktvis aan hun respectieve waskommen (compleet voor alle behandelingen). Dit stopt de inenting. </li><li> Ga verder met elke individuele inktvis over te dragen aan zijn eigen Drosophila flacon met FSIO. Gebruik een aangewezen transferpipet voor elke behandeling. </li><li> Verplaats trays van Drosophila flacons aan de inktvis mogelijkheid om terug te keren naar de dag / night lichtcyclus de dieren ervaren tijdens de embryogenese. </li><li> Dag 3 - Bereid Drosophila flacons (4 ml FSIO / EA) voor elke inktvis. </li><li> Voorafgaand aan de schemering te 22-24 uur na inenting, breng elke inktvis aan een nieuwe Drosophila flacon. Gebruik een aangewezen transferpipet voor elke behandeling. </li><li> Dag 4 - Bereid het label 1,5 ml microcentrifugebuizen (1/squid). </li><li> Voorafgaand aan de schemering op 46-48 uur na inenting, meet en noteer de luminescentie van elke inktvis in de Drosophila flacon (luminometer set voor integratie 6 s en auto-lezen op deksel sluiting). </li><li> Als negatieve controle voor achtergrond luminescentie, meet een flacon met FSIO dat bevat geen inktvis. </li><li> Overdracht elk squid in een volume van circa 700 pi van een 1,5 ml microcentrifugebuisje uit stap 4.12. Ga naar een kartonnen doos vriezer. Zodra het deksel wordt geplaatst op de doos, verwijder het niet als het licht aanwijzingen voor bacteriën uitzetting niet WELl-begrepen. </li><li> Freeze microcentrifugebuizen bij -80 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 5. Bepaling van kolonisatie niveaus <ol><li> Voor elke squid, bereid twee (2) PCR met elk 475 pi FSIO (of autoclaaf 70% Instant Ocean). </li><li> Bereid stampers door eerst met behulp van een Kimwipe ook het slot schoon te maken en grove puin en / of weefsel te verwijderen. </li><li> Plaats stampers tip-down in een 50 ml bekerglas met 95% ethanol. Ethanol worden toegevoegd aan een hoogte van ongeveer 3 cm. </li><li> Voor elke stamper, te verwijderen uit de beker en veeg de punt met een Kimwipe. </li><li> Dompel stamper terug in de ethanol bad, te verwijderen en plaats (punt naar boven) in een microcentrifugebuis rack en volledig laten drogen aan de lucht voor ongeveer 15 minuten. </li><li> Dooi inktvis in een microcentrifugebuis rack (maximaal n = 8). </li><li> Indien nodig, het volume tot 700 ul. </li><li> Met behulp van een stamper van Stap 5,5, kan het dierlijk weefsel totdat de inkt weg RUPturen (het water zal een donkere grijze kleur te zetten). </li><li> Verwijder de stamper en zorgen dat alle weefsel blijft in de buis. </li><li> Vortex het weefsel kort voor precies 10 seconden (gebruik maken van een timer). </li><li> Laat het weefsel rusten gedurende 10 minuten. Het weefsel zal bezinken en de bacteriën en inkt in oplossing blijven. Voor de berekeningen die volgen, de bacterie / inkt oplossing is de [A] verdunning (dat wil zeggen de E. scolopes lichtorgel homogenaat in 700 pi). Seriële 1:20 verdunningen ([B], [C]) worden hieronder beschreven. </li><li> Voor [B] verdunning voeg 25 ul [A] een der reactievaatjes bereid in stap 5.1. Vortex. </li><li> Voor [C] verdunning voeg 25 ul [B] een van de reactievaatjes bereid in stap 5.1. Vortex. </li><li> Plaat 50 ul van elke verdunning op LBS-agar, 2 duplo&#39;s per behandeling. </li><li> Incubeer de platen bij 25-28 ° C geroerd. </li></ol> 6. Data-analyse <ol><li> Om de CFU / lichtorgel (LO), landen te berekenent kolonies op de plaat voor elke behandeling waarbij 10-400 kolonies aanwezig zijn, en gebruik de juiste formule: CFU / LO = (kolonies op [A] plaat) x 14, of CFU / LO = (kolonies op [B] plaat) x 280, of CFU / LO = (kolonies op [C] plaatje) x 5600. </li><li> Zet individuele gegevens punten en medianen op een logaritmische schaal. </li><li> De gegevens worden vaak niet normaal verdeeld, met verschillende varianties, en de uitschieters kunnen biologisch zinvolle informatie bevatten. Derhalve niet-parametrische tests een bruikbare methode of de behandeling aanzienlijk verschillen. </li><li> Gebruik GraphPad Prism-software voor statistische analyse. Voor twee behandelingen, gebruik maken van de Wilcoxon Rank Sum test. Voor vergelijkingen tussen meer dan twee behandelingen, gebruik maken van de Kruskal-Wallis test met de juiste post-tests. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Resultaten van een monster kolonisatie assay worden getoond in Figuur 4. Twee stammen van <em&gt; V. fischeri dat verschillende relatieve niveaus van de luminescentie vertonen waren elke geënte in zes inktvis, samen met zes inktvis die diende als aposymbiotic (uncolonized) controles. De E. scolopes symbiont, ES114 14, en hoe helderder Sepiola robusta symbiont, SR5 15,16. Soortgelijke inoculumniveaus (Fig. 4A) tot 100% kolonisatie binnen 3 h. Na 48 uur werden de luminescentie niveaus (Fig. 4B) en CFU tellingen (fig. 4C) bepaald de kolonisatie beheersing van de stam beoordelen. Bepaling van de specifieke luminescentie (afb. 4D; per bacterie) maakt voor het bepalen van de helderheid van elke bacteriestam tijdens de symbiose. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van de kolonisatie procedure. Bacteriën en inktvis worden apart geoogst, vervolgens gemengd op de opgegeven inoculum. Squid gewassen, vervolgens overgebracht naar nieuwe water 3 uur, 24 uur en 4<html> 8 uur na enting. Na 48 h de luminescentie wordt gemeten en de dieren bevroren, die dient om het oppervlak gesteriliseerd de dieren. Light-orgaan gekoloniseerd bacteriën levensvatbaar blijven bij -80 ° C door een dooi (geen extra vries-ontdooi cycli). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig2.jpg" /> Figuur 2. Stroomschema homogenisatie en verdunningseffect van de bacteriën. Serial 20-voudige verdunningen de passende dynamisch bereik voor de telling van gekoloniseerde bacteriën. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig3.jpg" /> Figuur 3. Breng pipetten met een geschikt smalle schacht taps naar een smalle boring (A) dat de jonge inktvis zou beschadigen. Voorbehandeling door het afsnijden van het smalste deel met een schaar of een scheermesje levert een geschikt instrument (B) voor het overbrengen van jonge inktvis. s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Voorbeeld van gegevens voor een kolonisatie test. (A) Het niveau van de bacteriën in het inoculum kommen. (B) luminescentie van individuele inktvis. (C) kiemgetal van individuele inktvis. (D) Specifieke luminescentie van individuele inktvis. Apo, Aposymbiotic (uncolonized negatieve controle).

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215-218 (2009).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Malic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+specific+bacteria+in+wound+biofilms+using+peptide+nucleic+acid+fluorescent+in+situ+hybridization+%28PNA+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH).</a> Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+a+cooperative%2C+bacterial-animal+association%3A+the+Vibrio+fischeri-Euprymna+scolopes+light+organ+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis.</a> Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Jones, B., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterillumination+in+the+Hawaiian+bobtail+squid%2C+Euprymna+scolopes+Berry+%28Mollusca%3A+Cephalopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda).</a> Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).</li>
<li>Graf, J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+amino+acids+support+the+proliferation+of+symbiotic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).</li>
<li>Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+squid+that+glows+in+the+night%3A+development+of+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism.</a> J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).</li>
<li>Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hawaiian+bobtail+squid+%28Euprymna+scolopes%29%3A+a+model+to+study+the+molecular+basis+of+eukaryote-prokaryote+mutualism+and+the+development+and+evolution+of+morphological+novelties+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStabb%2C+E+%22Recent+Advances+in+Marine+Science+and+Technology%22">Recent Advances in Marine Science and Technology</a>. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).</li>
<li>Boettcher, K. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+light+emission+by+symbiotic+Vibrio+fischeri+of+the+sepiolid+squid+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes.</a> J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).</li>
<li>Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+niche+for+Vibrio+logei%2C+the+predominant+light+organ+symbiont+of+squids+in+the+genus+Sepiola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola.</a> J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).</li>
<li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+rapid+evolution+of+the+luxR-luxI+intergenic+region+to+the+diverse+bioluminescence+outputs+of+Vibrio+fischeri+strains+isolated+from+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven kolonisatie assay maakt analyse van een natuurlijk proces symbiotische in een gecontroleerde laboratorium. Als zodanig kan worden gebruikt om kolonisatie beoordelen door mutante stammen door verschillende natuurlijke isolaten en onder verschillende chemische regimes. Variaties op de beschreven experimenten worden vaak gebruikt om verschillende aspecten van de symbiose te beoordelen. De kinetiek van de kolonisatie kan worden gemeten door behandeling luminescentie tijdens de eerste 24 uur, die automatisch ku...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Glas Cultuur Buizen, 16 mm diameter </td><td> VWR </td><td> 47729-580 </td><td></td></tr><tr><td> Caps voor het Glazen Cultuur Tubes </td><td> Visser </td><td> NC9807998 </td><td></td></tr><tr><td> Zichtbaar spectrofotometer voor de bepaling van OD 600 </td><td> Biowave </td><td> CO8000 </td><td> Een spectrofotometer geschikt voor het meten OD 600 zal werken. Dit apparaat kan de OD-600 direct te meten van de vloeistof in het glas cultuur buizen. Enige aanpassing van het inoculum berekening noodzakelijk zijn afhankelijk van de gebruikte instrument. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer </td><td> Promega </td><td> E5311 </td><td> Vergelijkbaar met de Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Inclusief de microcentrifugebuis houder. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 licht Standard </td><td> Promega </td><td> E5341 </td><td> Voor kalibratie luminometer. </td></tr><tr><td> Refractometer, Handheld </td><td> Foster en Smith Aquatics </td><td> CD-14035 </td><td> Kalibreer voor elk gebruik met gedemineraliseerd water. Spoel na elk gebruik met gedemineraliseerd water om zout Voorkom het opbouwen. </td></tr><tr><td> Instant Ocean (kunstmatig zeewater concentraat) </td><td> Foster &amp; Smith Aquatics </td><td> CD-16881 </td><td> Bereid op 35 ‰ in gedeïoniseerd water, met behulp van de refractometer, gevolgd door filtreren door een 0,2 um SFCA filter. </td></tr><tr><td> Filtratie-eenheid </td><td> Nalgene </td><td> 158-0020 </td><td> Vrij van oppervlakteactieve celluloseacetaat (SFCA) membraan 0,2 pm. Wij hebben waargenomen verschillende resultaten enkele oppervlakte-bevattende PES filters. </td></tr><tr><td> Transfer Pipetten </td><td> Visser </td><td> 13-711 -9 uur </td><td> Met behulp van schaar of scheermesje, snij de punt netjes boven de eerste graat naar de diameter van de pipetpunt te verhogen en te voorkomen knijpen de inktvis jongen. </td></tr><tr><td> Wegwerp Sample Bowls (plastic bekers) </td><td> Komeet </td><td> T9S (9 oz.) </td><td> Kommen voor de enting, met boven een diameter van 3 ¼ &quot;, lagere diameter van 2 ¼&quot;, hoogte 3 &quot;. Schalen creëren van een homogene omgeving omdat ze geen onderrand, waar inktvis vast komt te zitten in een zuurstofarme niche. De grootte is geoptimaliseerd voor 40-ml inoculum. Verkrijgbaar bij webstaurantstore.com, # 619PI9. </td></tr><tr><td> Drosophila Vials </td><td> VWR </td><td> 89092-720 </td><td> Vial diameter overeenkomt met de opening aan de luminometer PMT. </td></tr><tr><td> 1,5 ml PCR </td><td> ISC Bioexpress </td><td> C-3217-1CS </td><td> Buizen moeten passen bij de vorm van de stampers. </td></tr><tr><td> Ethanol, 200 Proof </td><td> Visser </td><td> BP2818-100 </td><td></td></tr><tr><td> Stampers </td><td> Kimble Chase / Kontes </td><td> 749521-1500 </td><td></td></tr><tr><td> Plating kralen, 5 mm diameter </td><td> Kimble Chase </td><td> 13500 5 </td><td> Bereid 5 per buis en autoclaaf. </td></tr></tbody></table>

kolonisatie van euprymna scolopes squid door vibrio fischeri</em

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specifieke bacteriën worden gevonden in samenwerking met dierlijk weefsel 1-5. Deze host-bacteriële verenigingen (symbiose) kunnen schadelijk zijn (pathogene), hebben geen fitness gevolg (commensale), of nuttig zijn (mutualistische). Hoewel veel aandacht is besteed aan pathogene interactie, is er weinig bekend over de processen die de reproduceerbare overname van nuttige / commensale bacteriën uit de omgeving bepalen. Het licht-orgel mutualisme tussen het mariene Gram-negatieve bacterie V. fischeri en de Hawaiiaanse bobtail squid, E. scolopes, staat voor een zeer specifieke interactie waarbij een host (E. scolopes) een symbiotische relatie met slechts een bacteriesoort (V. fischeri) in de loop van de levensduur van 6,7. Bioluminescentie door V. fischeri tijdens deze interactie geeft een anti-agressieve voordeel E. scolopes tijdens nachtelijke activiteit 8,9, terwijlde voedselrijke gastheerweefsel biedt V. fischeri met een beschermde nis 10. Tijdens elke host generatie, wordt deze relatie samengevat, zodat aan een voorspelbaar proces dat kan in detail worden beoordeeld in verschillende stadia van symbiotische ontwikkeling. In het laboratorium, de jeugdige inktvis luik aposymbiotically (uncolonized), en, indien verzameld binnen de eerste 30-60 minuten en overgebracht naar symbiont-vrij water, kan niet worden gekoloniseerd, behalve door de experimentele inoculum 6. Deze interactie geeft een nuttig modelsysteem waarin de afzonderlijke stappen die leiden tot de specifieke verkrijging van een microbe symbiotische uit de omgeving 11,12 beoordelen. Hier beschrijven een werkwijze om de mate van kolonisatie die optreedt wanneer pasgeboren aposymbiotic E. beoordelen scolopes worden blootgesteld aan (kunstmatige) zeewater met V. fischeri. Deze eenvoudige test beschrijft inenting, een natuurlijke infectie, en herstelvan de bacteriële symbiont van de ontluikende lichtorgel van E. scolopes. Er wordt op een consistente omgeving voor de dieren tijdens het symbiotische ontwikkeling, in het bijzonder met betrekking tot de kwaliteit van het water en licht signalen. Methoden om de beschreven symbiotische bevolking kenmerken omvatten (1) meting van bacterieel afgeleid bioluminescentie, en (2) directe kolonie tellen van teruggewonnen symbionten.

De methode beschrijft de procedure waarmee de Hawaiiaanse bobtail inktvis,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; En bacteriële symbiont,<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt;, Afzonderlijk en vervolgens verhoogd ingevoerd voor het specifieke kolonisatie van de inktvis licht orgel door de bacteriën. Kolonisatie detectie door bacterieel afgeleide luminescentie en door directe kolonie tellen worden beschreven.

Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri</em

Specifieke bacteriën worden in associatie met dierlijk weefsel aangetroffen1-5. Dergelijke gastheer-bacterieassociaties (symbiosen) kunnen schadelijk (pathogeen) zijn, geen ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mate van kolonisatie door inktvissen te beoordelen wanneer de dieren worden geïnoculeerd met Vibrio fischeri-bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst kweekbacteriën voor te bereiden en APO symbiotische inktvislarven te verzamelen. Vervolgens worden de inktvislarven geïnoculeerd met een specifieke concentratie van de bacteriën.Na voltooiing van de kolonisatie wordt de luminescentie van de dieren bepaald en worden de monsters door invriezing oppervlaktesteryliseert. Vervolgens worden de monsters gehomogeniseerd om de symbiotische bacteriën vrij te maken. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die via verdunningsplating van de symbiotische homogenaten het mediane kolonisatieniveau voor elke bacteriële stam of elk monster aantonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van interacties tussen microben en hun gastheer, zoals de vraag hoe gastheerspecificiteit zich ontwikkelt tussen microbiële stammen. Om het bacteriële inoculum voor te bereiden, worden de relevante bacteriële stammen twee dagen vóór de inoculatie van de inktvis op LBS-agar geplaatst; incubeer de bacteriën gedurende de nacht bij 25 tot 28 °C

colonization-of-euprymna-scolopes-squid-by-vibrio-fischeri

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video zal laten zien hoe je hemocytes (bloedcellen) te verkrijgen van de Hawaiiaanse Bobtail...

Het verkrijgen van Hemocytes van de Hawaiiaanse Bobtail Squid Euprymna scolopes En observatie van de Naleving van Symbiotische en niet-symbiotische bacteriën

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te...

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Source: Heering, J., et al. Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the induction of swarmer cell differentiation in Vibrio parahaemolyticus using a specially prepared agar medium. By manipulating environmental cues such as iron depletion, calcium supplementation, and surface contact, the bacteria are stimulated to transition from their swimmer form into elongated swarmer cells...

Induction of Differentiation of Vibrio parahaemolyticus into Swarmer Cells

Source: Heering, J., et al., Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the preparation of swarmer cells from a Vibrio parahaemolyticus colony for fluorescence imaging. The bacteria are genetically engineered to express a fluorophore-tagged protein that localizes unipolarly in swimmer cells and bipolarly in elongated swarmer cells, allowing for their visual differentiation. An...

Preparation of Vibrio parahaemolyticus Swarmer Cells for Imaging

Source: Nag, D., et al. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a protocol to quantify the intestinal bacterial load in adult zebrafish infected with an antibiotic-resistant strain of Vibrio cholerae. Following euthanasia and dissection, the intestinal tract is isolated, homogenized with glass beads, and processed to release the bacteria. The resulting homogenate is plated onto a selective medium, and...

Quantifying Intestinal Bacterial Load in Zebrafish Infected with Vibrio cholerae

Source: Nag, D., et.al. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the inoculation of adult zebrafish with a pathogenic Vibrio cholerae strain to study intestinal colonization and disease outcomes. It shows how bacterial toxins disrupt intestinal integrity, leading to fluid leakage, mucus secretion, and watery diarrhea before the fish are prepared for further analysis.

Intestinal Colonization and Diarrhea Induction by Vibrio cholerae in Adult Zebrafish

Dit protocol maakt het mogelijk om de celcellen van een enkele cel te onderscheiden van de differentieel onderscheidende Vibrio parahaemolyticus zwemmer en zwermcellen. De methode produceert een populatie van zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor enkelvoudige celanalyse en behandelt de bereiding van celculturen, inductie van zwarmerdifferentiatie, monsterbereiding en beeldanalyse.

Inductie van Cellulaire Differentiatie en Single Cell Imaging van<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Zwemmer en zwermcellen

Zebravis zijn een natuurlijke Vibrio cholerae host en kan worden gebruikt om te recapituleren en de studie van de gehele besmettelijke cyclus van kolonisatie tot transmissie. Hier laten we zien hoe V. cholerae kolonisatie niveaus beoordelen en kwantificeren van diarree in zebrafish.

Kwantificeren van de kolonisatie van Vibrio cholerae en diarree in het volwassen Zebrafish Model

Zebrafish (Danio rerio) worden een veel gebruikte gewervelde diermodel voor microbiële kolonisatie en de pathogenese. Dit protocol beschrijft het gebruik van de protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in zebrafish larven. P. caudatum gemakkelijk internaliseert bacteriën en krijgen overgenomen door larvale zebrafish via natuurlijke azen gedrag.

Met behulp van de eencellige Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infecties in Zebrafish larven

Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.

Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Leer hoe je kolonisatie van Euprymna scolopes inktvissen door Vibrio fischeri bacteriën evalueert. Deze methode meet bioluminescentie en kolonievorming om gastheer-microbe interacties te bestuderen.

Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri

Meer video's verkennen