Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van epitheliale cellen uit driedimensionale gemengde celweefselkweken om de effecten van stromale fibroblasten op de biologie van epitheliale cellen te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst driedimensionale gemengde celsteroid-coculturen op te zetten. De sferoïden worden vervolgens gescheiden van de matrixkweek om de epitheliale cellen na de cocultuur te isoleren.

De volgende stap is het passeren van de epitheliale cellen na de co-cultuur tot ze klaar zijn voor analyse. Uiteindelijk kunnen de effecten van blootstelling aan fibroblasten in een driedimensionale cultuur op het gedrag van epitheliale cellen worden geëvalueerd via microscopische beeldvorming van de culturen en analyse van de post-co-cultuur. Voor epitheliale cellen zijn dit, zoals hier getoond, de fluorescentiebeeldvorming van matrixinvasie en Transwell-migratie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Quin, een onderzoeker uit mijn laboratorium, die de dag ervoor de co-culturen heeft opgezet.

Haal de matrigel uit de vriezer en laat deze gedurende de nacht ontdooien op ijs in een koelkast van vier graden Celsius. Plaats op de dag van het experiment het kweekmedium ten minste één uur voordat het met de matrigel wordt gemengd op ijs. Om de ontdooide matrigel te verdunnen.

Voeg de helft van het volume ijskoude H Mac-medium dat nodig is voor de co-cultuur toe aan een steriele buis op ijs. Voeg vervolgens hetzelfde totale halve volume ontdooide matrigel toe aan de buis om een één-op-één verdunning te verkrijgen, terwijl de buis op ijs wordt gehouden. Plaats daarna 50 µL van het matrigel-mediummengsel in het midden van de aangewezen wells van een 24-wells plaat en incubeer de plaat gedurende 10 minuten in een incubator van 37 °C met bevochtigde lucht en 5% CO2.

Voeg vervolgens nog eens 450 µL van het matrigel-mediummengsel toe aan de wells en incubeer dit nog 60 minuten. Bereid tijdens de tweede incubatie een één-op-één suspensie van fibroblasten en epitheelcellen voor, met een concentratie van 0,5 × 10⁵ cellen per 0,5 mL H me-medium. Wanneer het matrigel-mediummengsel is gestold, wordt de celsuspensie voorzichtig op de bovenkant van de gel gedruppeld en wordt de cultuur gedurende twee dagen teruggeplaatst in de incubator.

Vervang het medium elke twee tot drie dagen door het medium zeer voorzichtig vanaf de zijkant van de well af te zuigen en dit voorzichtig te vervangen door vers HEC-medium; controleer dagelijks de vorming van sferoïden onder de microscoop en maak indien nodig beelden met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie. Begin met het 10 keer op en neer pipetteren van de cultuur met een steriele glazen pipet van 2 ml. Breng de cultuur vervolgens met de glazen pipet over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 ×g bij kamertemperatuur; na het centrifugeren zal de cellulaire sferoïde bezinken op de bodem van de buis.

Gebruik een steriele Pasteur-pipetpunt om de ontregelde matra-gel voorzichtig van de bovenkant van de centrifuge te verwijderen. Voorbereiding. Voeg nu één milliliter H mac-medium toe aan het pellet van de steroid-pipet, pipetteer dit twee tot drie keer op en neer met een steriele glazen pipet van twee milliliter en breng de cultuur over naar een putje in een 24-well weefselkweekplaat. Laat de steroid minimaal 48 uur hechten aan de schaal voordat het medium wordt vervangen.

Na verloop van tijd zullen de cellen de sferoïde structuur verlaten en als monolagen groeien. Zodra de celculturen een confluentie van 50% hebben bereikt, worden ze volgens een standaardprotocol overgezet naar een schaal van 35 millimeter voor twee tot vier dagen, en vervolgens overgezet naar een schaal van 100 millimeter voor drie tot vijf dagen voordat verdere analyse van de cellen plaatsvindt. Gebruik een steriele Pasteurpipet om het medium af te zuigen en verwijder daarna handmatig zoveel mogelijk resterende sferoïden. In driedimensionale sferoïde co-culturen induceren fibroblasten met genetisch gemodificeerde TM one silencing, zoals hier aangetoond in figuren D, E en F, een verhoogde matrixinvasie door mammaire epitheelcellen in vergelijking met de controlefibroblasten in figuren A, B en C. Let op de epitheliale uitlopers die de matrix binnendringen in sferoïden met TM one silenced fibroblasten, zoals aangegeven met pijlen in figuren D en F. Fibroblasten met genetisch gemodificeerde overexpressie van TM one, hier getoond in figuren J, K en L, induceerden een verminderde invasie door de borstkankercellijn SUM159 in vergelijking met de controlefibroblasten in figuren G, H en I. Vergelijk het ontbreken van epitheliale uitlopers in sferoïden met TM one engineered fibroblasten met die in sferoïden met controlefibroblasten, aangegeven door de pijlen in figuren G en I, zodra de co-cultuursferoïden zijn gevestigd.

Celpopulaties kunnen uit steroïden worden geïsoleerd door het opnieuw uitplaten in een tweedimensionale context. Deze samenstelling van afbeeldingen toont culturen onder licht- en fluorescentiemicroscopie na hun isolatie uit matrigelcultuur. Dag nul staat voor beeldvorming direct na isolatie; dagen één, twee en vijf geven de dagen na isolatie aan.

Let op hoe de corona van cellen die dit steroïd verlaten in de loop van de tijd toeneemt. Uiteindelijk blijft er een "ghost" steroïd over met zeer weinig cellen, zoals hier door de pijl wordt aangegeven. Er blijven zeer weinig steroïden over na het verwijderen van de ghost-steroïden en een passage.

Afhankelijk van de relatieve groeisnelheden van de geteste cellen kunnen zuivere populaties ontstaan door seriële passage of gesorteerd worden met behulp van geschikte celmarkers. In dit voorbeeld worden monsterwatts geanalyseerd via flowcytometrie, waarbij groene fluorescentie en rode fluorescentie worden gebruikt om respectievelijk GFP-expresserende fibroblasten en mCherry-expresserende epitheelcellen te identificeren, om zo de relatieve populaties van epitheel- en fibroblastcellen te bepalen.

Na isolatie uit de 3D-cocultuur behouden epitheelcellen de eigenschappen die door cocultuur met fibroblasten over langere perioden zijn overgedragen, wat ruime mogelijkheden biedt voor analyse. In dit voorbeeld induceerde blootstelling aan TM one-deficiënte fibroblasten een verhoogde migratie in cocultureerde H max die wekenlang aanhield na isolatie uit de 3D-cocultuur, vergeleken met blootstelling aan controlefibroblasten, hier aangeduid als C, na deze procedure. Andere methoden, zoals die voor het analyseren van veranderingen in genexpressie en epigenetische markeringen, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de effecten van fibroblasten op epitheelcellen.