TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren Vibrio cholerae Op basis van Natural Transformation en FLP-recombinatie

Het doel van deze procedure is om vio cray genetisch te manipuleren met behulp van deze snelle en gedeeltelijke methode, die is gebaseerd op natuurlijke transformatie en flip-combinatie. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte chitinebron voor te bereiden, aangezien chitine de natuurlijke inducer van transformatie is. Tijdens de tweede stap wordt een DNA-construct gegenereerd met behulp van twee rondes PCR en hun natuurlijke transformatie wordt uitgevoerd, waardoor de bacteriën met het plasmide PBR flip het PCR-fragment kunnen opnemen en in hun genomen kunnen worden opgenomen.

Vervolgens wordt een temperatuurstijging gebruikt om het plasmide-gecodeerde lipase-enzym te induceren voor het verwijderen van het flip-recombinatiedoelwit of het FRT-plaatsgeflankeerde antibioticaresistentiecasset. In de laatste stap worden de bacteriën genezen van het FLP-coderende plasmide. Uiteindelijk worden PCR en sequentiebepaling gebruikt om aan te tonen dat de genetische manipulatie succesvol was.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het gebruik van zelfmoordplasmiden om vire genetisch te manipuleren, is dat deze methode zeer snel en efficiënt is. Begin met het wegen van 50 tot 80 milligram monsters van chitinevlokken in standaard 1,5 milliliter plastic buisjes, houd de deksels van de buisjes open, autoclaveer de vlokken nadat de autoclaaf heeft gebeld, sluit onmiddellijk de deksels en bewaar de autoclaafkit in vlokken bij kamertemperatuur. Ten minste zes oligonucleotiden zijn vereist om de DNA-regio's van belang en de FRT-geflankeerde antibioticacassette door PCR te versterken. Het wordt ook aanbevolen om een paar oligonucleotideprimers buiten het ingevoegde PCR-fragment op te nemen.

Dit maakt het mogelijk om te controleren op integratie en correcte excisie van het FRT-geflankeerde antibioticaresistentiecasset. Ontwerp de nummer twee, nummer drie, nummer vier en nummer vijf oligonucleotiden met zorg. Primers twee en vijf moeten minimaal 28 basenparen bevatten om voldoende knie te kunnen aan de genomische DNA en primers. Drie en vier moeten worden geconstrueerd met een FRT kan FRT-bevattende plasmide als sjabloon om primers twee en vijf te ontwerpen om uitgebreide complementaire basenparing aan het vijf-prime-uiteinde tussen primers twee en drie en primers vier en vijf respectievelijk mogelijk te maken.

Gebruik nu voor de eerste ronde PCR oligonucleotiden een en twee om de eerste van de drie gelijktijdige, maar onafhankelijke PCR-reacties voor te bereiden voor versterking van de stroomopwaartse regio van de experimentele regio van belang van de op maat ontworpen constructies. Bereid parallel de tweede PCR-reactie voor met oligonucleotiden drie en vier om de FRT-geflankeerde antibioticacassette te versterken. Bijvoorbeeld, in dit experiment werd het A PH-gen gebruikt dat codeert voor canin-resistentie.

Versterk tegelijkertijd het downstream DNA-gebied door de derde PCR-reactie voor te bereiden met oligonucleotiden vijf en zes en genomisch DNA als sjabloon. Start vervolgens de PCR-reactie voor alle drie de monsters na zuivering van alle drie de PCR-fragmenten. Gebruik een mengsel met gelijke hoeveelheden van alle drie de fragmenten verkregen in de eerste ronde als sjabloon om een tweede ronde PCR uit te voeren. Deze versterking zal worden gekatalyseerd door oligonucleotiden een en zes.

Het resulterende PCR-fragment zal dienen als het transformerende DNA in de natuurlijke transformatie-experimenten. Na het kweken van v cholera-cellen, aeroob verrijkt medium bij 30 graden Celsius. Oogst de bacteriën door centrifugatie bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens de bacteriecultuur over op de kite in vlokken en incubeer de celsuspensie een nacht bij 30 graden Celsius. Meng vervolgens voorzichtig ten minste 200 nanogram van de tweede ronde PCR-afgeleide fragmenten in de bacteriecelsuspensie. Zorg ervoor dat de bacteriën niet uitgebreid loslaten van de chitine-oppervlakken, en incubeer deze oplossing vervolgens nog een dag bij 30 graden Celsius zonder beweging.

Vortex nu de cultuur krachtig gedurende ten minste 30 seconden voor bacteriën die het PBR flip-plasmide bevatten. Verspreid 100 tot 300 microliter van de celsuspensie op dubbel selectieve platen met ampicilline. Naast de andere antibiotica op de platen, incubeer de bacteriecelculturen bij 30 graden Celsius tot de kolonies zichtbaar zijn. Isoleer vervolgens de enkele transformanten van de selectieve platen.

Begin deze stap door de bacteriën te laten groeien op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. Als optionele stap kunt u de temperatuur gedurende twee tot drie uur veranderen naar 40 graden Celsius, omdat de expressie van flip van het PBR flip-plasmide bij hogere temperaturen wordt onderdrukt. Na nog eens acht uur incubatie bij 37 graden Celsius, brengt u de bacteriën over naar nieuwe platen.

Beperk nu de klonen parallel op antibioticumhoudende en antibioticumvrije agarplaten om te testen op antibioticagevoeligheid en isoleer vervolgens een enkele resulterende antibioticagevoelige kolonie. Begin deze stap door de cultuur overnacht onder aërobe omstandigheden bij 30 graden Celsius te laten groeien, verrijkt medium zonder antibiotica. De volgende ochtend laat u een nieuwe cultuur gedurende drie tot zes uur groeien door de overnachtcultuur in een verhouding van één tot honderd te verdunnen in vers antibioticumvrij medium. 's Middags strekt u de cultuur uit of plaatst u de cultuur op gewone LB-agarplaten en incubeert u de platen vervolgens nog eens acht tot zestien uur bij 30 graden Celsius totdat de kolonies zichtbaar zijn.

In dit eerste experiment dat gericht was op het verwijderen van de buurgenen CTXA en CTXB. De oligonucleotiden voor de trans flip-methode werden gegenereerd zoals zojuist gedemonstreerd. De ouderlijke stam, de tussenstam met de FRT-geflankeerde antibioticaresistentiecassette in plaats van de oorspronkelijke DNA-locus van C-T-X-A-B en de uiteindelijke stam die voor C-T-X-A-B was verwijderd en bevrijd van de resistentiecassette, werden allemaal getest op hun genotype. Voor dit experiment werd groothandel PCR uitgevoerd met behulp van primers die niet knieiden aan het transformerende PCR-fragment, maar alleen aan he