TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren

Het doel van deze procedure is om vio cray genetisch te manipuleren met behulp van deze snelle en deficiënte methode, die is gebaseerd op natuurlijke transformatie en flip-combinatie. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte chitinebron voor te bereiden, aangezien chitine de natuurlijke inductor van transformatie is. Tijdens de tweede stap wordt een DNA-construct gegenereerd met behulp van twee ronden PCR en wordt de natuurlijke transformatie uitgevoerd, waardoor de PBR flip-plasmid-bevattende bacteriën het PCR-fragment kunnen opnemen en in hun genomen kunnen incorporeren.

Vervolgens wordt een temperatuurstijging gebruikt om het door het plasmide gecodeerde lipase-enzym te induceren voor verwijdering van de antibioticaresistentiecassette die geflankeerd wordt door het flip-recombinatiedoel of de FRT-site. In de laatste stap wordt het FLP-coderende plasmide uit de bacteriën verwijderd. Tot slot worden PCR en sequencing gebruikt om aan te tonen dat de genetische manipulatie succesvol was.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van suïcideplasmiden voor de genetische manipulatie van virussen, is dat deze methode zeer snel en efficiënt is. Begin met het afwegen van monsters van 50 tot 80 milligram chitinevlokken in standaard plastic buisjes van 1,5 milliliter; autoclaveer vervolgens de vlokken terwijl de doppen van de buisjes open blijven. Sluit onmiddellijk na het voltooien van de autoclaafcyclus de doppen en bewaar de autoclaafkit met vlokken bij kamertemperatuur. Er zijn ten minste zes oligonucleotiden nodig om de DNA-regio's van interesse, evenals de FRT-geflankeerde antibiotica-cassette, via PCR te amplificeren. Het wordt ook aanbevolen om een paar oligonucleotide-primers buiten het ingevoegde PCR-fragment op te nemen.

Hiermee kan worden gecontroleerd op integratie en correcte excisie van het FRT-geflankeerde antibioticaresistentie-cassette-ontwerp; de oligonucleotiden nummer twee, nummer drie, nummer vier en nummer vijf met zorg. Primers twee en vijf moeten ten minste 28 baseparen bevatten om voldoende te kunnen annealen aan het genomische DNA en primers drie en vier moeten worden geconstrueerd met een FRT-bevattend plasmide als template; ontwerp primers twee en vijf zodanig dat er uitgebreide complementaire baseparing plaatsvindt aan het 5'-uiteinde tussen respectievelijk primers twee en drie en primers vier en vijf.

Gebruik voor de eerste ronde van de PCR oligonucleotiden één en twee om de eerste van drie gelijktijdige, maar onafhankelijke PCR-reacties voor te bereiden voor amplificatie van de upstream regio van het experimentele interessegebied van de op maat ontworpen constructen. Bereid parallel daaraan de tweede PCR-reactie voor met oligonucleotiden drie en vier om de door FRT geflankeerde antibiotica-cassette te amplificeren. In dit experiment werd bijvoorbeeld het A PH-gen gebruikt dat codeert voor canine resistentie.

Amplificeer gelijktijdig de stroomafwaartse DNA-regio door de derde PCR-reactie voor te bereiden met gebruik van oligonucleotiden vijf en zes en genomisch DNA als template. Start vervolgens de PCR-reactie voor alle drie de monsters. Na zuivering van alle drie de PCR-fragmenten wordt een mengsel met gelijke hoeveelheden van de drie fragmenten uit de eerste ronde als template gebruikt om een tweede PCR-ronde uit te voeren. Deze amplificatie wordt gekatalyseerd door oligonucleotiden één en zes.

Het resulterende PCR-fragment dient als transformerend DNA in de natuurlijke transformatie-experimenten. Nadat de v. cholera-cellen zijn gekweekt in aeroob verrijkt medium bij 30 °C, worden de bacteriën geoogst door middel van centrifugatie bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens de bacteriële cultuur over op de chitinevlokken en incubeer de celsuspensie gedurende de nacht bij 30 °C. Meng daarna voorzichtig ten minste 200 ng van de fragmenten afkomstig uit de tweede ronde PCR in de bacteriële celsuspensie. Incubeer deze oplossing vervolgens nog een dag bij 30 °C zonder beweging, waarbij erop wordt gelet dat de bacteriën niet uitgebreid van de chitine-oppervlakken worden losgemaakt.

Vortex nu de cultuur krachtig gedurende ten minste 30 seconden. Verspreid voor bacteriën die het PBR flip-plasmide bevatten 100 tot 300 µL van de celoplossing op dubbel selectieve platen die ampicilline bevatten, naast het andere antibioticum op de platen. Incubeer de bacteriële celculturen bij 30 °C totdat koloniën zichtbaar zijn. Isoleer vervolgens de enkelvoudige transformanten van de selectieve platen.

Begin deze stap door de bacteriën te kweken op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 °C gedurende 16 tot 24 uur. Als optionele stap kan de temperatuur gedurende twee tot drie uur worden verhoogd naar 40 °C, aangezien de expressie van flip vanuit het PBR-flip-plasmide bij hogere temperaturen wordt gederepreseerd. Na nog eens acht uur incubatie bij 37 °C worden de bacteriën overgezet naar verse platen.

Beperk nu de klonen parallel op agarplaten met en zonder antibiotica om de antibioticagevoeligheid te testen en isoleer vervolgens één resulterende antibioticagevoelige kolonie. Begin deze stap door de cultuur gedurende de nacht onder aerobe condities bij 30 °C te kweken in verrijkingsmedium zonder antibiotica. Kweek de volgende ochtend een nieuwe cultuur gedurende drie tot zes uur door de overnight-cultuur in een verhouding van 1:100 te verdunnen in vers antibioticumvrij medium. Streken of plaat vervolgens in de middag een verdunning van de cultuur uit op gewone LB-agarplaten en incubeer de platen vervolgens nog eens acht tot 16 uur bij 30 °C totdat de kolonies zichtbaar zijn.

In dit eerste experiment was het doel om de naburige genen CTXA en CTXB te deleten. De oligonucleotiden voor de trans-flip-methode werden gegenereerd zoals zojuist gedemonstreerd. De ouderstam, de tussenstam die de door FRT geflankeerde antibioticaresistentiecassette bevat in plaats van de oorspronkelijke DNA-locus van C-T-X-A-B, en de uiteindelijke stam waarbij C-T-X-A-B is gedeleteerd en de resistentiecassette is verwijderd, werden allemaal getest op hun genotype. Voor dit experiment werd een wholesale PCR uitgevoerd met primers die niet anneleren aan het transformerende PCR-fragment, maar uitsluitend aan het chromosomale DNA. De PCR-fragmenten werden gescheiden via standaard agarozelektroforese om hun grootte te bepalen.

In baan één bevond de wereldwijde cholera-stam type B zich op de verwachte fragmentgrootte van 3 143 basenparen. In baan twee bevond het PCR-fragment afgeleid van stam delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT zich op 3 162 basenparen.

En in baan drie bevond het delta ctx A B FFR TP CR-fragment zich op 1.769 basenparen vergeleken met de 1 KB-ladder. In het tweede voorbeeld, waarbij een volledig genomisch eiland werd verwijderd, werd het Vibrio Pathogenicity island one of VPI-1 gekozen als doelwit voor dit experiment. De trans flip-methode werd in twee stappen aangepast.

Eerst werd de integratie van het kanamycine-resistentiegen voorafgegaan door een enkele FRT-site aan het begin van PI één. Vervolgens werd een tweede ronde van natuurlijke transformatie uitgevoerd, waardoor de insertie van een aanvullende antibioticaresistentiemarker mogelijk werd gemaakt, namelijk gentamycine-resistentie gevolgd door een tweede FRT-site aan het einde van het pathogeniciteits-eiland. De betreffende primerparen zijn aangegeven boven elke gelafbeelding en de trans FLP-methode werd voortgezet zoals zojuist gedemonstreerd.

De ouderlijke, intermediaire en uiteindelijke stammen werden allemaal geverifieerd via PCR van het gezuiverde genomische DNA in baan één. Het PCR-fragment van de wildtype V cholera-stam werd geladen in baan twee. Het PCR-fragment resulterend uit stam VPI one FRT can GM FRT werd geladen.

En in baan drie werd het PCR-product geanalyseerd dat was afgeleid van de stam delta VPI one FRT. Primerparen zijn aangegeven boven elke gelafbeelding. De uiteindelijke stam mist het gehele VPI one.

In dit derde voorbeeld werd een T7 RNA-polymerasedependente promotorsequentie stroomopwaarts van het gen Tfox, een belangrijke regulator van natuurlijke transformatie, geïntegreerd met behulp van de trans-flip-methode met een lichte wijziging ten opzichte van het standaardprotocol. De consensussequentie van de T7 RNA-dependente promotor was opgenomen als overhangs in oligonucleotiden vier en vijf, zodat deze DNA-sequentie behouden bleef in het chromosoom. Nadat de antibioticaresistentiecassette was uitgesneden, werd het construct vervolgens geïntegreerd in een T7 RNA-polymerase-bevattende V-gekleurde stam.

In deze stam werd de expressie van het T7-RNA-polymerasegen aangestuurd door de lacUV5-promotor om de T7-RNA-polymerase-afhankelijke expressie van T-Fox te testen. Assays voor natuurlijke transformatie werden uitgevoerd in LB-medium. De ouderstam, die de T7-afhankelijke promotor voorafgaand aan het T-Fox-gen mist, is onder deze omstandigheden niet natuurlijk transformeerbaar vanwege het gebrek aan T-Fox-transcriptie in rijk medium en in afwezigheid van de natuurlijke induceerder chitine. Dit fenotype was onafhankelijk van het feit of het T7-RNA-polymerase kunstmatig werd geïnduceerd door IPTG of niet.

De trans-flip-gegenereerde stam, die de T7 RNA-polymerase-afhankelijke promoter stroomopwaarts van het competentiegen tfoX bevat, was echter wel natuurlijk transformeerbaar in verrijkt medium door lekkage van de lacUV5-promoter in LB-medium. De geproduceerde T7 RNA-polymerase transcribeerde tfoX al vanuit de T7 RNA-polymerase-afhankelijke promoter zonder inductie door IPTG. Dit initieerde natuurlijke competentie en transformatie, wat de functionaliteit van de geïntegreerde T7 RNA-polymerase-afhankelijke promotersequentie bevestigde.

Dit fenotype werd significant versterkt door volledige inductie van het T7 RNA-polymerase door toevoeging van de inductor IPTG van de lacUV5-promotor. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe V. cholera genetisch gemanipuleerd kan worden met behulp van een combinatie van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie en flip-recombinatie. Zodra deze techniek onder de knie is, stelt deze u in staat om binnen enkele dagen genen of genomische eilanden te deleten, alsofsoort DNA-sequenties op een site-specifieke manier te integreren.