Name: TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren Vibrio cholerae Op basis van Natural Transformation en FLP-recombinatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Leer een snelle methode voor genetische modificatie van Vibrio cholerae via natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie. Deze techniek maakt efficiënt genoombewerking mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik wil Olga de Souza Silva erkennen voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF) Subsidie ​​31003A_127029.

De TransFLP methode (figuur 1) wordt geïllustreerd door drie verschillende benaderingen: I) het schrappen van twee aangrenzende genen die coderen virulentiedeterminanten van V. cholerae (bijvoorbeeld ΔctxAB), II) het verwijderen van een eiland pathogeniteit (bijvoorbeeld ΔVPI-1) en III) de integratie van een T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke sequentie stroomopwaarts van een gen van belang, dat vervolgens kan de kunstmatige expressie in de respectieve stam achtergrond (bijvoorbeeld T7-TFox) (Figuur 2). 1. Voorbereiding van Chitine Flakes <ol><li> 50-80 mg gewicht van chitine vlokken in een standaard 1,5 ml plastic buis. Dit kan worden bereid in bulk. Chitine vlokken zijn commercieel verkrijgbaar bij Sigma (cat. nummer C9213). </li><li> Autoclaveren de vlokken houden de deksels van de buizen open. </li><li> Onmiddellijk sluit de deksels na de autoclaaf is afgekoeld. </li><li> Store geautoclaveerd chitine vlokkenbij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Optioneel: Kunstmatige Transformatie van V. cholerae met FLP recombinase coderende Plasmide <ol><li> Bereid elektrocompetente V. cholerae cellen met standaard methoden 11. Opslaan van competente cellen aliquots bij -80 ° C. </li><li> Voeg 1-2 ul van een vaste mini-bereiding van plasmide pBR-flp 5 bij de elektrocompetente V. cholerae cellen en breng het mengsel in een elektroporatie cuvette (0,2 cm tussenruimte). </li><li> Breng een puls op 1,6 kV. </li><li> Voeg 0,9 ml SOC-medium, zacht overdracht cel om een ​​standaard 14 ml buis. Incubeer stilstaande gedurende 2,5 tot 3 uur bij 30 ° C. </li><li> Plaat 100 pl en 300 pl op LB-platen met 100 ug / ml ampicilline en incubeer bij 30 ° C geroerd. </li><li> Zuiver enkele kloon en op te slaan als glycerol voorraad voor levering de toekomst TransFLP experimenten. </li></ol> 3. Oligonucleotide Ontwerp en Polymerase Chain Reaction <ol><li> Ten minste zes oligonucleotiden moeten de DNA regio (s) van belang en de FRT-geflankeerd antibioticum cassette door PCR (Figuur 3) te amplificeren. Het verdient aanbeveling om ook een paar oligonucleotiden priming buiten geplaatst PCR fragment. Hierdoor kan controleren op correcte integratie en excisie van de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette (bijvoorbeeld weergegeven als &quot;CHK-up&quot; en &quot;CHK-down &#39;primers in de figuren 3 tot 5). </li><li> Ontwerp oligonucleotiden # 2, # 3, # 4 en # 5 met zorg. Zij moeten in staat zijn voldoende (bijvoorbeeld ~ 28 bp) hybridiseren aan het matrijs-DNA. De template DNA genomisch DNA (gDNA) van primers # 2 en # 5 en FRT-Kan-FRT-bevattende plasmide DNA zoals pROD17 12 en pBR-FRT-KAN-FRT (dit onderzoek) voor primers # 3 en # 4 ( figuur 3A). </li><li> Ontwerp de primers # 2 # 5 waardoor uitgebreide basenparing aan hun 5&#39;-uiteinde van # 2 / # 3 en # 4 / # 5, respectievelijk (Figuur 3A </strong&gt; inzet). Twee ronden van PCR volgen. </li><li> Voer drie onafhankelijke PCR reacties als 1e ronde van PCR. De eerste zal versterken het stroomopwaartse gebied van het gen / DNA regio-of-interest met behulp van oligonucleotiden # 1 en # 2. De PCR moet resulteren in een fragment van ten minste 500 bp in lengte homologe recombinatie mogelijk is binnen de cellen. Kortere fragmenten (~ 250 bp) kan volstaan ​​8 maar worden niet aanbevolen. </li><li> Parallel uitvoeren van de tweede PCR, die de FRT-geflankeerd antibiotica cassette versterkt. Voor de voorbeelden die we hier vooral gebruikt aph (kan R). Gebruik oligonucleotiden # 3 en # 4 voor deze reactie (Figuur 3A). </li><li> Daarmee samenhangend versterken de stroomafwaartse DNA-regio door middel van PCR (derde monster). Het PCR fragment moet ook ten minste 500 bp in lengte. De PCR met gDNA als template en oligonucleotiden # 5 en # 6 (Figuur 3A). </li><li> Na zuivering van de drie PCRfragmenten Voer de 2e ronde van PCR. Gebruik een gelijk mengsel van alle drie fragmenten verkregen in de eerste ronde als template. De amplificatie wordt gekatalyseerd door oligonucleotiden # 1 en # 6. Het verkregen PCR fragment (Figuur 3B) dient als transformerende DNA in de natuurlijke transformatie experiment (figuur 1). </li></ol> 4. Chitine-geïnduceerde Natural Transformation <ol><li> Grow V. cholerae cellen aëroob in rijk medium bij 30 ° C totdat zij een optische dichtheid bereiken bij 600 nm van ongeveer 0,5. </li><li> Oogst de bacteriën door centrifugatie. Was de pellet in gedefinieerde kunstmatig medium (DASW 6) voordat resuspenderen de cellen in 2 delen DASW. Voeg 1 ml van cultuur aan 50 tot 80 mg steriele chitine vlokken (onder punt 1). Als bacteriën haven plasmide pBR-flp (optioneel punt 2), add ampicilline (50 ug / ml) aan de kweek. Incubeer bij 30 ° C gedurende 16-24 uur zonder beweging. </li><li> Voeg &amp; ge, 200 ng van de 2 e-round PCR-afgeleide fragment (onder punt 3). Meng voorzichtig, zonder uitgebreid verwijderen van de bacteriën uit de chitine oppervlakken. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur zonder beweging. </li><li> Vortex de cultuur uitgebreid voor ≥ 30 sec. Verspreid 1-300 ul op selectieve LB-medium platen (bijv. kanamycine of gentamicine-bevattende LB-platen voor voorbeelden hier aanwezig). Gebruik dubbele selectieve platen als de bacterie herbergen het plasmide pBR-flp door het toevoegen van ampicilline gelijktijdig aan de andere antibiotica. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 16-24 uur of totdat kolonies zichtbaar. </li><li> Isoleer enkele transformanten van selectieve platen. Dergelijke transformanten zijn vervangen door de oorspronkelijke chromosomale locus door PCR fragment door een dubbele crossover event. Deze stammen kunnen direct worden gebruikt voor verdere experimenten bij de verwijdering van het antibioticum cassette niet nodig. </li></ol> 5. Verwijdering van Selectieve Cassette (s) door Flp-Recombinatie <ol><li> Kunstmatig transformeren uw transformanten met plasmide pBR-flp zoals beschreven onder punt 2 indien niet gedaan voordat de natuurlijke transformatie test. </li><li> De bacteriën groeien op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 ° C gedurende 16-24 uur. Opties: verandering in de temperatuur tussen 2-3 uur tot 40 ° C als expressie van flp van plasmide pBR-flp is de-onderdrukt bij hogere temperaturen 5,10; overdracht bacteriën verse platen na ca. 8 uur incubatie. </li><li> Test voor antibiotica-gevoeligheid (hier aangetoond voor kanamycine, figuur 1) door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten. Isoleer enkele gevoelige kolonies. Freeze ampicilline-resistente kloon als glycerol voorraad als u van plan verder wijzigen van de stam met andere schrapping / invoegen met behulp van TransFLP. </li></ol> 6. Plasmide Curing <ol><li> Een dag te behalen cultuur onder aërobe conditie enbij 30 ° C. Gebruik rijk medium zonder de toevoeging van een antibioticum. </li><li> Optioneel: Grow verse cultuur voor 3-6 uur door verdunning van de kweek van een nacht 1:100 in verse antibiotica-vrij medium. </li><li> Plaat of strook verdunning (s) van de cultuur op gewoon LB-agar plaat (platen) en incubeer bij 30 ° C gedurende 8-16 uur (tot kolonies zichtbaar zijn). </li><li> Test voor ampicilline-gevoeligheid van de klonen door restreaking de klonen in parallel op antibiotica-bevattende en antibiotica vrij agarplaten (figuur 1). Freeze ampicilline-gevoelige stam als glycerol voorraad. </li></ol>

<ol><li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations%3A+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li>
<li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li>
<li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li>
<li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li>
<li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li>
<li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155(2010).</li>
<li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81(2007).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li>
<li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li>
<li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li>
<li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li>
<li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li>
<li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li>
<li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De TransFLP hierboven beschreven werkwijze en elders 5 veelvuldig gebruikt in ons laboratorium. Het soort genetische manipulaties die haalbaar zijn onder andere: deletie van enkele genen en clusters, deletie van genomische eilanden (bijv. VPI-1), insertie van sequenties stroomopwaarts van een gen van belang (bijvoorbeeld, promotersequenties) en insertie van sequenties aan het einde van een specifiek gen (bijvoorbeeld coderend affinity tags). Een import v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Chitine vlokken </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Autoclaveren nodig </td></tr><tr><td> OPTIONEEL: Micropulser (in het geval antibiotica cassette moet worden uitgesneden door Flp recombinase gecodeerd op pBR-flp) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> Of vergelijkbare electroporators </td></tr></tbody></table>

transflp - een methode om genetisch te modificeren<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; op basis van natural transformation en flp-recombinatie

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor manipuleren bacteriële chromosomen 1-3. De meeste van deze protocollen gebaseerd op het inbrengen van conditioneel replicerende plasmiden (bijv. herbergen pir-afhankelijke of temperatuurgevoelige replicons 1,2). Deze plasmiden geïntegreerd in bacteriële chromosomen basis van homologie-gemedieerde recombinatie. Dergelijke insertie mutanten zijn vaak direct gebruikt in experimentele settings. Als alternatief kan selectie voor plasmide excisie gevolgd door het verlies worden uitgevoerd, die voor Gram-negatieve bacteriën berusten vaak op de teller instelbare levansucrase enzym gecodeerd door het sacB gen 4. De excisie kan herstellen vóór het inbrengen genotype of resulteren in een uitwisseling tussen het chromosoom en het plasmide-gecodeerde kopie van het gemodificeerde gen. Een nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend. Het plasmide moet eerst worden gekloneerd, het vereist horizontale overdracht V. cholerae (n meeste<html> otably door paring met een E. coli donor stam) of kunstmatige transformatie van de laatste, en de excisie van het plasmide is willekeurig en kan het herstel van de oorspronkelijke genotype of maak de gewenste wijzigingen als er geen positieve selectie wordt uitgeoefend. Hier geven we een werkwijze voor snelle manipulatie van de V. cholerae chromosoom (en) 5 (figuur 1). Deze TransFLP methode is gebaseerd op de recent ontdekte chitine-gemedieerde inductie van natuurlijke deskundigheid op dit organisme 6 en andere representatieve van het geslacht Vibrio zoals V. fischeri 7. Natuurlijke competentie maakt de opname van vrij DNA waaronder PCR-gegenereerde DNA-fragmenten. Eenmaal opgenomen, de DNA recombineert met het chromosoom gezien de aanwezigheid van een minimum van 250-500 bp flankerend homoloog gebied 8. Inclusief een selectiemerker in-tussen deze flankerende gebieden maakt een eenvoudige detectie van veel voorkomende transformanten. t &quot;&gt; Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende genetische manipulatie van V. cholerae en mogelijk ook andere natuurlijk competente bacteriën. We geven drie nieuwe voorbeelden van wat kan worden bereikt door deze methode naast onze eerder gepubliceerde studie in enige gendeleties en de toevoeging van affiniteit-tag sequenties 5. Verschillende optimalisatie stappen met betrekking tot de initiële protocol van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie 6 zijn opgenomen in dit TransFLP protocol. Hieronder vallen onder andere de vervanging van krab schelp fragmenten door in de handel verkrijgbare chitine vlokken 8, de donatie van PCR afgeleide DNA omzetmaterialen 9 en de toevoeging van FLP-recombinatie doelplaatsen (FRT) 5. FRT er rekening plaatsgerichte excisie van de selectiemerker gemedieerd door de Flp recombinase 10.

Representatieve resultaten van de drie voorbeelden worden getoond in figuren 4 tot 6. De eerste benadering die gericht zijn op het verwijderen van de naburige genen ctxA en ctxB. Samen coderen belangrijke virulentiefactor van V. cholerae choleratoxine. We ontwierpen oligonucleotiden voor de TransFLP werkwijze zoals boven beschreven en volgens figuur 3. De parentale stam, werden de tussenliggende stam die de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette in de...

Een snelle methode om het genoom ervan te wijzigen<em&gt; V. cholerae</em&gt; Beschreven. Deze aanpassingen behoort het schrappen van enkele genen, gen clusters en genomische eilanden en de integratie van de korte sequenties (bijv. promotor elementen of affiniteit-tag sequenties). De methode is gebaseerd op het natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie.

TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Op basis van Natural Transformation en FLP-recombinatie

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om bacteriële chromosomen te manipuleren1-3. De meeste van deze protocollen zijn gebaseerd op de insertie van conditioneel replicatieve plasmiden ...

Het doel van deze procedure is om vio cray genetisch te manipuleren met behulp van deze snelle en deficiënte methode, die is gebaseerd op natuurlijke transformatie en flip-combinatie. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte chitinebron voor te bereiden, aangezien chitine de natuurlijke inductor van transformatie is. Tijdens de tweede stap wordt een DNA-construct gegenereerd met behulp van twee ronden PCR en wordt de natuurlijke transformatie uitgevoerd, waardoor de PBR flip-plasmid-bevattende bacteriën het PCR-fragment kunnen opnemen en in hun genomen kunnen incorporeren.Vervolgens wordt een temperatuurstijging gebruikt om het door het plasmide gecodeerde lipase-enzym te induceren voor verwijdering van de antibioticaresistentiecassette die geflankeerd wordt door het flip-recombinatiedoel of de FRT-site. In de laatste stap wordt het FLP-coderende plasmide uit de bacteriën verwijderd. Tot slot worden PCR en sequencing gebruikt om aan te tonen dat de genetische manipulatie succesvol was.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van suïcideplasmiden voor de genetische manipulatie van virussen, is dat deze methode zeer snel en efficiënt is. Begin met het afwegen van monsters van 50 tot 80 milligram chitinevlokken in standaard plastic buisjes van 1,5 milliliter; autoclaveer vervolgens de vlokken terwijl de doppen van de buisjes open blijven. Sluit onmiddellijk na het voltooien van de autoclaafcyclus de doppen en bewaar de autoclaafkit met vlokken bij kamertemperatuur. Er zijn ten minste zes oligonucleotiden nodig om de DNA-regio's van interesse, evenals de FRT-geflankeerde antibiotica-cassette, via PCR te amplificeren. Het wordt ook aanbevolen om een paar oligonucleotide-primers buiten het ingevoegde PCR-fragment op te nemen.Hiermee kan worden gecontroleerd op integratie en correcte excisie van het FRT-geflankeerde antibioticaresistentie-cassette-ontwerp; de oligonucleotiden nummer twee, nummer drie, nummer vier en nummer vijf met zorg. Primers twee en vijf moeten ten minste 28 baseparen bevatten om voldoende te kunnen annealen aan het genomische DNA en primers drie en vier moeten worden geconstrueerd met een FRT-bevattend plasmide als template; ontwerp primers twee en vijf zodanig dat er uitgebreide complementaire baseparing plaatsvindt aan het 5'-uiteinde tussen respectievelijk primers twee en drie en primers vier en vijf.Gebruik voor de eerste ronde van de PCR oligonucleotiden één en twee om de eerste van drie gelijktijdige, maar onafhankelijke PCR-reacties voor te bereiden voor amplificatie van de upstream regio van het experimentele interessegebied van de op maat ontworpen constructen. Bereid parallel daaraan de tweede PCR-reactie voor met oligonucleotiden drie en vier om de door FRT geflankeerde antibiotica-cassette te amplificeren. In dit experiment werd bijvoorbeeld het A PH-gen gebruikt dat codeert voor canine resistentie.Amplificeer gelijktijdig de stroomafwaartse DNA-regio door de derde PCR-reactie voor te bereiden met gebruik van oligonucleotiden vijf en zes en genomisch DNA als template. Start vervolgens de PCR-reactie voor alle drie de monsters. Na zuivering van alle drie de PCR-fragmenten wordt een mengsel met gelijke hoeveelheden van de drie fragmenten uit de eerste ronde als template gebruikt om een tweede PCR-ronde uit te voeren. Deze amplificatie wordt gekatalyseerd door oligonucleotiden één en zes.Het resulterende PCR-fragment dient als transformerend DNA in de natuurlijke transformatie-experimenten. Nadat de v. cholera-cellen zijn gekweekt in aeroob verrijkt medium bij 30 °C, worden de bacteriën geoogst door middel van centrifugatie bij kamertemperatuur.Breng vervolgens de bacteriële cultuur over op de chitinevlokken en incubeer de celsuspensie gedurende de nacht bij 30 °C. Meng daarna voorzichtig ten minste 200 ng van de fragmenten afkomstig uit de tweede ronde PCR in de bacteriële celsuspensie. Incubeer deze oplossing vervolgens nog een dag bij 30 °C zonder beweging, waarbij erop wordt gelet dat de bacteriën niet uitgebreid van de chitine-oppervlakken worden losgemaakt.Vortex nu de cultuur krachtig gedurende ten minste 30 seconden. Verspreid voor bacteriën die het PBR flip-plasmide bevatten 100 tot 300 µL van de celoplossing op dubbel selectieve platen die ampicilline bevatten, naast het andere antibioticum op de platen. Incubeer de bacteriële celculturen bij 30 °C totdat koloniën zichtbaar zijn. Isoleer vervolgens de enkelvoudige transformanten van de selectieve platen.Begin deze stap door de bacteriën te kweken op LB-agarplaten met ampicilline bij 37 °C gedurende 16 tot 24 uur. Als optionele stap kan de temperatuur gedurende twee tot drie uur worden verhoogd naar 40 °C, aangezien de expressie van flip vanuit het PBR-flip-plasmide bij hogere temperaturen wordt gederepreseerd. Na nog eens acht uur incubatie bij 37 °C worden de bacteriën overgezet naar verse platen.Beperk nu de klonen parallel op agarplaten met en zonder antibiotica om de antibioticagevoeligheid te testen en isoleer vervolgens één resulterende antibioticagevoelige kolonie. Begin deze stap door de cultuur gedurende de nacht onder aerobe condities bij 30 °C te kweken in verrijkingsmedium zonder antibiotica. Kweek de volgende ochtend een nieuwe cultuur gedurende drie tot zes uur door de overnight-cultuur in een verhouding van 1:100 te verdunnen in vers antibioticumvrij medium. Streken of plaat vervolgens in de middag een verdunning van de cultuur uit op gewone LB-agarplaten en incubeer de platen vervolgens nog eens acht tot 16 uur bij 30 °C totdat de kolonies zichtbaar zijn.In dit eerste experiment was het doel om de naburige genen CTXA en CTXB te deleten. De oligonucleotiden voor de trans-flip-methode werden gegenereerd zoals zojuist gedemonstreerd. De ouderstam, de tussenstam die de door FRT geflankeerde antibioticaresistentiecassette bevat in plaats van de oorspronkelijke DNA-locus van C-T-X-A-B, en de uiteindelijke stam waarbij C-T-X-A-B is gedeleteerd en de resistentiecassette is verwijderd, werden allemaal getest op hun genotype. Voor dit experiment werd een wholesale PCR uitgevoerd met primers die niet anneleren aan het transformerende PCR-fragment, maar uitsluitend aan het chromosomale DNA. De PCR-fragmenten werden gescheiden via standaard agarozelektroforese om hun grootte te bepalen.In baan één bevond de wereldwijde cholera-stam type B zich op de verwachte fragmentgrootte van 3 143 basenparen. In baan twee bevond het PCR-fragment afgeleid van stam delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT zich op 3 162 basenparen.En in baan drie bevond het delta ctx A B FFR TP CR-fragment zich op 1.769 basenparen vergeleken met de 1 KB-ladder. In het tweede voorbeeld, waarbij een volledig genomisch eiland werd verwijderd, werd het Vibrio Pathogenicity island one of VPI-1 gekozen als doelwit voor dit experiment. De trans flip-methode werd in twee stappen aangepast.Eerst werd de integratie van het kanamycine-resistentiegen voorafgegaan door een enkele FRT-site aan het begin van PI één. Vervolgens werd een tweede ronde van natuurlijke transformatie uitgevoerd, waardoor de insertie van een aanvullende antibioticaresistentiemarker mogelijk werd gemaakt, namelijk gentamycine-resistentie gevolgd door een tweede FRT-site aan het einde van het pathogeniciteits-eiland. De betreffende primerparen zijn aangegeven boven elke gelafbeelding en de trans FLP-methode werd voortgezet zoals zojuist gedemonstreerd.De ouderlijke, intermediaire en uiteindelijke stammen werden allemaal geverifieerd via PCR van het gezuiverde genomische DNA in baan één. Het PCR-fragment van de wildtype V cholera-stam werd geladen in baan twee. Het PCR-fragment resulterend uit stam VPI one FRT can GM FRT werd geladen.En in baan drie werd het PCR-product geanalyseerd dat was afgeleid van de stam delta VPI one FRT. Primerparen zijn aangegeven boven elke gelafbeelding. De uiteindelijke stam mist het gehele VPI one.In dit derde voorbeeld werd een T7 RNA-polymerasedependente promotorsequentie stroomopwaarts van het gen Tfox, een belangrijke regulator van natuurlijke transformatie, geïntegreerd met behulp van de trans-flip-methode met een lichte wijziging ten opzichte van het standaardprotocol. De consensussequentie van de T7 RNA-dependente promotor was opgenomen als overhangs in oligonucleotiden vier en vijf, zodat deze DNA-sequentie behouden bleef in het chromosoom. Nadat de antibioticaresistentiecassette was uitgesneden, werd het construct vervolgens geïntegreerd in een T7 RNA-polymerase-bevattende V-gekleurde stam.In deze stam werd de expressie van het T7-RNA-polymerasegen aangestuurd door de lacUV5-promotor om de T7-RNA-polymerase-afhankelijke expressie van T-Fox te testen. Assays voor natuurlijke transformatie werden uitgevoerd in LB-medium. De ouderstam, die de T7-afhankelijke promotor voorafgaand aan het T-Fox-gen mist, is onder deze omstandigheden niet natuurlijk transformeerbaar vanwege het gebrek aan T-Fox-transcriptie in rijk medium en in afwezigheid van de natuurlijke induceerder chitine. Dit fenotype was onafhankelijk van het feit of het T7-RNA-polymerase kunstmatig werd geïnduceerd door IPTG of niet.De trans-flip-gegenereerde stam, die de T7 RNA-polymerase-afhankelijke promoter stroomopwaarts van het competentiegen tfoX bevat, was echter wel natuurlijk transformeerbaar in verrijkt medium door lekkage van de lacUV5-promoter in LB-medium. De geproduceerde T7 RNA-polymerase transcribeerde tfoX al vanuit de T7 RNA-polymerase-afhankelijke promoter zonder inductie door IPTG. Dit initieerde natuurlijke competentie en transformatie, wat de functionaliteit van de geïntegreerde T7 RNA-polymerase-afhankelijke promotersequentie bevestigde.Dit fenotype werd significant versterkt door volledige inductie van het T7 RNA-polymerase door toevoeging van de inductor IPTG van de lacUV5-promotor. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe V. cholera genetisch gemanipuleerd kan worden met behulp van een combinatie van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie en flip-recombinatie. Zodra deze techniek onder de knie is, stelt deze u in staat om binnen enkele dagen genen of genomische eilanden te deleten, alsofsoort DNA-sequenties op een site-specifieke manier te integreren.

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Source: Erdogan, F.,et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for transferring an F plasmid from donor to recipient E. coli cells using a rescue plasmid and selecting transconjugants through dual antibiotic resistance. The process includes mixing bacterial cultures, incubation without shaking, disrupting mating pairs, and plating on selective media to confirm...

F Plasmid Transfer and Dual Antibiotic Selection in E. coli

Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

We beschrijven hier een protocol om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren tussen twee zeer verschillend uitgedrukte eiwitten in levende Pseudomonas aeruginosa met behulp van FLIM-FRET metingen. Het protocol omvat bacteriën stam constructies, bacteriën immobilisatie, beeldvorming en post-imaging data-analyse routines.

FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

De methode beschrijft de procedure waarmee de Hawaiiaanse bobtail...

Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri</em

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen...

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leer een snelle methode voor genetische modificatie van Vibrio cholerae via natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie. Deze techniek maakt efficiënt genoombewerking mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren

Meer video's verkennen