Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living

Het doel van dit experiment is om de visualisatie van in vivo proteïnedynamiek en lokalisatiepatronen in levende drosophila-embryo's aan te tonen met behulp van time-lapse confocale microscopie. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te oogsten van onderhouden drosophila-stammen. Plaats de embryo's vervolgens op een objectglas en verwijder daarna handmatig de cocons van de embryo's om gecoate embryo's te verkrijgen.

A wordt vervolgens op een georganiseerde wijze gemonteerd op vooraf geprepareerde objectglaasjes en kan, afhankelijk van het experiment, via micro-injectie worden voorzien van geschikte reagentia die het spoelgedeeltcheckpoint induceren. De laatste stap in deze procedure is het uitvoeren van time-lapse imaging van embryo's met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk worden time-lapse en focale microscopie gebruikt om het spoelgedeeltcheckpoint-eiwit, de colokalisatie van chromosoomgedragingen en het effect van checkpoint-inducerende middelen in checkpoint-gerelateerde transgene oph-lijnen aan te tonen.

De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ME-regulatie, zoals het effect van mutaties of depleties van het spoelscheiding-checkpointeiwit via het gebruik van genetische lijnen op de colokalisatie van andere checkpointcomponenten, en de consequentie hiervan voor het vermogen van het spoelscheidings-checkpoint om efficiënt te functioneren. Transgene vliegen worden gehouden bij 25 °C in plastic vials met vliegvoeding en aanvullend droog gistpoeder bovenop. De vial wordt routinematig elke twee tot drie weken vervangen, afhankelijk van de kweekcondities.

Om vliegenvoeding te bereiden, wordt een passende hoeveelheid van het vliegenvoedingsmengsel verhit onder constant roeren om de componenten op te lossen met behulp van een peristaltische pomp; verdeel vervolgens acht tot 10 milliliters van dit medium als slurry over elke plastic vial. Wanneer de voedingsslurry is gestold en is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt elke vial afgesloten met een katoenen schuimplug. Plaats deze voedingsvials in een tray, sluit deze af in een plastic zak en bewaar ze bij vier graden Celsius voor een kleinschalige eierverzameling.

Breng ongeveer 50 paren volwassen vliegen van twee tot drie dagen oud over naar een nieuw fly food-buisje, voorzien van extra droog gistpoeder op het oppervlak voor de afzetting van embryo's. Incubeer bij 25 °C, wat in dit geval de temperatuur is die door de airconditioning wordt gehandhaafd. Verplaats de vliegen elk uur naar een nieuw buisje en laat de embryo's 30 minuten rusten.

Om ervoor te zorgen dat een deel van de verzamelde embryo's zich in de nucleaire delingscyclus acht tot 10 bevond, werd de collectie van het eerste uur normaal gesproken weggegooid, aangezien deze vaak verouderde embryo's bevat die in het lichaam van het vrouwtje achterbleven toen de omstandigheden niet geschikt waren voor het leggen van eitjes. Daarom werden in deze experimenten alleen embryo's gebruikt van de overdracht vanaf het tweede uur en verder.

Voor deze procedure worden microscopische objectglazen en dekglasjes van 50 bij 22 millimeter gebruikt. Begin met het nemen van een dekglasje en maak met een vochtig fijn penseel de vier hoeken aan één zijde lichtjes nat met een zeer kleine hoeveelheid water. Plaats het dekglasje op een objectglas.

De capillaire oppervlaktespanning veroorzaakt door de dunne vloeistofilm moet voorkomen dat het dekglas verschuift. Breng een dunne strip heptaanlijm aan over het midden van het dekglas. Het heptaan moet binnen enkele seconden verdampen, waardoor de lijm op het dekglas achterblijft.

Gebruik vervolgens een diamantpen om een ander dekglasplaatje in kleine vierkantjes van ongeveer 1,5 millimeter vierkant te snijden. Pak één vierkantje en plaats dit aan één uiteinde van de lijmstrip. Dit wordt gebruikt om de naaldpunt te openen wanneer micro-injectie vereist is.

Neem een ander microscopieklepje, plak hier een stukje dubbelzijdige plakband van twee centimeter op en verwijder het beschermpapier om de procedure voor het coaten van embryo's te beginnen. Verplaats de vliegen met een vochtig en fijn penseel naar een nieuw voedingsbuisje. Verplaats ongeveer 50 eitjes naar de dubbelzijdige plakband op het geprepareerde klepje.

Gebruik een passende hoeveelheid vloeistof zodat de eieren verspreid kunnen worden. Wanneer de vloeistof is verdampt, zullen de eieren aan de tape kleven onder een dissectiemicroscoop. Tik de eieren voorzichtig meerdere keren langs hun langgapas aan met de buitenkant van één helft van een pincet tot het chorion gebroken en open is.

Laat het embryo in de Corian-schal om snelle uitdroging te voorkomen. Herhaal dit proces totdat 10 tot 20 eieren zijn behandeld. Pak vervolgens de embryo's op, verwijder ze één voor één uit de Corian-schal en plaats de embryo's voorzichtig in een verticale strip.

Op de lijmstrip. Lijn de embryo's zo uit dat hun lange zijde antiparallel loopt aan de lange zijde van de lijmstrip. Plaats de embryo's gedurende drie tot acht minuten in een uitdroogkamer.

Bedek ten slotte de embryo's met een passende hoeveelheid volter left tennis oil om overmatige uitdroging vóór de microinjectie te voorkomen. De microinjectie is het moeilijkste aspect van deze procedure. Om de microinjectie zo eenvoudig en efficiënt mogelijk te maken, dient het specifieke protocol voor de voorbereiding strikt te worden gevolgd.

De embryo's moeten zorgvuldig worden voorbereid zodat ze in optimale conditie zijn voor micro-injectie. De naalden voor het micro-injecteren van embryo's worden vooraf klaargemaakt. Vul met een fijne laadtip een naald van achteren aan met één tot twee microliters van de reagens in injectiebuffer in de juiste concentratie.

Bevestig de naald in de naaldhouder op een Leica TCSP twee geïnverteerde confocale microscoop, waarbij de drukbuis is aangesloten op het injectiecontrolesysteem. Zoek een embryo onder het 40-voudige objectief. Zoek vervolgens de schaduw van de naald zonder het brandvlak te wijzigen.

Dit wordt bereikt door de naald naar het midden van het gezichtsveld te bewegen en deze geleidelijk te laten zakken naar het juiste brandvlak. Verplaats de microscooptafel zeer voorzichtig om het kleine vierkantje dekglas te vinden dat aan één uiteinde van de lijmstrip is gemonteerd. Beweeg de naaldpunt zeer voorzichtig totdat deze de rand van het kleine vierkante dekglas raakt en dit voorzichtig openbreekt.

Verplaats de tafel zodat de embryo's weer in beeld komen en selecteer een embryo met de juiste leeftijd voor injectie. Verplaats het embryo voorzichtig naar de naald en stel het brandvlak opnieuw in voor zowel het embryo als de naald. Beweeg het embryo in de naald.

Inject een druppel reagens in de zijkant van het embryo en verplaats vervolgens het embryo. Time-lapse- of enkelvoudige beelden van levende embryo's worden verzameld met een Leica TCSS SP twee geïnverteerd confocaal microscopiesysteem met een 40-voudige olie-immersieobjectief. Bij het beelden van meerdere fluoroforen met overlappende spectra die co-expressie vertonen in hetzelfde embryo, wordt elke emissiegolflengte van het fluorescerende eiwit sequentieel verzameld.

De beelden kwamen later naar voren bij het instellen van de tijdsintervallen voor time-lapse imaging. Deze factoren moeten in overweging worden genomen. Gewoonlijk wordt een enkel beeld verkregen als een gemiddelde van twee scanlijnen.

Met een gemiddelde van twee framescans duurt het minimaal 6,3 seconden om een afbeelding van 512 bij 512 pixels te scannen in een simultane scanmodus en 15,44 seconden in een sequentiële scanmodus om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Het pinhole wordt normaal gesproken ingesteld op één tot twee au of airy-eenheden en het laservermogen wordt aangepast naar het laagst mogelijke niveau om significante fotobleeking te voorkomen. Deze representatieve time-lapse film toont de dynamische kinetische kernrekrutering van CDC 20 en chromosoombeweging in levende oocytes in embryonen.

Time-lapse beelden zijn gemaakt van een transgene initiële embryo dat GFP-CDC20 (getoond in groen) en RFP-histon H2B (getoond in rood) co-expresseert. Tijdens de nucleaire delingscycli werden elke 10 seconden zeven tot acht frames opgenomen, waarbij het frame waarin de cellen zich reeds in de profase bevinden als tijdstip nul wordt beschouwd. Deze figuur toont de frames uit de time-lapse film; GFP-CDC20 is duidelijk waarneembaar op de kinetochoren tijdens de profase en prometafase, zoals aangegeven door de witte pijlen in respectievelijk afbeelding drie en vier, en blijft aanwezig op de kinetochoren tijdens de metafase en anafase, zoals waargenomen in respectievelijk afbeelding vijf en zes.

G-F-P-C-D-C 20 is uitgesloten van de interfasekern aangegeven door de witte pijlpunt in afbeelding één en treedt de kern binnen tijdens de vroege profase, zoals getoond in afbeelding twee. In afbeeldingen acht tot 14 werden chromatinemorfologieën bepaald met gebruik van co-expressie van RFP histon 2B als samengevoegde markers. De afbeeldingen worden getoond in de onderste rij.

Met dit protocol kan de werking van het spoelfunctie-controlepunt (spindle assembly checkpoint of SAC) worden bestudeerd door embryo's te manipuleren via micro-injectie van antilichamen, fluorescent gelabelde eiwitten of relevante chemische verbindingen die potentieel de SAC activeren. In dit voorbeeld worden embryo's behandeld met colchicine om de microtubuli te depolymeriseren en zo de SAC te triggeren. Er werden twee kinetische kernsignalen gebruikt als markers voor de progressie van de celcyclus.

In het bovenste paneel geven de ARES de gearresteerde esci aan in afbeelding twee tot zes. Het gebied dat door een pijl wordt aangegeven in afbeelding één laat zien dat vóór de colchicinebehandeling G-F-P-C-D-C 20 is uitgesloten van de nucleus in de late interfase. De afbeeldingen in het middelste paneel laten zien dat in afwezigheid van endogeen MAD twee G-F-P-C-D-C 20, aangegeven door pijlen in zeven tot 12, blijft oscilleren in en uit de nucleus en aan en van de kinetochore.

Hoewel de cytokinesis defect lijkt te zijn, suggereert dit een falende SAC-functie bij het arresteren van cellen als reactie op de behandeling met Colchicine. Een voorbeeld van een mislukte scheiding van dochterkernen is te zien in afbeelding 10. Tot slot wijzen de pijlpuntjes in het onderste paneel in afbeeldingen 14 tot 18 op kinetische kernen in rust met geaccumuleerde GFP MA two-fusie-eiwitten, wat suggereert dat functioneel GFP MA two het SAC-defectfenotype in het MA two-mutante embryo herstelt.

De pijl in afbeelding 13 geeft de accumulatie van GFP MAD 2 aan in een kern in de late interfase. Na het bekijken van deze video's zou u een goed inzicht hebben in hoe u de twee software-embryo's van de stelen oogst, de embryo's handmatig decodeert voordat u de preparaten voor micro-injectie maakt en hoe u in vivo time-lapse imaging uitvoert met behulp van confocale microscopie.