Name: Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living Drosophila Syncytieel Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Leer de visualisatie van eiwitdynamiek en lokalisatiepatronen in levende Drosophila-embryo's met behulp van tijdsverloopconfocale microscopie. Deze methode maakt analyse van spilcontrole-eiwitgedrag en chromosoombeweging mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit protocol is ontwikkeld onder een Wellcome Trust subsidie. Wij danken mevrouw Maureen Sinclair voor het behoud van de vlieg voorraden en de voorbereiding van de vlieg voedsel door de jaren heen. We willen ook graag aan de heer Michael Aitchison bedanken voor zijn hulp en technische ondersteuning bij de ontwikkeling van dit protocol.

1. Transgene Vliegen en onderhoud <ol><li> De transgene vliegen die in deze demonstratie UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) mad2 EY ( III *) en UBQ-GFP-Cdc20 transgene vliegen werden eerder gegenereerd in het laboratorium via een standaard-element P gemedieerde transgene benadering 10,11 en UBQ-RFP-His2B een vriendelijke schenking van Yohanns Belaïche op UMR 144 CNRS / Institute Curie, Parijs, Frankrijk. Ze werden in een Mad2 mutant achtergrond via een standaard Drosophila genetica. De mad2 EY originele mutant lijn werd gekocht van de Bloomington voorraad centrum. We zullen niet ingaan op de procedure die wordt gebruikt voor het verhogen van de transformanten in dit protocol. Opmerking: * vertegenwoordigt chromosomenaantal. </li><li> Onderhoud: Transgene vliegen werden bij 25 ° C in kunststof flesjes containing vliegen eten en met extra droge gist poeder op de top. Het flesje werd routinematig vervangen 3-4 weken afhankelijk teeltomstandigheden (figuur 1). </li></ol> 2. Fly Voedselbereiding (Lab schaal) <ol><li> De juiste hoeveelheid van de vlieg voedsel mengsel werd verwarmd met constant voeren om de bestanddelen op te lossen. </li><li> Ongeveer 8-10 ml van dit medium werd verspreid als mest in elke plastic flacon (2,5 cm diameter x 8 cm lengte) met behulp van een Jencons Scientific Ltd peristaltische pomp. </li><li> Wanneer het voedsel slurry werd en afgekoeld tot kamertemperatuur wordt de flacon vervolgens aangesloten met een katoenen schuim plug. Deze voedingsmiddelen flesjes worden geplaatst in een bak die vervolgens wordt afgesloten in een plastic zak en bewaard bij 4 ° C voor later gebruik. </li></ol> 3. Kleinschalige Egg Collection <ol><li> Ongeveer 50 paren van 2-3 dagen oude volwassen vliegen werden overgebracht naar een nieuwe vlieg voedsel flacon voorzien extra droge gist poeder op het oppervlak bij 25 ° C layIng embryo&#39;s. </li><li> De vliegen worden dan overgebracht naar een nieuwe flacon per uur en laten de embryo&#39;s flacon 30 minuten om een ​​aantal van de verzamelde embryo&#39;s van rond kerndeling cyclus 8-10 wanneer de kern geleidelijk migreren naar de schors en ingericht als een monolaag. Het eerste uur collectie is normaal gesproken weggegooid omdat het vaak bevat oude embryo&#39;s die werden vastgehouden in het vrouwelijke lichaam als de omstandigheden waren niet geschikt voor het leggen. </li></ol> 4. Voorbereiden Dekglaasjes en Dia&#39;s <ol><li> Neem een ​​50 x 22 mm dekglaasje en licht de vier hoeken aan de ene kant nat te maken met een zeer kleine hoeveelheid water met een vochtige fijne pen penseel en zet het op een microscoopglaasje, zodat het dekglaasje niet beweegt als gevolg van de capillaire oppervlaktespanning door de dunne vloeistof film. </li><li> Breng een dunne strook van heptaan lijm over het midden van het dekglaasje, moet de heptaan verdampen in enkele seconden om de lijm te laten staan ​​dekglaasje aan. </li><li>Snijd een andere dekglaasje met een diamant pen in kleine vierkantjes (~ 1,5 mm 2), pick-up een en plaats het op het ene uiteinde van de lijm strip (dit wordt gebruikt om de naald te openen wanneer micro-injectie is vereist) en bewaar de andere voor de toekomst gebruikt. </li><li> Neem een ​​ander objectglaasje en plak een stukje dubbelzijdig plakband ongeveer 2 cm lang om het vast en trek het deksel van papier. (Zie figuur 2A en B). </li></ol> 5. Dechorionate Embryo&#39;s <ol><li> Breng de vliegen een verse voeding sluier en gebruik bevochtigde fijne pen borstel 50 eieren te brengen op de dubbelzijdige plakband op de slede met een geschikte hoeveelheid vloeistof om de eieren worden gespreid. Als de vloeistof verdampt is de eieren zal houden aan de tape. </li><li> Onder een stereomicroscoop druk de eieren een paar keer langs hun lange as met behulp van de buitenkant van een helft van een pincet voorzichtig totdat het chorion is gebroken en open, maar laat de embryo in de Chorion-shell om snelle uitdroging te voorkomen. Verder dit proces tot 10-20 van de eieren is behandeld (afhankelijk van het aantal van de eieren nodig voor een experiment). </li><li> De embryo kan dan worden opgevangen en uit het chorion schaal en zacht op de lijmstrook een voor een. De eieren kunnen worden geplaatst en hetzij afgestemd op de lange zijde van het embryo parallelle of anti-parallel aan de lange zijde van de lijmstrook afhankelijk als zij worden geinjecteerde. </li><li> De embryo&#39;s kunnen direct bedekt met een geschikte hoeveelheid Voltalef 10S olie (5:1 mengsel van Holocarbon 700 olie en 27 olie, Sigma) verder uitdroging voorkomen dat onmiddellijk imaging of in een kamer voor uitdroogtolerantie 3-8 minuten op uitdrogen ze verder afhankelijk van de vochtigheid in de ruimte en het doel van het experiment. De gedroogde embryo&#39;s moeten worden gedekt met de 10S olie waar nodig tot over-uitdroging te voorkomen als micro-injectie nodig is. (Zie afbeelding. 2C, D&amp; E). </li></ol> 6. Imaging Embryo&#39;s <ol><li> Time-lapse of enkele afbeeldingen van levende embryo&#39;s worden verzameld met behulp van een Leica TCS SP2 omgekeerde confocale microscopie-systeem met een HCX PL APO CS 40X 1.25 olie immersie objectief (60 of 100X doelstellingen kunnen worden gebruikt ook afhankelijk van het doel van het experiment, hoe hoger de vergroting gebruikte meer foto bleken optreedt). </li><li> Wanneer imaging meerdere fluoroforen, die overlappende spectra en samen in dezelfde embryo werd elke fluorescent eiwit Golflengte elkaar verzameld. De excitatie en emissie golflengtes beschikbaar op de Leica TCS SP2 systeem zijn: GFP, λ Ex: 488 nm en λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm en λ Em: 555-700 nm. </li><li> Een enkel beeld is vaak verkregen als een gemiddelde van 2 scanlines met een gemiddelde van 2 frame-scans. Dit duurt minimaal 6,3 seconden te scannen een 512x512 pIxel beeld een gelijktijdige scanmodus en 15,44 seconden voor een sequentiële scanmodus en produceert een goede signaal-ruisverhouding. Deze tijden moeten worden gehouden bij het opzetten van de termijnen voor time-lapse beeld verzamelen. </li><li> De pinhole is normaal ingesteld tot 1-2 AU (luchtige eenheid), en het laservermogen is aangepast aan de laagst mogelijke niveau tot een aanzienlijke fotobleken te voorkomen. </li></ol> 7. Uitlokken van de SAC door Microinjecting de Embryowet met de juiste reagentia <ol><li> Bereid de naald voor het experiment. Wij geven de voorkeur om de naald te trekken van gesiliconiseerde glazen capillairen (GC-100-10, Harvard) met behulp van de vlammende / bruin micropipet trekker (Sutter Instrument, Model: P-97) met parameters: warmte = 600, trek = 90, vel = 70 , del = 150. </li><li> Plantgat de naald met 1-2 ml van een geschikte concentratie van het reagens in injectie buffer met een fijne laad-tip (20 pl Eppendorf veel: W215818J). </li><li> Monteer de naald in de naald holder de microscoop met de persleiding verbonden met de Eppendorf injectie systeem. </li><li> Zoek een embryo onder de 40x objectief en vind de naald schaduw zonder dat het brandvlak door het bewegen van de naald in het midden van het gezichtsveld en geleidelijk verlagen van het naar de juiste brandvlak worden geplaatst. </li><li> Beweeg het embryo zachtjes de kleine kwadraat van de gebroken dekglaasje voorgemonteerd aan een uiteinde van de lijmstrook vinden. Heel voorzichtig beweeg de naald totdat hij raakt de rand van het kleine vierkante dekglaasje voorzichtig breekt open het. </li><li> Beweeg de embryo&#39;s in beeld en selecteer het embryo van de juiste leeftijd voor injectie. Ik Gewoonlijk injecteert het embryo op kerndeling cyclus bij 5-7, omdat dit voor de kernen naar buiten te migreren naar de cortex. De kerndeling fasen kan worden bepaald door een snel aftasten van de fluorescerende signalen van het GFP-Cdc20 of nucleaire signaal van de RFP-histon 2B voorafgaand aan injectie 9. </li><li> Verplaats voorzichtig de Embryo in de buurt van de naald en stel het brandvlak voor zowel het embryo en de naald. Verplaats de embryo in de naald en spuit een druppel van het reagens in de gewenste positie en af ​​te stappen van de embryo (of volg de instructies voor het micro-injectie-systeem). De embryo wordt geïnjecteerd de achterste of de zijkant afhankelijk van het doel van het experiment. </li><li> Na injectie wordt het embryo klaar om te worden afgebeeld op het juiste moment. (Zie afbeelding 2F &amp; G) </li></ol> 8. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Figuur 1. Benodigde materialen: een. fijne pen borstel, b. pleintje gebroken glazen container, c. 22 x 50 mm dekglaasje, d. microscoopglaasje, e. dubbelzijdige plakband, f. droge gist poeder in reageerbuis met gaten op de deksel, g. gistgranule voor vlieg onderhoud h. vliegen voedsel flacon, i. helft van een pincet voor dechorionate embryo&#39;s j. een paar pincet, k. heptaan lijm vloeistof container (maatkolf). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Figuur 2. De diagrammen tonen de voorbereiding van de dekglaasjes en dia&#39;s in stap 4, embryo dechorionation in stap 5 en naald voorbereidingen voor micro-injectie in stap 7. A. De bovenste foto toont een dekglaasje met een strook heptaan lijm in het midden en een vierkant met gebroken dekglaasje vast aan een uiteinde. De onderste foto toont een microscoopglaasje met een dun laagje water op de vier hoeken een dekglaasje te houden. De reden voor het gebruik van een dia aan het dekglaasje te houden is om ongeveer dezelfde brandpuntsafstand als die gevonden te houden als je dubbelzijdig plakband op de dia&#39;s en dus het vermijden heroriëntatie van de microscoop terwijl je are ontleden en het overdragen van de embryo&#39;s tussen de band en dekglaasje aan. B. Een dia met een korte lengte van dubbelzijdig plakband aangebracht voordat de afpellen van de cover papier dat voor dechorionating het embryo. C. De foto links toont embryo&#39;s met intacte chorion schelpen met gemarkeerde voorste en achterste uiteinden, de foto rechts ziet u de embryo&#39;s in de gebroken schelpen chorion voordat ze werden overgebracht naar het dekglaasje met de lijm strip D &amp; E Schema&#39;s tonen twee.. manieren voor het overbrengen, het plaatsen en uitlijnen van de dechorionated embryo&#39;s op lijmrillen. De embryo&#39;s werden gedekt door 10S olie na een passende uitdroging periode. F &amp; G. Diagrams laten zien hoe je de punt van de naald en plaats hem zodanig te injecteren te openen. Enkele of timelapse beelden verkregen bij de hierboven beschreven experimenten direct geanalyseerd met Leica software of opgeslagen in. TIF bestanden open format beschikbaar voor verdere kwantificering of bewerken van analyses met behulp van andere veel voorkomende beeldanalyse-programma&#39;s zoals Image J, Photoshop en Metamorph enz. Twee voorbeelden om dit te illustreren worden hieronder besproken: Voorbeeld 1: Een time-lapse film (figuur 3) geeft de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo&#39;s. De regio van de belangstelling van originele time-lapse sequence beelden was vastgesteld / gewijzigd en geautomatiseerde-batch omgezet met behulp van Photoshop-software. De film werd samengesteld met behulp van QuickTime-software. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Figuur 3. Een time-lapse filmpje toont de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo&#39;s. (A) Time-lapse foto&#39;s werden genomen van een transgene syncytieel embryo co-expressie GFP-Cdc20 (in groen)en RFP-histon 2B (in rood) fusie-eiwitten en werden opgenomen met een Leica TCS SP2 confocale systeem bij 18 ° C tijdens de kerndeling cycli 7-8. Frames werden genomen om de 10 seconden. Het frame met de cellen al in profase wordt behandeld als de nul tijdstip 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Klik hier om de film te bekijken voor Figuur 3A</a> . (B) GFP-Cdc20 gemakkelijk kan worden waargenomen op profase en prometafase kinetochoren (B3 &amp; 4, witte pijlen) en blijft op de metafase en anafase kinetochoren (B5 &amp; 6, witte pijlen). GFP-Cdc20 is uitgesloten van de interfase kern (White pijlpunt), het invoeren van de kern door vroege profase. Chromatine morfologie werden bepaald met behulp van co-expressie His2BmRFP als markers (B8-14). Bars = 5mm. Voorbeeld 2: SAC functies kunnen worden bestudeerd door het manipuleren van de embryo&#39;s door microinjecting antilichamen, fluorescent gelabelde eiwitten of Chemical verbindingen van belang dat mogelijk in de SAC te activeren. Bijvoorbeeld injecteren colchicine de microtubules depolymeriseren zodat teweeg te SAC zoals in figuur 4 10. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Figuur 4. Mad2 is essentieel voor colchicine-ingeroepen SAC functie 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 EY (mad2 - / - null mutant) en GFP-mad2; mad2 EY embryo&#39;s werden behandeld met colchicine door micro-injectie. Time-lapse confocale beelden werden genomen voor (01, 07 &amp; 13) of na injectie (02-06, bovenste panelen, 08-12, midden-panelen, 14-18, onderste panelen). GFP-Cdc20 (bovenste en middelste panelen) of GFP-Mad2 (onder) kinetochoor signalen werden gebruikt als celcyclus markers. Top paneel, de pijlen geven de gearresteerde kinetochoren in 02-06. Het gebied met een pijl in 01 blijkt dat voor colchicine behandeling GFP-CDC20 is uitgesloten van het einde van de interfase kern. Midden-paneel, in de afwezigheid van endogene Mad2, GFP-Cdc20 signalen nog steeds in en uit oscilleren van de kern, en op en naast de kinetochoren, hoewel cytokinese lijkt defect is, zoals verwacht in embryo&#39;s ontbreekt microtubuli, in aanwezigheid van colchicine (aangegeven met pijlen in 07-12) duidt op een mislukte SAC functie bij de arrestatie van cellen in reactie op colchicine behandeling. Scheiding van dochter kern niet in beeld 10. Onderste paneel, pijlpunten in 14-18 geven gearresteerd kinetochoren met de geaccumuleerde GFP-Mad2 fusie-eiwitten van de functionele GFP-Mad2 suggereren in redding van de SAC defect fenotype in Mad2 mutant embryo. Arrowhead in 13 geeft aan GFP-Mad2 accumulatie in een laat interfase kern. Bar = 5mm. De embryo&#39;s werden gemicroinjecteerd met ~ 1% ei volume van een 100mg/ml colchicine voorraadoplossing in 1 x PBS.

<ol><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li>
<li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy%2C+chromosomal+missegregation%2C+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li>
<li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+a+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li>
<li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC%2FC+inhibition+by+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li>
<li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li>
<li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+binding+of+p31%28comet%29+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li>
<li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC%2Fcyclosome+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li>
<li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein%2Fdynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li>
<li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li>
<li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li>
<li>Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaress%2C+RE+%22DNA+cloning%3A+A+practical+approach%22">DNA cloning: A practical approach</a>. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).</li>
<li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li>
<li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC%2FC%3A+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li>
<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382(2009).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503(2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven is een generieke methode voor de beeldvorming vliegen Syncytieel embryo&#39;s met behulp van een Leica TCS SP2 confocale laser scanning microscoop en kan worden aangepast om andere microscoop systemen aan te passen en kan ook worden aangepast aan andere gen-functies met behulp van Drosophila syncytieel embryo&#39;s te bestuderen. Wij hebben dit protocol om veel aspecten van de assemblage van de spoel checkpoint, eiwit dynamiek en eiwit proteolyse het gebruik van transgene vliegen of polyklonale antistoffen tegen het eiwit lokalisatie in woon-of vaste monsters 4,6,12-14 visualiseren te bestuderen. Het is het eenvoudigst om de vliegen te houden in verse vlieg voedsel flacons bij het verzamelen van kleine aantallen (~ 10 - 100) van de eieren. Dit vermindert de moeite van het maken van en het voorbereiden van extra appelsap agarplaten en ei verzameling kamers, zoals beschreven in andere publicaties 15,16. De toevoeging van een vierkant van gebroken glas dekglaasje aan een uiteinde van de lijmstrook op het dekglaasje maakt het veel gemakkelijkerom de naald te openen en vast te stellen de injectie volume door het aanpassen van de micro-injectie systeem instellingen, terwijl de naald wordt onder te dompelen in de 10S olie. De mate van uitdrogen van de embryo is belangrijk voor het succes van de injectie het voorkomen lekkage en handhaven van de embryo levensvatbaarheid bijzonder voor deze experimenten dat een lange tijdsperiode bij het omhoog of transformanten na injectie. Er is echter geen gouden regel hoe lang uitdroging vereist. Dit varieert van experiment om te experimenteren en is afhankelijk van de hoeveelheid ingespoten de oplossing en de vochtigheid van de werkomgeving. De functies van een specifiek eiwit van belang kan worden gemanipuleerd door microinjecting specifieke eiwit-remmers, mono-of poly-klonale antilichamen tegen een specifiek eiwit, messenger RNA of fluorescent gelabelde peptiden in wild-type of een genetische mutatie achtergronden. Veel van deze mutant lijnen of GFP-gelabelde transgene lijnen zijn openbaar avbaar van Drosophila voorraad centra en de meeste van hen zijn genoteerd op Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) en kan worden gezocht voor online.

Essentiële materiaal en reagentia Confocale imaging-systeem: De imaging-systeem zoals beschreven in dit protocol is een Leica TCS SP2 laser scanning confocale microscoop omgekeerde systeem. De beschreven werkwijze is ook geschikt misschien met kleine aanpassingen voor andere beeldvormende systemen. Stereomicroscoop: We maken gebruik van een Olympus SZX7 met DF PLAPO 1X-4 lens. Naald trekker: Flaming / bruin micropipet trekker (van Sutter Instrument, Model: P-97). Micro-injectie systeem: een Eppendorf microinjectie wordt beschreven, maar elk ander geschikt systeem kan worden gebruikt. Fly voedseldistributeur: Jencons Scientific Ltd peristaltische pomp. Reagentia: <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediënten </td><td> Gewichts </td><td> Middelen </td><td> Lot Nee. </td></tr><tr><td> Maïsmeel </td><td> 100.0g </td><td> SUMA, Verenigd Koninkrijk </td><td></td></tr><tr><td> Bruine suiker </td><td> 50.0g </td><td> Billington&#39;s Britse </td><td></td></tr><tr><td> Droge gist </td><td> 25.0g </td><td> DCL GIST Ltd Verenigd Koninkrijk </td><td></td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> 12,5 g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> Sorbinezuur </td><td> 0,4 g </td><td> BDH, VWR International BV Groot-Brittannië </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> Benzoëzuur </td><td> 2.9g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Methyl-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0,9 g </td><td> BDH, VWR International BV Groot-Brittannië </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O tot 1 liter </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabel 1. Fly voedselingrediënten. Holocarbon 700 en 27 oliën aangekocht van Sigma. Droge gist: Thomas Allison, Verenigd Koninkrijk. Voorbereiden van de heptaan lijm: Neem ongeveer 1,5 meter van dubbelzijdig plakband, zet het in een 15 ml Falcon buis met 5 ml heptaan en draai voor 3-5 uur of &#39;s nachts. Na die tijd verdeeld in 4 gelijke porties in 1,5 ml eppendorf centrifugebuizen en draaien 5 min bij een hoge snelheid in een tafelcentrifuge eventuele resten te verwijderen. Bewaar de heptaan lijm oplossing in een 10 ml maatkolf en bewaar ze voor gebruik. De lijm kracht is afhankelijk van de concentratie en de hoeveelheden van de gebruikte lijm. Normaal gesproken is de dunnere lijm produceert mindere lawaaierige achtergrond wanneer gescand door confocale microscoop. <ul><li> Coverslip: BDH, VWR International BV Groot-Brittannië </li><li> Microscoopglaasje: BDH, VWR International BV Groot-Brittannië &lt;/ Li&gt; <li> Gesiliconiseerde glazen capillairen: GC-100-10, Harvard </li><li> Fijn laden tip: 20μl Eppendorf veel: W215818J </li><li> Pincet </li><li> Fijn pen penseel </li></ul>

studeren mitotische checkpoint door te laten zien dynamic kinetochoor protein gedrag en chromosoom motion in living<em&gt; drosophila</em&gt; syncytieel embryo&#39;s

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

De assemblage van de spoel checkpoint (SAC)-mechanisme is een actief signaal, dat de interactie tussen chromosoom kinetochoren en spindel microtubuli bewaakt om anafase begin te voorkomen totdat de chromosomen goed zijn aangesloten. Cellen gebruiken dit mechanisme om aneuploidie of instabiliteit van het genoom, en dus kanker en andere ziekten bij de mens, zoals aangeboren afwijkingen en de ziekte van Alzheimer te voorkomen 1. Een aantal van de SAC componenten zoals Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10 hebben Rod en Aurora B kinase geïdentificeerd en ze zijn allemaal kinetochoor dynamische eiwitten 2. Er zijn aanwijzingen dat de kinetochoor is waar de SAC-signaal wordt gestart. De SAC belangrijkste doel is de regelgeving Cdc20. Cdc20 is een van de essentiële APC / C (A naphase B EVORDERING C omplex of C yclosome) activatoren 3 en is ook een kinetochoor dynamische eiwit 4-6. Geactiveerd de SAC remt de activiteit van de APC / C om de vernietiging van twee belangrijke substraten, cycline B en securin te voorkomen, waardoor ze de metafase om de overgang 7,8 anafase. Precies hoe de SAC signaal wordt geïnitieerd en gemonteerd op de kinetochoren en doorgegeven naar de APC / C voor de remming van de functie nog steeds ongrijpbaar blijft. Drosophila een uiterst handelbaar experimentele systeem, een veel eenvoudiger en beter begrepen organisme ten opzichte van de menselijke maar die deelt fundamentele processen gemeen. Het is misschien een van de beste organismen om voor bio-imaging studies gebruikt in levende cellen, in het bijzonder voor de visualisatie van de mitotische gebeurtenissen in ruimte en tijd, zoals het vroege embryo gaat tot en met 13 snelle kerndeling cycli synchroon (8-10 minuten voor elke cyclus op 25 ° C) en geleidelijk verzorgt de kernen in een monolaag net onder de cortex 9. Hier presenteer ik een bio-imaging methode met behulp van transgene Drosophila Expressing GFP (Groen fluorescent eiwit) of de variant gerichte eiwitten van interesse en een Leica TCS SP2 confocale laserscanning microscoop systeem de SAC functie vliegen te bepalen, door tonen beelden van GFP-eiwitten van enkele SAC componenten Cdc20 en Mad2 , als voorbeeld.

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s met behulp van een Leica laser scanning confocale systeem.

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Het mechanisme van het spoelfiguur-assemblage-controlepunt (spindle assembly checkpoint, SAC) is een actief signaal dat de interactie tussen chromosoomkinetochoren en de spoel monitort ...

Het doel van dit experiment is om de visualisatie van in vivo proteïnedynamiek en lokalisatiepatronen in levende drosophila-embryo's aan te tonen met behulp van time-lapse confocale microscopie. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te oogsten van onderhouden drosophila-stammen. Plaats de embryo's vervolgens op een objectglas en verwijder daarna handmatig de cocons van de embryo's om gecoate embryo's te verkrijgen.A wordt vervolgens op een georganiseerde wijze gemonteerd op vooraf geprepareerde objectglaasjes en kan, afhankelijk van het experiment, via micro-injectie worden voorzien van geschikte reagentia die het spoelgedeeltcheckpoint induceren. De laatste stap in deze procedure is het uitvoeren van time-lapse imaging van embryo's met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk worden time-lapse en focale microscopie gebruikt om het spoelgedeeltcheckpoint-eiwit, de colokalisatie van chromosoomgedragingen en het effect van checkpoint-inducerende middelen in checkpoint-gerelateerde transgene oph-lijnen aan te tonen.De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ME-regulatie, zoals het effect van mutaties of depleties van het spoelscheiding-checkpointeiwit via het gebruik van genetische lijnen op de colokalisatie van andere checkpointcomponenten, en de consequentie hiervan voor het vermogen van het spoelscheidings-checkpoint om efficiënt te functioneren. Transgene vliegen worden gehouden bij 25 °C in plastic vials met vliegvoeding en aanvullend droog gistpoeder bovenop. De vial wordt routinematig elke twee tot drie weken vervangen, afhankelijk van de kweekcondities.Om vliegenvoeding te bereiden, wordt een passende hoeveelheid van het vliegenvoedingsmengsel verhit onder constant roeren om de componenten op te lossen met behulp van een peristaltische pomp; verdeel vervolgens acht tot 10 milliliters van dit medium als slurry over elke plastic vial. Wanneer de voedingsslurry is gestold en is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt elke vial afgesloten met een katoenen schuimplug. Plaats deze voedingsvials in een tray, sluit deze af in een plastic zak en bewaar ze bij vier graden Celsius voor een kleinschalige eierverzameling.Breng ongeveer 50 paren volwassen vliegen van twee tot drie dagen oud over naar een nieuw fly food-buisje, voorzien van extra droog gistpoeder op het oppervlak voor de afzetting van embryo's. Incubeer bij 25 °C, wat in dit geval de temperatuur is die door de airconditioning wordt gehandhaafd. Verplaats de vliegen elk uur naar een nieuw buisje en laat de embryo's 30 minuten rusten.Om ervoor te zorgen dat een deel van de verzamelde embryo's zich in de nucleaire delingscyclus acht tot 10 bevond, werd de collectie van het eerste uur normaal gesproken weggegooid, aangezien deze vaak verouderde embryo's bevat die in het lichaam van het vrouwtje achterbleven toen de omstandigheden niet geschikt waren voor het leggen van eitjes. Daarom werden in deze experimenten alleen embryo's gebruikt van de overdracht vanaf het tweede uur en verder.Voor deze procedure worden microscopische objectglazen en dekglasjes van 50 bij 22 millimeter gebruikt. Begin met het nemen van een dekglasje en maak met een vochtig fijn penseel de vier hoeken aan één zijde lichtjes nat met een zeer kleine hoeveelheid water. Plaats het dekglasje op een objectglas.De capillaire oppervlaktespanning veroorzaakt door de dunne vloeistofilm moet voorkomen dat het dekglas verschuift. Breng een dunne strip heptaanlijm aan over het midden van het dekglas. Het heptaan moet binnen enkele seconden verdampen, waardoor de lijm op het dekglas achterblijft.Gebruik vervolgens een diamantpen om een ander dekglasplaatje in kleine vierkantjes van ongeveer 1,5 millimeter vierkant te snijden. Pak één vierkantje en plaats dit aan één uiteinde van de lijmstrip. Dit wordt gebruikt om de naaldpunt te openen wanneer micro-injectie vereist is.Neem een ander microscopieklepje, plak hier een stukje dubbelzijdige plakband van twee centimeter op en verwijder het beschermpapier om de procedure voor het coaten van embryo's te beginnen. Verplaats de vliegen met een vochtig en fijn penseel naar een nieuw voedingsbuisje. Verplaats ongeveer 50 eitjes naar de dubbelzijdige plakband op het geprepareerde klepje.Gebruik een passende hoeveelheid vloeistof zodat de eieren verspreid kunnen worden. Wanneer de vloeistof is verdampt, zullen de eieren aan de tape kleven onder een dissectiemicroscoop. Tik de eieren voorzichtig meerdere keren langs hun langgapas aan met de buitenkant van één helft van een pincet tot het chorion gebroken en open is.Laat het embryo in de Corian-schal om snelle uitdroging te voorkomen. Herhaal dit proces totdat 10 tot 20 eieren zijn behandeld. Pak vervolgens de embryo's op, verwijder ze één voor één uit de Corian-schal en plaats de embryo's voorzichtig in een verticale strip.Op de lijmstrip. Lijn de embryo's zo uit dat hun lange zijde antiparallel loopt aan de lange zijde van de lijmstrip. Plaats de embryo's gedurende drie tot acht minuten in een uitdroogkamer.Bedek ten slotte de embryo's met een passende hoeveelheid volter left tennis oil om overmatige uitdroging vóór de microinjectie te voorkomen. De microinjectie is het moeilijkste aspect van deze procedure. Om de microinjectie zo eenvoudig en efficiënt mogelijk te maken, dient het specifieke protocol voor de voorbereiding strikt te worden gevolgd.De embryo's moeten zorgvuldig worden voorbereid zodat ze in optimale conditie zijn voor micro-injectie. De naalden voor het micro-injecteren van embryo's worden vooraf klaargemaakt. Vul met een fijne laadtip een naald van achteren aan met één tot twee microliters van de reagens in injectiebuffer in de juiste concentratie.Bevestig de naald in de naaldhouder op een Leica TCSP twee geïnverteerde confocale microscoop, waarbij de drukbuis is aangesloten op het injectiecontrolesysteem. Zoek een embryo onder het 40-voudige objectief. Zoek vervolgens de schaduw van de naald zonder het brandvlak te wijzigen.Dit wordt bereikt door de naald naar het midden van het gezichtsveld te bewegen en deze geleidelijk te laten zakken naar het juiste brandvlak. Verplaats de microscooptafel zeer voorzichtig om het kleine vierkantje dekglas te vinden dat aan één uiteinde van de lijmstrip is gemonteerd. Beweeg de naaldpunt zeer voorzichtig totdat deze de rand van het kleine vierkante dekglas raakt en dit voorzichtig openbreekt.Verplaats de tafel zodat de embryo's weer in beeld komen en selecteer een embryo met de juiste leeftijd voor injectie. Verplaats het embryo voorzichtig naar de naald en stel het brandvlak opnieuw in voor zowel het embryo als de naald. Beweeg het embryo in de naald.Inject een druppel reagens in de zijkant van het embryo en verplaats vervolgens het embryo. Time-lapse- of enkelvoudige beelden van levende embryo's worden verzameld met een Leica TCSS SP twee geïnverteerd confocaal microscopiesysteem met een 40-voudige olie-immersieobjectief. Bij het beelden van meerdere fluoroforen met overlappende spectra die co-expressie vertonen in hetzelfde embryo, wordt elke emissiegolflengte van het fluorescerende eiwit sequentieel verzameld.De beelden kwamen later naar voren bij het instellen van de tijdsintervallen voor time-lapse imaging. Deze factoren moeten in overweging worden genomen. Gewoonlijk wordt een enkel beeld verkregen als een gemiddelde van twee scanlijnen.Met een gemiddelde van twee framescans duurt het minimaal 6,3 seconden om een afbeelding van 512 bij 512 pixels te scannen in een simultane scanmodus en 15,44 seconden in een sequentiële scanmodus om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Het pinhole wordt normaal gesproken ingesteld op één tot twee au of airy-eenheden en het laservermogen wordt aangepast naar het laagst mogelijke niveau om significante fotobleeking te voorkomen. Deze representatieve time-lapse film toont de dynamische kinetische kernrekrutering van CDC 20 en chromosoombeweging in levende oocytes in embryonen.Time-lapse beelden zijn gemaakt van een transgene initiële embryo dat GFP-CDC20 (getoond in groen) en RFP-histon H2B (getoond in rood) co-expresseert. Tijdens de nucleaire delingscycli werden elke 10 seconden zeven tot acht frames opgenomen, waarbij het frame waarin de cellen zich reeds in de profase bevinden als tijdstip nul wordt beschouwd. Deze figuur toont de frames uit de time-lapse film; GFP-CDC20 is duidelijk waarneembaar op de kinetochoren tijdens de profase en prometafase, zoals aangegeven door de witte pijlen in respectievelijk afbeelding drie en vier, en blijft aanwezig op de kinetochoren tijdens de metafase en anafase, zoals waargenomen in respectievelijk afbeelding vijf en zes.G-F-P-C-D-C 20 is uitgesloten van de interfasekern aangegeven door de witte pijlpunt in afbeelding één en treedt de kern binnen tijdens de vroege profase, zoals getoond in afbeelding twee. In afbeeldingen acht tot 14 werden chromatinemorfologieën bepaald met gebruik van co-expressie van RFP histon 2B als samengevoegde markers. De afbeeldingen worden getoond in de onderste rij.Met dit protocol kan de werking van het spoelfunctie-controlepunt (spindle assembly checkpoint of SAC) worden bestudeerd door embryo's te manipuleren via micro-injectie van antilichamen, fluorescent gelabelde eiwitten of relevante chemische verbindingen die potentieel de SAC activeren. In dit voorbeeld worden embryo's behandeld met colchicine om de microtubuli te depolymeriseren en zo de SAC te triggeren. Er werden twee kinetische kernsignalen gebruikt als markers voor de progressie van de celcyclus.In het bovenste paneel geven de ARES de gearresteerde esci aan in afbeelding twee tot zes. Het gebied dat door een pijl wordt aangegeven in afbeelding één laat zien dat vóór de colchicinebehandeling G-F-P-C-D-C 20 is uitgesloten van de nucleus in de late interfase. De afbeeldingen in het middelste paneel laten zien dat in afwezigheid van endogeen MAD twee G-F-P-C-D-C 20, aangegeven door pijlen in zeven tot 12, blijft oscilleren in en uit de nucleus en aan en van de kinetochore.Hoewel de cytokinesis defect lijkt te zijn, suggereert dit een falende SAC-functie bij het arresteren van cellen als reactie op de behandeling met Colchicine. Een voorbeeld van een mislukte scheiding van dochterkernen is te zien in afbeelding 10. Tot slot wijzen de pijlpuntjes in het onderste paneel in afbeeldingen 14 tot 18 op kinetische kernen in rust met geaccumuleerde GFP MA two-fusie-eiwitten, wat suggereert dat functioneel GFP MA two het SAC-defectfenotype in het MA two-mutante embryo herstelt.De pijl in afbeelding 13 geeft de accumulatie van GFP MAD 2 aan in een kern in de late interfase. Na het bekijken van deze video's zou u een goed inzicht hebben in hoe u de twee software-embryo's van de stelen oogst, de embryo's handmatig decodeert voordat u de preparaten voor micro-injectie maakt en hoe u in vivo time-lapse imaging uitvoert met behulp van confocale microscopie.

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en handige methode om te etiketteren en visualiseren van levende chromosomen in mitotische cellen met behulp van Histone2B-GFP BacMam 2.0 label en een draaiende schijf confocale microscopie systeem.

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Leer de visualisatie van eiwitdynamiek en lokalisatiepatronen in levende Drosophila-embryo's met behulp van tijdsverloopconfocale microscopie. Deze methode maakt analyse van spilcontrole-eiwitgedrag en chromosoombeweging mogelijk.

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living Drosophila Syncytieel Embryos (Video) | JoVE Journal

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living

Meer video's verkennen