Een vereenvoudigde methode voor

Vandaag demonstreren we een vereenvoudigde techniek om hoornvlies- en retinawefsel te isoleren uit een menselijke oogbol van cadaverdonoren. De beschreven techniek zal helpen om weefsel van goede kwaliteit te verkrijgen voor transplantatie, chirurgische en orale onderzoeksdoeleinden, zonder ander weefsel van de oogbol te beschadigen. Met 18 jaar expertise en een aantal jaarlijkse hoornvliestransplantaties hebben we een hoge standaard in ons werk gehandhaafd door voortdurend nieuwe technieken te ontwikkelen en onze vaardigheden dagelijks te verbeteren.

Om dit te bereiken, voeren we eerst een excisie van het hoornvlies uit, gevolgd door een evisceratie van het netvlies. Het hoornvlies is een avasculair weefsel dat de transmissie van licht naar het netvlies mogelijk maakt en voor dit doel altijd een hoge mate van transparantie moet behouden. Het hoornvlies bestaat uit vijf lagen: het epitheel, de laag van Bowman, het stroma, het Descemet-membraan en het endotheel.

Als het hoornvlies beschadigd is, kan dit worden vervangen met behulp van een geschikt donorhoornvlies. Het choroidea is het tussenliggende vlies tussen de sclera en het netvlies, begrensd aan de binnenzijde door het membraan van Bruch, en is verantwoordelijk voor de bloedtoevoer in het oog. Een adequate evisceratie van het choroidea is net zo belangrijk als de verwijdering van het netvlies.

Het netvlies helpt bij het ontvangen van het licht van het hoornvlies en de lens en zet dit om in chemische energie die uiteindelijk naar de hersenen wordt overgebracht. Omdat de oogzenuw transparant en fragiel is, moet deze systematisch worden geëviscereerd om een goede weefselkwaliteit te verkrijgen. Schakel de laminaire airflow-kast in.

Reinig de laminaire flowkast met 70% isopropylalcohol. Trek persoonlijke beschermende kleding aan, zoals een chirurgisch mutsje, steriele handschoenen en mouwbeschermers. Richt met behulp van aseptische technieken het steriele veld in door een steriel doek en een vooraf gesteriliseerde instrumentenbak te plaatsen.

Open de steriele instrumentenpakketten aseptisch en flip deze op het steriele veld, waarbij elke contaminatie wordt vermeden. Positioneer alle steriele materialen en instrumenten in het steriele veld en plaats de oogpotjes met de oogbollen zodanig dat ze zich aan de rand van het steriele veld bevinden. Voor gebruiksgemak worden de flessen met vooraf bereid bewaarmedium gelabeld en worden iodine polyol pyro lid op sodium th sulfate en een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing geplaatst.

Laat de oogweefsels en oplossingen, die bewaard worden in koelkasten bij vier graden Celsius, buiten de steriele voeding op kamertemperatuur komen. Vermijd herhaalde opwarm- en afkoelcycli. Verwijder gaasjes en sponsjes uit de oogpot met steriele pincetten.

Plaats de oogbol op het deksel en verwijder de extra verbanden. Pak de oogbol voorzichtig op samen met de oogzenuw en dompel de bol onder in steriele IPVP. Decontamineer de oogbollen in steriele IPVP gedurende twee minuten.

Overbreng de oogbol naar steriel natriumthiosulfaat voor één minuut. Overbreng de oogbollen naar een steriele fosfaatbuffer-cellijnoplossing en laat deze staan tot het moment van gebruik. Was en verwijder de oogbol vanuit de PBS onder een laminaire airflow-kap en plaats deze in het steriele veld.

Wikkel het oogbol met een steriel doek, waarbij het hoornvlies en ongeveer vijf millimeter sclera rondom het hoornvlies onbedekt blijven; de oogbol kan eenvoudig in de hand worden vastgehouden. Houd voldoende druk vast met een steriele schaar. Verwijder alle eventuele resten van het bindvlies zonder het hoornvlies te beschadigen.

Gebruik een wegwerpscalpelblad om een scleral incisie van drie tot vier millimeter vanaf de limbusregio te maken. Breid de incisie vervolgens over 360 graden uit, waarbij u voorkomt dat het onderliggende uveale weefsel wordt geperforeerd of dat de normale kromming van het hoornvlies wordt gedeformeerd. Maak vier grote incisies met vier kleine tussenpozen, waarbij u voorkomt dat het glasachtig lichaam vrijkomt.

Alle vier de openingen worden ingesneden, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen ander weefsel wordt verwijderd. De aanwezigheid van kleine sclera-plaques kan het snijden bemoeilijken, dus zorg dat de sclera-excisie met microsurgery-scharen volledig wordt voltooid. Deze handeling moet worden uitgevoerd zonder het choroidea-retina en het glaslichaam te beschadigen.

Inspecteer de incisie om te bevestigen dat deze volledig is. Indien de incisie correct is uitgevoerd, hecht de cornea-sclerale rand aan het ciliairlichaam enkel op het punt dat correspondeert met het hoornvlies; leg de oogbol vervolgens neer nabij het centrum van het steriele veld. Voltooi de verwijdering van het hoornvlies met behulp van een steriele pincet.

Houd de scleral rand stationair en exciseer de corno-scleral rand weg van de oogbol. Scheid voorzichtig alle overgebleven aanliggende weefsels van de corno-scleral knop. Trek de corno-scleral rand nooit op een manier die kruislingse corneale spanning kan veroorzaken, en laat deze niet terugvallen op de voorste oogkamer.

De endotheelceldichtheid van het hoornvlies wordt gecontroleerd met behulp van een hypotone oplossing en de celsterfte via tripanoonblauw-kleuring gedurende ongeveer één minuut. Verwijder de tripanoonblauw-kleurstof met een steriel gaasje en was het hoornvlies in steriele PBS. Breng het vervolgens over naar een steriele Petrischaal gevuld met sucrose-oplossing.

Deze oplossing helpt bij het creëren van een hypotone omgeving en maakt het mogelijk om de cellen visueel te identificeren. De cellen worden vervolgens geteld onder een optische microscoop bij een vergroting van 100x en gemeten als cellen per vierkante millimeter. Er wordt doorgaans gekeken naar de morfologie van de celdichtheid, zoals intercellulaire grenzen, polymorfisme, degeneratie, dystrofie en celsterfte.

De hoornvliesdikte is, samen met een goede transparantiegraad van het weggenomen hoornvlies, eveneens een belangrijk kenmerk voor transplantatie. Steriele corneaal CLO wordt gebruikt om het hoornvlies bij de scleral rand te fixeren; buig de corneaal CLO om te zorgen dat de opening van het gat voldoende groot is om de scleral rand te vergrendelen, en breng de scleral rand van het hoornvlies met een corneaal clove over naar een eerder voorbereid hoornvliesopslagmedium, dat op kamertemperatuur is bereid. Het hoornvlies moet vervolgens gedurende de vier weken durende bewaring van het hoornvlies worden geconserveerd bij 31 degree SIUs.

Het bewaarmedium wordt onderworpen aan verschillende microbiologische tests met behulp van een B 9 2 4 0 instrument. Aangezien het hoornvlies tijdens de bewaring dikker wordt dan de gebruikelijke maat die vereist is voor transplantatie, maken oogbanken gebruik van zwelremmende middelen om de dikte te verminderen. 6% Dextran T 500 wordt gebruikt om het hoornvlies terug te brengen naar de normale grootte en het transportmedium.

Reinig de steriele instrumenten met RNA-spray om een RNA-vrije omgeving te creëren voorafgaand aan de retinale excisie. Bereid het steriele veld voor en zorg ervoor dat de oogbol intact is en dat alleen het hoornvlies en de sclera-rand zijn verwijderd. Als het glasachtig lichaam naar buiten lekt, wordt het verwijderen van het retinale weefsel bemoeilijkt.

Indien de donor jonger is dan 65 jaar, wordt de sclera na serologisch onderzoek bewaard in 70% alcohol voor chirurgische doeleinden. In dergelijke gevallen wordt de sclera niet doorgesneden, maar wordt alleen het glasachtig lichaam verwijderd en de gehele sclera bewaard voor retina-excisie. Begin met een kleine snede of incisie nabij de hoornvlieszijde van de sclera en werk met steriele pincetten en scharen in de richting van de oogzenuw.

Houd het deel van de sclera vast met steriele pincetten en knip met de schaar stap voor stap in een rechte lijn richting de oogzenuw, waarbij beschadiging van het glasachtig lichaam wordt voorkomen. De choroïdale pluggen moeten van de sclera worden gescheiden, aangezien deze aan elkaar kleven. Knip de gehele sclera door om het choroïdweefsel bloot te leggen. Wat?

Zodra de sclera volledig is doorgesneden, scheidt u de sclera van de overige weefsels door deze nabij de oogzenuw door te snijden, waardoor een volledige laag choroidea die het glasachtig lichaam bedekt zichtbaar wordt. Vul deze steriele RNAse-vrije centrifugebuisjes met 2 ml RL-buffer met behulp van twee steriele pincetten. Verwijder de choroïdale laag voorzichtig door de oogzenuw met één pincet vast te pakken en de choroidea met het andere pincet te verwijderen.

Scheid het choroidea gedeeltelijk en knip het door om de verwijdering te vergemakkelijken. De choroidea-laag kan met een schaar worden doorgeknipt, waarbij beschadiging van het netvlies wordt vermeden. Plaats de uitgesneden choroidea-laag in de RNA later-oplossing en bewaar deze gedurende 24 uur bij vier graden Celsius.

Verwijder al het resterende choroidea om het retinale weefsel bloot te leggen. Zodra de volledige choroidea-laag is verwijderd, is een transparante laag retina zichtbaar. De choroidea-laag heeft duidelijk een intern Bruchs-membraan, dat ook verwijderd kan worden, maar het is moeilijk om dit met het blote oog te identificeren.

Gebruik op dezelfde manier twee pincetten om de retinale laag te verwijderen. Het is eenvoudig om een grote hoeveelheid retina te isoleren als de excisie nabij de oogzenuw plaatsvindt. Alle lagen van het oog zijn nu zichtbaar.

Plaats het uitgesneden retina in de RNA later-oplossing en bewaar deze gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Reinig het werkgebied met 70% isopropanol. De endotheelcellen, gekleurd met trypaanblauw, kunnen worden bekeken onder een 100-voudige vergroting van een omgekeerde microscoop.

Een geschikte cornea met meer dan 200 cellen per vierkante millimeter wordt gewoonlijk bewaard voor verder gebruik. Door deze te beoordelen op een schaal van redelijke tot uitstekende kwaliteit, kunnen vergelijkende studies worden verricht. Zodra de cornea gereed is voor transplantatie, worden gewoonlijk de dikte en de transparantie genoteerd, waarna een geschikte cornea wordt gebruikt voor een penetrerende keratoplastiek, waarbij de volledige cornea wordt getransplanteerd.

Celsterfte wordt gecontroleerd door het observeren van blauw gekleurde cellen en wordt uitgedrukt als het percentage dode cellen. Een totale celsterfte van meer dan 2% wordt als ongeschikt beschouwd tijdens de bewaring. Als de celdichtheid lager is dan 2200 cellen per vierkante millimeter of als er sprake is van schade door sterfte, kan het hoornvlies worden gebruikt voor een anterieure lamellaire keratoplastiek.

Als het anterieure trauma is beschadigd en het hoornvlies een goede endotheelceldichtheid heeft, kan het hoornvlies worden gebruikt voor posterieure lamellaire keratoplastiek. De dikte van het hoornvlies neemt gewoonlijk toe tijdens organkweek. Transportmedium helpt om de normale vorm en structuur te herstellen.

Daarnaast bevordert organcultuur de re-epithelialisatie van het hoornvlies en maakt de lange bewaartermijn een zorgvuldige donorselectie mogelijk. Microbiologisch en serologisch onderzoek. Het biedt voldoende tijd om een operatie te plannen en helpt bij het controleren van de endotheliale celdichtheid en morfologie wanneer dit niet mogelijk is vanwege een lange postmortale tijd.

Wanneer de beschreven procedure wordt gevolgd, kunnen de hoornvliezen worden uitgesneden zonder andere weefsels te beschadigen. Indien het hoornvlies niet geschikt is voor transplantatie, kan het worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, zoals het ontwikkelen van nieuwe media en bewaarcondities voor het bestuderen van ziekten van het oogoppervlak, het isoleren van limbale stamcellen en het bestuderen van het effect van geneesmiddelen op het hoornvlies. Voor het netvlies kunnen we kruiscontaminatie van RNA-monsters met centrale weefsels vermijden en de RNA-integriteit behouden, wat van fundamenteel belang is.

Deze weefsels, die onmisbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden, zijn bedoeld voor het karakteriseren van het transcriptoom van de oogweefsels, het isoleren van stamcellen voor projecten op het gebied van regeneratieve geneeskunde en het evalueren van histologische verschillen tussen weefsels van normale of aangedane subjecten. Zodra het retinaweefsel is verwijderd, kan het voor verschillende doeleinden worden gebruikt, waardoor de daaropvolgende stappen en condities voor bewaring dienovereenkomstig kunnen verschillen. Zo kan het retinaweefsel worden geplaatst in buisjes met RNA-stabilisatierereagentia zoals r nator of thisis-buffer voor RNA- of DNA-extractie, of in displaced of trypsine voor de isolatie van cellen.

Fixeeroplossingen voorafgaand aan het inbedden van weefsels in paraffine of OCT voor immunohistochemie. Bedankt voor het kijken naar deze video en veel succes met uw onderzoek.