GC-gebaseerde detectie van Aldononitrile Acetaat Gederivatiseerde Glucosamine en Muramic Zuur voor Microbiële Residu Bepaling in de bodem

Het algemene doel van deze video is om een gedetailleerde beschrijving te geven van de GC-gebaseerde analyse van de Aldon-nitrilacetaatderivaten van glucosamine en mucozuur die uit bodems zijn geëxtraheerd. Het proces begint met zuurdigestie, waarbij organische polymeren worden afgebroken en glucosamine en mucozuur vrijkomen. Monomere aminosugars worden vervolgens uit de mengoplossing geïsoleerd en gezuiverd.

Hierna volgt derivatisering om deze aminosugers om te zetten in vluchtige aldonnitrilacetaten voor analyse via gaschromatografie. De laatste stap van de procedure is de vloeistof-vloeistofextractie en de GC-bepaling. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een basislijnscheiding laten zien van de aldonnitrilacetaat-aminosugers die tussen de myo-, acetol- en methylglutaminestandaarden elueren via GC met vlamionisatiedetectie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden is dat het een optimaal evenwicht biedt tussen precisie, gevoeligheid, eenvoud, een goede chromatografische scheiding en stabiliteit bij de bewaring van monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de wereldwijde koolstofcyclus, zoals de bijdrage van SSE-microorganismen aan reservoirs van stabiele bodemkoolstof. Hoewel deze methode inzicht en informatie kan verschaffen over de accumulatie van microbieel detritus in bodems, kan deze ook worden toegepast op andere matrices, zoals oceanische systemen, biologische weefsels en zelfs buitenaardse monsters.

Om dit protocol te starten, vriesdroog de bodemmonsters na verzameling in het veld, en maal en homogeniseer de bodemmonsters met een kogelmolen voor bodemgrinding of een vijzel en stamper. Weeg de gemalen bodemmonsters af in hydrolysekolven van 25 milliliter. Voeg 10 milliliter zes molar zoutzuur toe aan elke hydrolysekolf en vul deze met stikstofgas voordat u ze stevig afsluit.

Hydrolyseer gedurende acht uur bij 105 °C in een incubator. Verwijder de kolven met behulp van een automatische timerschakelaar uit de incubator en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg 100 µL van de interne standaard myo-acetol toe aan elke kolf. Meng door te zwenken. Plaats plastic trechters die aflopen in peer-vormige kolven van 200 mL. Gebruik standaard tapsleutels met een maat van 24/40 geslepen glasverbindingen, geplaatst op plastic bekers voor de stabiliteit.

Vouw Whatman nummer twee kwalitatieve filterpapieren cirkels in vieren en plaats deze in trechters. Draai elke hydrolysekolf en giet het mengsel in de trechter. Om elk monster te filteren, wordt het filtraat gedroogd met een rotatieverdamper bij ongeveer 45 °C onder vacuüm.

Suspendeer het gedroogde residu uit elke paarfles met drie tot vijf milliliter water en giet dit in een Teflon buis van 40 milliliter. Spoel elke fles na met een tweede aliquot water. Stel de pH van de monsters in op 6,6 tot 6,8 met behulp van een een molaire kaliumhydroxide-oplossing om metaalionen en andere organische moleculen neer te slaan. Verwijder vervolgens de neerslag door centrifugatie bij 2000 ×g gedurende 10 minuten na centrifugatie.

Giet de supernatanten in glazen buizen van 40 milliliter en bedek de openingen van de buizen met parafolie; vries de supernatanten vervolgens in en prik gaatjes in de parafolie. Lyofiliseer de bevroren supernatanten om alle vloeistof te verwijderen. Zodra de supernatanten zijn gedroogd, wordt het residu opgelost in drie milliliters droge methanol.

Vortex grondig, sluit de buisjes af en centrifugeer vervolgens bij 2000 ×g gedurende 10 minuten. Om zouten neer te slaan, worden de supernatanten overgebracht naar conische reactiebuisjes van drie milliliter en tot droogte ingedampd met een rapid VA-apparaat bij 45 °C of onder een zachte stroom droog stikstofgas. Voeg na verdamping aan elk buisje 100 µL herstelstandaard en methylglutamine en één milliliter water toe.

Bevries vervolgens de monsters voordat u begint met de derivatisering. Maak standaarden zoals beschreven in het schriftelijke protocol en vriesdroog daarna zowel de monsters als de standaard. Bereid het derivatiseringsreagens voor dat 32 milligram per milliliter hydroxylaminehydrochloride en 40 milligram per milliliter bevat.

Vier dimethylaminopurine in purine methanol. Voeg 300 µL van het derivatiseringsreagens toe aan elk van de reactiebuisjes, sluit deze stevig af en vortex grondig. Plaats de verzegelde buisjes gedurende 35 minuten in een waterbad van 75 tot 80 °C.

Haal de vials uit het waterbad en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens één milliliter azijnzuuranhydride toe aan elk van de drie milliliter reactievials, sluit deze stevig af en vortex grondig. Volg dit met een tweede incubatie in een waterbad van 75 tot 80 °C gedurende 25 minuten.

Haal de vials uit het waterbad en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg om te beginnen met de scheiding en meting 1,5 milliliters dichloormethaan toe aan elke buis en vortex vervolgens. Voeg vervolgens één milliliter één molar zoutzuur toe aan elke vial, vortex grondig en laat de oplossingen ongestoord staan tot de twee fasen gescheiden zijn.

Zuig de bovenste waterige fase af en gooi deze weg. Extraheer de organische fase op dezelfde wijze drie keer met een 1000 microliter pipet, maar gebruik bij de laatste wasstap één milliliter water. Let er nauwgezet op dat alle waterige bovenfase volledig is verwijderd.

Droog de uiteindelijke oplossing met een snelle VAP bij 45 °C of met een stroom nitrogengas, lossen elk monster op in 300 µL ethylacetaat-hexaan en overbreng dit naar amberkleurige schroefdopbuisjes van twee milliliter met een insert voor kleine volumes. Sluit deze stevig af voor kwantificatie via gaschromatografie met een vlamionisatiedetector, waarbij een niet-polaire capillaire kolom van gefuseerd silica wordt gebruikt, zoals DB five, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Pas na de standaardrun en analyse de stroomsnelheid van het dragergas aan, zodat de acetolglucosamine- en mu-aminezuurderivaten elueren bij 250 °C en de eind-methylglutamine elueert bij 270 °C.

Voer na de gaschromatografische run een split-injectie van 1 µL in een verhouding van 30:1 uit, waarbij de GC-inlet is ingesteld op 250 °C met behulp van een autosampler. Voer als laatste stap van deze procedure de validatie van het derivaat uit met de chromatografie- en spectrometriemethoden die in het schriftelijke protocol worden besproken. Voorbeelden van de analyse van glucosamine en ureumzuur uit standaardstengels en uit een bodemmonster worden hier getoond; naast glucosamine en muïnezuur kunnen ook twee isomeren van glucosamine, osamine en galactosamine, gelijktijdig worden bepaald met deze methode, op basis van de nauwkeurige hoeveelheid van de toegepaste standaarden en de responsfactoren van elk van de twee interne standaarden.

De hoeveelheid van deze biomarkers in de bodemmonsters kan worden bepaald. De herstelstandaard is ook gebruikt om het derivatiseringsproces kwalitatief te monitoren. De schema's voor de vorming van aldonnitrilacetaat, gederiveerde glucosamine en muïnezuur worden hier getoond.

Nummer één vertegenwoordigt de nitrilreactie en nummer twee vertegenwoordigt acetylering. De voorgestelde structuren van de ionfragmenten die bij elektronenionisatie werden gevormd, zijn bestudeerd door de ionspectra van de monsters die met verschillende isotoopinbouw waren bereid, te vergelijken. Hier wordt de massaverschuiving van het dominante ion van het aldonnitrilacetaatderivaat van glucosamine in verschillende scenario's getoond.

In dit voorbeeld is de bereiding uitgevoerd met niet-gelabelde reagentia, evenals met isotoopgelabeld azijnzuuranhydride en isotoopgelabelde glucosamine. De ster in de chemische structuur staat voor het zware isotoopatoom of de isotoopgroep. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om strikt watervrije omstandigheden te handhaven tijdens de derivatisering.

Zowel de organische oplosmiddelen als het gebruikte glaswerk moeten in deze fase droog zijn. Hoewel veel leveranciers watervrije oplosmiddelen verkopen, kunnen de aanwezige oplosmiddelen worden gedroogd door ze door kolommen te leiden die droogmiddelen bevatten, zoals magnesiumsulfaat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ratio-massaspectrometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe macrobeauté reageert en hoe koolstof of stikstof in bodems wordt omgezet en opgehoopt door levende en dode macro s na de ontwikkeling te differentiëren.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van macro-ecologie en bodembiologie en -chemie om de macro-bijdrage aan organische stof in de bodem en de sequestratie in natuurlijke of beheerde terrestrische systemen te onderzoeken.