Name: Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer hoe u experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) induceert in resistente muizenstammen via adoptieve overdracht van lymfekliercellen en antigeen challenge. Deze methode maakt betrouwbaar onderzoek naar auto-immuunziekten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mede ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 NS37253 en N01 NS055167) en de National Multiple Sclerosis Society (RG 3288-A6).

1. Voorbereiden CFA-geëmulgeerde Antigen <ol><li> Los cavia MBP (bereid volgens de werkwijze van Swanborg1 en opgeslagen in gevriesdroogde vorm bij 4 ° C) in fosfaatbufferoplossing (PBS) in een concentratie van 2 mg / ml. Als gesynthetiseerd MBP peptiden (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 worden gebruikt, stelt een 2 mg / ml oplossing. Opstellen van een geschikte hoeveelheid antigeen-oplossing (0,1 ml per muis om te worden gevaccineerd) in een glazen injectiespuit met luer-lok. </li><li> Stel een volume volledig Freund&#39;s adjuvans H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) gelijk aan het antigeen oplossing in een injectiespuit met luer-lok. </li><li> Sluit de twee glazen spuiten met een drie-weg kraan. Meng de MBP oplossing met de CFA door op de plunjers heen en weer. Houd de beweging tot een emulsie wordt gevormd. </li><li> Om te testen of er een emulsie ontstaat, duwt al het mengsel in een spuit. Maak de lege spuit, trek thij zuiger iets en ontladen een druppel van de resterende emulsie in een bekerglas van schoon water bij kamertemperatuur. Indien de emulsie druppel blijft intact op het oppervlak van het water wordt een emulsie gevormd. Als de emulsie druppel verspreidt, sluit u de spuiten en verder het mengen beweging. </li><li> Gebruik een 1 ml plastic spuit voor de immunisatie proces om de levering van een nauwkeurige dosering van antigeen te verzekeren. Om het antigeen emulsie te dragen aan de plastic spuit, trek de zuiger en plaats de lege plastic spuit in de opening van drie-weg kraantje waar de vorige glazen injectiespuit werd verbroken als in 1.4. </li><li> Vul de plastic spuit van de rand door de zuiger van de injectiespuit. Plaats de zuiger van de plastic spuit heen en terug te duwen overtollige emulsie tot het bereiken van de 1,2 ml markering op de plastic spuit. Deze manoeuvre zorgt ervoor dat er geen luchtbel zit gevangen in de plastic spuit. </li><li> Verwijder het plastic spuit van de drie-weg kraan. Attach een # 26 gauge naald voor aan de plastic spuit. Duw de zuiger naar de 1 ml markering, zodat de emulsie nu het dode volume van de naald vult. </li></ol> 2. Immunisatie van Donor Muizen Let op: Vrouw C57BL / 6 muizen zijn meestal geïnjecteerd met antigeen-emulsie in vier plaatsen in de flanken, naar aanleiding van de methoden die oorspronkelijk ontworpen door de groep McFarlin&#39;s 3 bij de National Institutes of Health. Voor een ervaren onderzoeker, kan een persoon uit te voeren van de gehele taak. Voor beginners, kan hulp worden gevraagd, zodat een persoon de muis houdt en de andere persoon doet de injectie. Alternatief kan de muis worden verdoofd voor de injectie. <ol><li> Vasthouden van de muis bij de nek en de huid leggen dat de staart tussen de 4 e en 5 e vingers zodanig dat de thorax en de buik zijn gemakkelijk bereikbaar. </li><li> Plaats de naald van de 1 ml plastic spuit op een plaats in de thorax iets boven de rechter oksel (van de mogebruiken) en subcutaan injecteren 0,05 ml van het antigeen emulsie. Een kleine uitstulping van de witachtige CFA kan worden gezien door de bleke huid. Herhaal hetzelfde voor de site in de thorax iets boven de linker oksel. </li><li> Laat de staart en pak de rechtervoet (van de muis), draai hem en houd hem tussen de 4 e en 5 e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de rechter flank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie. </li><li> Laat de rechter voet, draait u de muis de andere kant op en houd de linker voet (van de muis) tussen de 4 e en 5 e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de linkerflank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie. </li><li> Ga verder met een nieuwe naald na de injectie van 10 muizen, of als de naald wordt afgestompt. </li></ol> 3. Isolatie van lymfeknoopcellen voor Tissue Culture 7 tot 10 dagen na immunisatie <ol><li> Zeven tot 10 dagen na immunisatie, offeren de muizenen verwijder de drainerende lymfeklieren. De voorkeursmethode van euthanasie met CO2 inhalatie. Na het offer, leg de muis op zijn rug op een dissectie bord met de ledematen gestrekt en bevestigd aan het bord met pinnen. De muizen werden bevochtigd met een nevel van 70% ethanol. </li><li> Ingesneden in de huid lengterichting in het midden van de onderzijde van de buik naar de kin met steriele scharen en tang. </li><li> Snij de buik huid van het gebied van de lies aan elke poot. Trek en speld van de huid, waardoor de lies lymfeklieren. </li><li> Snijd de huid langs de voorpoten (links en rechts), zodat de huid kan worden geschild terug en vastgepind op de axillaire lymfeklieren in de buurt van de oksels bloot te leggen. </li><li> Met twee paar tang samen te werken, weg te trekken het bindweefsel over en rond de lies lymfeklieren. Als het bindweefsel worden gewist, zet een paar tangen onder de lymfeklier en weg te trekken uit het lichaam. Plaats hetlymfeklieren in een 35 mm petrischaal gevuld met steriele PBS. </li><li> Trek de bindweefsels die de twee okselklieren gebruik van twee paar pincetten. Isoleer de lymfeklieren en plaats ze in de petrischaal. Wees zeer voorzichtig dat u de bloedvaten het oversteken van de gebied als bloeding maakt het identificeren van de lymfeklieren heel moeilijk te doorbreken. </li><li> Nadat alle lymfeklieren worden verzameld, verplaatst u de petrischaal op een bioveiligheid kap. Breken en uit elkaar te plagen de lymfeklieren met de twee paren van de verlostang, slijpen de een tegen de ander. Alternatief kan de lymfeknopen worden gebroken met de platte kant van de plunjer van een 3 ml plastic spuit drukken tegen de lymfeknopen op de bodem van de petrischaal. </li><li> Haal het gepest lymfeklier celsuspensie door middel van een nylon mesh aan de membranen en vuil te verwijderen. </li><li> Maak de lymfeklier celsuspensie tot 50 ml met een steriele PBS. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in kweekmedium. Doe een levensvatbare cell tellen en de concentratie aan te passen aan 4 x 10 6 cellen / ml. UseRPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfserum, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat MEM, 0,1 mM MEM niet essentiële aminozuren, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 10 mM Hepes buffer en 5 x 10 -5 M 2-ME. Pre-warm de cultuur voordat resuspenderen de cellen. </li><li> Cultuur de cellen in 24-well kweekplaten met 2 ml per putje (eindcelconcentratie 8 x 10 6 cellen / putje). Voeg antigeen in elk putje met een uiteindelijke concentratie van 100 pg / ml. Plaats de cultuur plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO 2. Incubeer cellen gedurende 5 dagen. </li></ol> 4. Oogsten Gekweekte lymfeknoopcellen 5 dagen na aanvang van culturen <ol><li> Meng de cellen in elk putje met en neer te pipetteren een Pasteur pipet of glas een klein volume pipet. Oogst de cellen een 50 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspend de celpellet in een klein volume PBS. </li><li> Tel cellen en stel de levensvatbare cellen concentratie 2,5 x 10 8 cellen / ml met steriele PBS. Teken de cellen in een injectiespuit voorzien van een # 26 gauge naald. </li><li> Plaats een warmte lamp boven de kooi van de ontvangende muizen om te helpen verwijden de staartader. </li><li> Een muis houder uitstrekken de staart van de muis door de gleuf in de houder. Trek aan de staart uit te breiden. Zoek de ader. </li><li> Injecteer 0,2 ml / muis van de celsuspensie gelijk 5 x 10 7 cellen. </li></ol> 5. Antigene uitdaging van de ontvanger Muizen 20 dagen na de Cell overdracht en ontwikkeling van de ziekte symptomen <ol><li> Challenge ontvanger muizen niet tekenen van de ziekte met het antigeen. De procedures zijn dezelfde als hoofdstuk 2 inzake &quot;Immunisatie van Donor Muizen&quot;. </li><li> Let op de ontwikkeling van de ziekte van verlamde 7 tot 10 dagen na de antigene uitdaging. <ol><li> Ziekte begint met zwakte in de staart. Ziekte wordt ingedeeld bij eenAls de staart wordt slap. Ziekte wordt ingedeeld bij een 2 als de muis is verlamd in een achterpoot. Ziekte wordt beoordeeld 3 wanneer beide achterpoten verlamd zijn en de muis sleept beide achterste ledematen bij het kruipen naar voren. Ziekte wordt beoordeeld 4 wanneer de muis verliest gebruik van beide voorpoten, waardoor de muis volledig immobiel. Ziekte wordt beoordeeld 5 wanneer de muis is ten dode opgeschreven en het lichaam krult omhoog. De dood wordt gescoord als de ziekte van klas 6 4. </li></ol></li><li> MBP-specifieke EAE geïnduceerd in C57BL / 6 muizen na dit protocol is monofasische. De muizen kunnen herstellen van de ziekte, maar niet ondergaan spontane terugval. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Muizen die ontvangen primer en in vitro-uitgebreide donor lymfeknoopcellen niet ontwikkelen van EAE symptomen van de ziekte, als gevolg van hun resistentie tegen ziekten inductie. Echter, ernstige ziekte ontwikkeld na antigene uitdaging (Tabel I), waaruit blijkt het vermogen van de antigene uitdaginghet omkeren van de resistentiemechanisme. Twee speciale kenmerken van de bekende antigene uitdaging is de dosering van antigeen en de kinetiek van uitdaging om ziekte te veroorzaken. Zeer lage dosis antigeen nodig als weergegeven in tabel III. Verrassenderwijs kan muizen die donorcellen een jaarlijks nog vroeger van ernstige ziekte bij provocatie met het antigeen (Tabel IV). Deze twee observaties suggereren de betrokkenheid van de &quot;lange duur&quot; T-cellen in het handhaven van EAE weerstand. Dit protocol is voor vele EAE resistente muizenstammen 4. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele opzet voor de inductie van EAE in het beroemde resistente muizenstammen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Klinische EAE Na adoptieve overdracht </td><td colspan="3"><strong&gt; Klinische EAE na antigene uitdaging </td></tr><tr><td> Spannen </td><td> Antigeen </td><td> incidentie </td><td> Av. ziekte van kwaliteit (Bereik) </td><td> Av. dag van het begin (Bereik) </td><td> Incidentie </td><td> Av. ziekte van kwaliteit (Bereik) </td><td> Av. dag van het begin (Bereik) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21/21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7/7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Balb / c </td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> Tabel I. Inductie van MBP-gemedieerde EAE in C57BL / 6 muizen. Adoptieve overdracht van primer en in vitro-uitgebreide donor cellen induceerde geen EAE in C57Bl / 6 muizen. Antigene uitdaging bericht cel overdracht maakte de muizen gevoelig voor de ziekte van inductie. Av., Gemiddeld. ND, niet gedaan. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Klinische EAE na antigene uitdaging </td></tr><tr><td> Priming Antigen </td><td> Challenge antigeen </td><td> Incidentie </td><td> Av. ziekte van kwaliteit (Bereik)</td><td> Av. dag van het begin (Bereik) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> CFA alleen </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> MBP-CFA </td><td> 3/3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> Tabel II. De specificiteit van de antigene uitdaging. Ontvanger muizen geprikkeld met de priming antigeen en andere irrelevant antigenen. Alleen de priming antigeen veroorzaakt ernstige ziekte. OVA: kip ovalbumine. Av., Gemiddeld. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Klinische EAE na antigene uitdaging </td></tr><tr><td> Challenge antigeen doses (ug / muis) </td><td> Incidentie </td><td> Av. ziekte van kwaliteit (Bereik) </td><td> Av. dag van het begin (Bereik) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4/4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4/4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4/4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2/4 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel III. Challenge antigeen doses die nodig zijn voor de ziekte van inductie. Verschillende concentraties van MBP gebruikt voor het ontvangende muizen uitdagen werden getest. Av., Gemiddeld. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Klinische EAE na antigene uitdaging </td></tr><tr><td> Challenge antigeen </td><td> Dag van de Uitdaging </td><td> Incidentie </td><td> Av. Ziekte kwaliteit (Bereik) </td><td> Av. Dag van het begin (Bereik) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 5 </td><td> 3/4 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 10 </td&gt; <td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 15 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 35 </td><td> 4/4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 60 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 343 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 445 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> Tabel IV. Kinetiek van antigene uitdaging. Ontvanger muizen werden uitgedaagd op verschillende tijdstip bericht vast te stellenive cel overdracht. Av., Gemiddeld.

<ol><li>Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanborg%2C+RH+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice%3A+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li>
<li>McCarron, R., McFarlin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL%2FJ%2C+PL%2FJ%2C+and+%28SJL%2FJ+x+PL%2FJ%29F1+mice.+Influence+of+I-A+haplotypes+on+encephalitogenic+epitope+of+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein.</a> J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge+induces+consistent+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+and+other+reputed+resistant+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains.</a> J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+T+cells+also+recognize+neuronal+autoantigen+in+a+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 15, 626-632 (2009).</li>
<li>Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+plays+an+important+role+in+the+homeostatic+regulation+of+the+autoreactive+reperteroire+in+na%C3%AFve+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice.</a> J. Immunol. 173, 828-834 (2004).</li>
<li>Anderton, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+and+T-effector+cells+in+autoimmune+CNS+inflammation%3A+a+delicate+balance+easily+disturbed%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed.</a> Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).</li>
<li>Arnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+-+susceptibility+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression.</a> Immunol. Rev. 55, 5(1981).</li>
<li>Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+mice+by+antibodies+against+IFN-g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g.</a> J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).</li>
<li>Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis-resistant+mice+have+highly+encephalitogenic+myelin+basic+protein+%28MBP%29-specific+T+cell+clones+that+recognize+a+MBP+peptide+with+high+affinity+for+MHC+class+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II.</a> J. Immunol. 154, 388-398 (1995).</li>
<li>Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+proteolipid+protein-specific+CD4%2BCD25%2B+regulatory+cells+mediate+genetic+resistance+to+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).</li>
<li>Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-+specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature Med. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+MK+%22Neuroimmunology+Research+Focus%22">Neuroimmunology Research Focus</a>. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).</li>
</ol>

Geen financiële informatie.

Studies van EAE in muizen vaak gebruik maken van de neuroantigens, myeline basis eiwit (MBP), proteolipid proteïne (PLP) of myeline oligodendrocyt eiwit (MOG). Eerdere studies meestal gebruikt MBP. PLP stimuleert sterke en consistente reacties van SJL muizen. Meer recent, MOG is de gebruikte gemeenschappelijke neuroantigen omdat B6 muizen zijn gevoelig voor de ziekte van inductie met dit antigeen. Veel van het gen gerichte muizenstammen op de B6 genetische achtergrond. Interessant, B6 muizen zijn gevoelig voor inductie ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Cavia ruggenmerg </td><td> Rockland Immuno-chemicaliën, Inc Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> bevroren </td></tr><tr><td> Freund&#39;s adjuvans, compleet H37Ra </td><td> Difco Laboratories Detroit, MI </td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit uitwisselbaar kunnen spuit </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / ons</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> MediatechInc Manassas, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10 tot 040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Muizen </td><td> Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine </td><td> B6 muizen: 0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (eae) resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en antigene challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE) is een ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en is gebruikt als diermodel voor studie van de menselijke demyeliniserende aandoening, multiple sclerose (MS). EAE wordt gekenmerkt door pathologische infiltratie van mononucleaire cellen in het centraal zenuwstelsel en klinische manifestatie van paralytic ziekte. Net als bij MS, EAE is ook onder genetische controle in dat sommige muizenstammen zijn vatbaar voor de ziekte van inductie, terwijl anderen zijn tegen. Gewoonlijk C57BL / 6 (H-2b) muizen geïmmuniseerd met myeline basisch eiwit (MBP) niet geraakte tekenen ontwikkelen. Dit is zeker niet ongevoeligheid te wijten zijn aan antigeen of antigeen verwerking presentatie van MBP, als een experimentele protocol beschreven werd gebruikt om ernstige EAE induceren C57BL / 6 muizen en andere bekende resistente muizenstammen. Bovendien was encefalitogene T celklonen uit C57BL / 6 en Balb / c muizen reactief MBP is succesvolledig geïsoleerd en gepropageerd. De experimentele protocol gaat met behulp van een mobiele adoptieve overdracht systeem waarin MBP-primer (200 ug / muis) C57BL / 6 donor lymfeklier cellen worden geïsoleerd en gekweekt gedurende vijf dagen met het antigeen aan het zwembad van MBP-specifieke T-cellen uit te breiden. Aan het einde van de kweekperiode worden 50000000 levensvatbare cellen overgebracht naar naïeve syngene afnemers de staartader. Ontvanger muizen dus normaal gesproken behandeld ontwikkelen geen EAE, dus opnieuw hun resistente status, en zij kunnen voor onbepaalde tijd normaal. Tien dagen na de cell transfer, zijn ontvangende muizen uitgedaagd met volledig Freund&#39;s adjuvans (CFA)-geëmulgeerde MBP in vier plaatsen in de flanken. Ernstige EAE begint in deze muizen de ontwikkeling van tien tot veertien dagen na challenge. De resultaten toonden aan dat de inductie van de ziekte was antigene specifiek uitdaging met irrelevante antigenen veroorzaakte geen klinische symptomen van de ziekte. Opmerkelijk is dat een titratie van het antigeen dosis gebruikt om detegen de ontvanger muizen toonde aan dat het kan vanaf 5 ^ g / muis. Bovendien is een kinetische studie van het tijdstip van een antigeen is gebleken dat uitdaging ziekte induceren effectief was al 5 dagen na een antigeen en zolang dan 445 dagen na antigeen. Deze gegevens sterk punt in de richting van de betrokkenheid van een &quot;lange duur&quot; T-cel populatie in het handhaven van niet-reageren. De betrokkenheid van regulatoire T-cellen (Tregs) in dit systeem is niet gedefinieerd.

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een inflammatoire ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en is gebruikt als diermodel voor ...

Het algemene doel van deze procedure is om EAE consistent en eenvoudig op te wekken in elke muizenstam, inclusief stammen waarvan bekend is dat ze resistent zijn tegen de inductie van EAE. Dit wordt bereikt door eerst donor-muizen te immuniseren met myelinespecifieke eiwitten of peptideantigenen, geëmulgeerd in complete Freunds-adjuvans. 10 dagen later worden de lymfeklieren van de donor-muizen geïsoleerd en worden de lymfekliercellen in vitro opnieuw gestimuleerd door ze gedurende vier tot vijf dagen te kweken met hetzelfde antigeen.De cellen worden vervolgens adoptief overgedragen naar naïeve recipientmuizen. Gevoelige muizenstammen zullen binnen acht tot 14 dagen EAE ontwikkelen om EAE in een resistente stam te triggeren. 14 dagen na de adoptieve overdracht werden de recipientmuizen vervolgens geïmmuniseerd met antigeen in CFA.Met deze methode kan EAE worden geïnduceerd in resistente muizenstammen. Het belangrijkste voordeel van het protocol voor adaptieve overdracht en challenge voor het induceren van EAE is dat het een betrouwbare inductie van de ziekte mogelijk maakt. Zelden zien we minder dan 100% klinische ziekte.We kunnen het protocol aanpassen voor het induceren van de ziekte en voor vatbare muizenstammen, maar belangrijker is dat we dit protocol kunnen gebruiken om EAE te induceren in veel muizenstammen die voorheen als resistent voor de ziekte werden beschouwd. Demonstratie van de procedures. Vandaag is onze leidende onderzoeksmedewerker, cha ching.Begin met het bereiden van een oplossing van MBP van 2 mg/mL in PBS. Gebruik een glazen spuit met luer-lock om 100 µL antigeenoplossing per te immuniseren muis op te zuigen. Verzamel met een aparte spuit een gelijk volume compleet Freud's adjuvans H 37 ra. Verbind vervolgens de twee spuiten met een driewegkraan en beweeg de zuigers heen en weer om het antigeen en het adjuvans te mengen totdat er een emulsie is gevormd. Om te controleren of dit het geval is, brengt u de oplossing over naar één van de spuiten en koppelt u de lege spuit los.Trek de zuiger van de lege spuiten iets naar achteren en laat vervolgens een druppel van het resterende mengsel vallen in een bekerglas met schoon water op kamertemperatuur. Als de druppel verspreidt, sluit dan de spuiten opnieuw aan en meng verder. Herhaal de test als de druppel intact blijft en er een emulsie is gevormd om de emulsie op te vangen.Voor immunisatie. Verbind een plastic spuit van 1 mL met de glazen spuit waarvan de zuiger is verwijderd. Breng de oplossing voorzichtig over naar de plastic spuit en vul deze tot aan de rand.Plaats vervolgens de plastic zuiger en druk wat emulsie uit zodat er precies 1,2 milliliters overblijft. Er mogen geen luchtbellen in de spuit zitten. Indien deze procedure correct wordt uitgevoerd.Koppel de plastic spuit los. Voorzie deze van een naald met een gauge van 26 en vul het dode volume van de naald door de zuiger tot de markering van één milliliter in te drukken. Fixeer de muis stevig en houd de staart tussen de ringvinger en de pink naar achteren, zodat de thorax en het abdomen gemakkelijk toegankelijk zijn. Subcutaan.Injecteer 50 µL emulsie in de thorax vlak boven de rechteroksel. Als de injectie correct is uitgevoerd, zal er een kleine witte uitstulping zichtbaar zijn op de injectieplaats. Herhaal de procedure boven de linkeroksel, laat vervolgens de staart los en pak de rechtervoet vast, zodat de rechterflank van de muis wordt blootgesteld.Injecteer 50 µL van de oplossing vlak onder de ribbenkast. Laat de rechtervoet los. Draai de muis de andere kant op en herhaal de injectie aan de linkerzijde.Zeven tot 10 dagen na de immunisatie. Win de lymfeklieren uit de geëuthanaseerde dieren. Plaats de muis eerst op de rug met de ledematen uitgestrekt en met spelden vastgezet op de dissectieplank.Sproei de muis in met ethanol. Maak vervolgens met steriele instrumenten een longitudinale incisie in de huid van de muis, van de onderbuik tot aan de kin.Maak een volgende incisie vanaf de buik naar beneden over één poot. Doe vervolgens hetzelfde bij de andere poot. Pel de huid van de muis af en zet deze vast op het dissectiebord.Snijd ook de huid langs de vier ledematen door. Pel vervolgens het bovenste deel van de huidflappen af en zet deze aan beide zijden vast met spelden; de inguinale en axillaire lymfeklieren, die zich normaal gesproken dicht bij de lies of de oksels bevinden, moeten zichtbaar zijn als kleine ondoorzichtige massa's direct onder de huid. Gebruik twee fijne pincetten om voorzichtig het bindweefsel boven de eerste lymfeklier te verwijderen.Zorg ervoor dat de bloedvaten tijdens dit proces niet worden beschadigd. Zodra het bindweefsel is verwijderd, plaatst u één pincet onder de lymfeklier en trekt u deze weg van het lichaam. Breng de lymfeklier over naar een Petri-schaal van 35 millimeter met steriele PBS en oogst de overige drie lymfeklieren op dezelfde wijze.Zodra alle lymfeklieren zijn geoogst, wordt de petrischaal overgebracht naar een biologische veiligheidskabinet. Homogeniseer de lymfeklieren met de achterkant van een steriele spuitzuiger om de cellen vrij te maken. Filter de suspensie vervolgens door een nylon gaas in een conische buis om het debris te verwijderen.Vul het volume vervolgens aan tot 50 milliliters met steriele PBS en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen na centrifugatie in een klein volume voorverwarm cellengroei-medium en tel de levensvatbare cellen. Stel de concentratie in op vier keer 10 to the six cellen per milliliter.Zaai vervolgens de cellen uit in een 24-wells plaat met twee milliliters per well. Voeg MVP-antigeen toe aan elke well om een eindconcentratie van 100 micrograms per milliliter te verkrijgen. Zodra het antigeen is toegevoegd.Incubeer de cellen gedurende vijf dagen bij 37 °C. Zodra de cellen opnieuw zijn gestimuleerd, worden ze geoogst door voorzichtig op en neer te pipetteren en vervolgens overgebracht naar een conische buis van 50 mL. Centrifugeer de cellen 10 minuten bij 1000 RPM en resuspendeer het pellet in een klein volume steriele PBS.Tel vervolgens de cellen en pas de concentratie levensvatbare cellen aan naar 2,5 × 10⁸ cellen per milliliter met PBS. Trek de cellen op in een spuit en voorzie deze van een naald met maat 26 om de adoptieve transfer uit te voeren. Injecteer 0,2 milliliter cellen intraveneus in de staart van elke muis om de resistente muizen twee weken na de adoptieve transfer te challengen.Injecteer de dieren met 200 micrograms antigeen in een volume van 200 microliters emulsie op dezelfde wijze als de immunisatie van de donor-muizen is uitgevoerd. Zeven tot 10 dagen na de challenge zal er een paralytische ziekte ontstaan waarvan de progressie gemonitord kan worden. De ziekte begint met zwakte in de staart.Wanneer de staart slap is, wordt de ziekte geclassificeerd als graad één. Graad twee is wanneer de muis verlamming in één achterpoot ontwikkelt, en graad drie wanneer beide achterpoten verlamd zijn. Graad vier is wanneer beide voorpoten verlamd zijn.Graad vijf: de muis is minder mobiel. En graad zes: de muis is dood. Zoals hier wordt getoond, zullen muizen zeven tot 14 dagen na de challenge een monofasische paralytische ziekte ontwikkelen, die kan worden gescoord met behulp van de klassieke EAE-criteria.Hoewel de muizen kunnen herstellen, zullen ze niet spontaan terugvallen. De inductie van de ziekte vereist een antigeenspecifieke challenge. Een challenge met enkel CFA of een irrelevant antigeen slaagt er niet in om de ziekte op te wekken.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in de methode van adoptieve transfer en challenge voor het induceren van EAE. Door de adoptieve transfer van antigeenspecifieke lymfeknoopcellen te combineren met een stimulerende antigenische challenge, kan EAE eenvoudig worden geïnduceerd in elke muizenstam. Deze methode stelt ons in staat om de resistentiemechanismen te overwinnen die inherent zijn aan sommige muizenstammen, waardoor de studie naar ziekteresistentie mogelijk wordt gemaakt.Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om elk auto-immuunziekteproces te bestuderen.

overcoming-unresponsiveness-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer hoe u experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) induceert in resistente muizenstammen via adoptieve overdracht van lymfekliercellen en antigeen challenge. Deze methode maakt betrouwbaar onderzoek naar auto-immuunziekten mogelijk.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge (Video) | JoVE Journal

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Meer video's verkennen