Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Het algemene doel van deze procedure is om EAE consistent en eenvoudig op te wekken in elke muizenstam, inclusief stammen waarvan bekend is dat ze resistent zijn tegen de inductie van EAE. Dit wordt bereikt door eerst donor-muizen te immuniseren met myelinespecifieke eiwitten of peptideantigenen, geëmulgeerd in complete Freunds-adjuvans. 10 dagen later worden de lymfeklieren van de donor-muizen geïsoleerd en worden de lymfekliercellen in vitro opnieuw gestimuleerd door ze gedurende vier tot vijf dagen te kweken met hetzelfde antigeen.

De cellen worden vervolgens adoptief overgedragen naar naïeve recipientmuizen. Gevoelige muizenstammen zullen binnen acht tot 14 dagen EAE ontwikkelen om EAE in een resistente stam te triggeren. 14 dagen na de adoptieve overdracht werden de recipientmuizen vervolgens geïmmuniseerd met antigeen in CFA.

Met deze methode kan EAE worden geïnduceerd in resistente muizenstammen. Het belangrijkste voordeel van het protocol voor adaptieve overdracht en challenge voor het induceren van EAE is dat het een betrouwbare inductie van de ziekte mogelijk maakt. Zelden zien we minder dan 100% klinische ziekte.

We kunnen het protocol aanpassen voor het induceren van de ziekte en voor vatbare muizenstammen, maar belangrijker is dat we dit protocol kunnen gebruiken om EAE te induceren in veel muizenstammen die voorheen als resistent voor de ziekte werden beschouwd. Demonstratie van de procedures. Vandaag is onze leidende onderzoeksmedewerker, cha ching.

Begin met het bereiden van een oplossing van MBP van 2 mg/mL in PBS. Gebruik een glazen spuit met luer-lock om 100 µL antigeenoplossing per te immuniseren muis op te zuigen.

Verzamel met een aparte spuit een gelijk volume compleet Freud's adjuvans H 37 ra. Verbind vervolgens de twee spuiten met een driewegkraan en beweeg de zuigers heen en weer om het antigeen en het adjuvans te mengen totdat er een emulsie is gevormd. Om te controleren of dit het geval is, brengt u de oplossing over naar één van de spuiten en koppelt u de lege spuit los.

Trek de zuiger van de lege spuiten iets naar achteren en laat vervolgens een druppel van het resterende mengsel vallen in een bekerglas met schoon water op kamertemperatuur. Als de druppel verspreidt, sluit dan de spuiten opnieuw aan en meng verder. Herhaal de test als de druppel intact blijft en er een emulsie is gevormd om de emulsie op te vangen.

Voor immunisatie. Verbind een plastic spuit van 1 mL met de glazen spuit waarvan de zuiger is verwijderd. Breng de oplossing voorzichtig over naar de plastic spuit en vul deze tot aan de rand.

Plaats vervolgens de plastic zuiger en druk wat emulsie uit zodat er precies 1,2 milliliters overblijft. Er mogen geen luchtbellen in de spuit zitten. Indien deze procedure correct wordt uitgevoerd.

Koppel de plastic spuit los. Voorzie deze van een naald met een gauge van 26 en vul het dode volume van de naald door de zuiger tot de markering van één milliliter in te drukken. Fixeer de muis stevig en houd de staart tussen de ringvinger en de pink naar achteren, zodat de thorax en het abdomen gemakkelijk toegankelijk zijn. Subcutaan.

Injecteer 50 µL emulsie in de thorax vlak boven de rechteroksel. Als de injectie correct is uitgevoerd, zal er een kleine witte uitstulping zichtbaar zijn op de injectieplaats. Herhaal de procedure boven de linkeroksel, laat vervolgens de staart los en pak de rechtervoet vast, zodat de rechterflank van de muis wordt blootgesteld.

Injecteer 50 µL van de oplossing vlak onder de ribbenkast. Laat de rechtervoet los. Draai de muis de andere kant op en herhaal de injectie aan de linkerzijde.

Zeven tot 10 dagen na de immunisatie. Win de lymfeklieren uit de geëuthanaseerde dieren. Plaats de muis eerst op de rug met de ledematen uitgestrekt en met spelden vastgezet op de dissectieplank.

Sproei de muis in met ethanol. Maak vervolgens met steriele instrumenten een longitudinale incisie in de huid van de muis, van de onderbuik tot aan de kin.

Maak een volgende incisie vanaf de buik naar beneden over één poot. Doe vervolgens hetzelfde bij de andere poot. Pel de huid van de muis af en zet deze vast op het dissectiebord.

Snijd ook de huid langs de vier ledematen door. Pel vervolgens het bovenste deel van de huidflappen af en zet deze aan beide zijden vast met spelden; de inguinale en axillaire lymfeklieren, die zich normaal gesproken dicht bij de lies of de oksels bevinden, moeten zichtbaar zijn als kleine ondoorzichtige massa's direct onder de huid. Gebruik twee fijne pincetten om voorzichtig het bindweefsel boven de eerste lymfeklier te verwijderen.

Zorg ervoor dat de bloedvaten tijdens dit proces niet worden beschadigd. Zodra het bindweefsel is verwijderd, plaatst u één pincet onder de lymfeklier en trekt u deze weg van het lichaam. Breng de lymfeklier over naar een Petri-schaal van 35 millimeter met steriele PBS en oogst de overige drie lymfeklieren op dezelfde wijze.

Zodra alle lymfeklieren zijn geoogst, wordt de petrischaal overgebracht naar een biologische veiligheidskabinet. Homogeniseer de lymfeklieren met de achterkant van een steriele spuitzuiger om de cellen vrij te maken. Filter de suspensie vervolgens door een nylon gaas in een conische buis om het debris te verwijderen.

Vul het volume vervolgens aan tot 50 milliliters met steriele PBS en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen na centrifugatie in een klein volume voorverwarm cellengroei-medium en tel de levensvatbare cellen. Stel de concentratie in op vier keer 10 to the six cellen per milliliter.

Zaai vervolgens de cellen uit in een 24-wells plaat met twee milliliters per well. Voeg MVP-antigeen toe aan elke well om een eindconcentratie van 100 micrograms per milliliter te verkrijgen. Zodra het antigeen is toegevoegd.

Incubeer de cellen gedurende vijf dagen bij 37 °C. Zodra de cellen opnieuw zijn gestimuleerd, worden ze geoogst door voorzichtig op en neer te pipetteren en vervolgens overgebracht naar een conische buis van 50 mL. Centrifugeer de cellen 10 minuten bij 1000 RPM en resuspendeer het pellet in een klein volume steriele PBS.

Tel vervolgens de cellen en pas de concentratie levensvatbare cellen aan naar 2,5 × 10⁸ cellen per milliliter met PBS. Trek de cellen op in een spuit en voorzie deze van een naald met maat 26 om de adoptieve transfer uit te voeren. Injecteer 0,2 milliliter cellen intraveneus in de staart van elke muis om de resistente muizen twee weken na de adoptieve transfer te challengen.

Injecteer de dieren met 200 micrograms antigeen in een volume van 200 microliters emulsie op dezelfde wijze als de immunisatie van de donor-muizen is uitgevoerd. Zeven tot 10 dagen na de challenge zal er een paralytische ziekte ontstaan waarvan de progressie gemonitord kan worden. De ziekte begint met zwakte in de staart.

Wanneer de staart slap is, wordt de ziekte geclassificeerd als graad één. Graad twee is wanneer de muis verlamming in één achterpoot ontwikkelt, en graad drie wanneer beide achterpoten verlamd zijn. Graad vier is wanneer beide voorpoten verlamd zijn.

Graad vijf: de muis is minder mobiel. En graad zes: de muis is dood. Zoals hier wordt getoond, zullen muizen zeven tot 14 dagen na de challenge een monofasische paralytische ziekte ontwikkelen, die kan worden gescoord met behulp van de klassieke EAE-criteria.

Hoewel de muizen kunnen herstellen, zullen ze niet spontaan terugvallen. De inductie van de ziekte vereist een antigeenspecifieke challenge. Een challenge met enkel CFA of een irrelevant antigeen slaagt er niet in om de ziekte op te wekken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in de methode van adoptieve transfer en challenge voor het induceren van EAE. Door de adoptieve transfer van antigeenspecifieke lymfeknoopcellen te combineren met een stimulerende antigenische challenge, kan EAE eenvoudig worden geïnduceerd in elke muizenstam. Deze methode stelt ons in staat om de resistentiemechanismen te overwinnen die inherent zijn aan sommige muizenstammen, waardoor de studie naar ziekteresistentie mogelijk wordt gemaakt.

Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om elk auto-immuunziekteproces te bestuderen.