Name: Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Leer een fibroblasten-explantcultuurprotocol voor huidbiopsies om primaire humane fibroblasten te verkrijgen. Deze methode levert 15-20 miljoen cellen op bij lage passage binnen 4-8 weken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM, TR1-01246) en Parkinson Alliance.

De huid punch biopsie verkregen met behulp van standaard procedure 3 (bijvoorbeeld verkregen met 4mm ronde Visipunch instrument) moeten in volledige DMEM 20% FBS media worden bewaard op ijs. Nadat het monster is aangekomen in het laboratorium verwerken biopsie zo spoedig mogelijk. 1. Voorbereiding van de huid Punch biopsie STEPS 1,1-1,3 IS BINNEN EEN bioveiligheid kast TE VOEREN <ol><li> Bereid vooraf Voeg 1 ml van 0.1% gelatine aan elk putje van een 6-wells plaat. Stel de plaat opzij voor 30-60 minuten. Zuig het gelatine-oplossing en voeg 800 ul compleet DMEM/20% FBS medium in elk putje. Ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak van de put is bedekt met media. </li><li> Keer de deksel van een steriele 10 cm weefselkweek schotel en voeg 1,5 ml DMEM / 20% FBS media naar het midden van het deksel en verspreid de media druppel met de punt van de serologische pipet. </li><li> Met behulp van een steriele pincet, plaats tHij huidbiopsie stuk in de media op de schotel. </li></ol> 2. Dissectie van de huid Punch biopsie STEPS 9 2,1-2,2 IS BINNEN EEN HORIZONTALE laminar flow HOOD TE VOEREN <ol><li> Plaats het onderste gedeelte van 10 cm schotel op omgekeerde deksel en breng de huidbiopsie de stereomicroscoop in de laminaire stroming kap. </li><li> Ontleden van een 4-mm rond huidbiopsie in 12-15 gelijke grootte stukken met scherpe randen door te snijden stukken in gelijke helften met een scalpel om de biopsie op zijn plaats houden en de tweede scalpel te snijden met een rollende beweging in een richting. Stukken met rafelige randen bijdragen aan een slechte hechting / cel uitgroei. </li></ol> 3. Overdracht van Ontleed huidbiopsie Pieces in weefselkweekplaten STEPS 3,1-3,6 IS BINNEN EEN bioveiligheid kast TE VOEREN <ol><li> Plaats het onderste gedeelte van de 10 cm weefselkweekschaalop de top van de omgekeerde deksel, en de overdracht schotel terug in de bioveiligheid kast. </li><li> Met een puntige tang, plaats 2-3 biopsie stukken in elk putje van de bereide 6-wells plaat met 800 ul en niet op droog putjes. Gebruik tikken of schuivende beweging te krijgen van de stukken te hechten aan de bodem van de put. Een scalpel is nuttig om eventuele biopsie stukken uit de tang te verwijderen. </li><li> Plaats de 6-well plaat in de 37 ° C incubator. Monitor dagelijks of er een film van media-coating de bodem van het putje van de eerste week, voeg -200 pl elke 2 dagen elk afgedampt media vervangen. </li><li> Na een week, verhogen bedrag van media 2 ml compleet DMEM/20% FBS en media elke verandering 2-3 dagen. </li><li> Zodra fibroblasten confluent in elk putje tot het punt waar de fibroblasten bereiken van de randen van de put, en trypsinize passage 6-well plaat in 2X T75 kolven (passage 1). De stukken weefsel kunnen worden overgedragen ook. Ze zullen niet hechten en worden gewassen out tijdens de volgende media veranderen. </li><li> Zodra fibroblasten zijn samenvloeiing, overbrengen naar 3X T175 kolven (passage 2), bevriezing van de volledige DMEM media plus 10% DMSO bij 1x10 6 cellen / ml per flacon. </li></ol> 4. Karakterisering van de fibroblasten door Immunokleuring <ol><li> Cultuur fibroblasten in 8 goed kamer dia gecoat met gelatine. </li><li> Wanneer cellen bij 80% confluentie, zuig het medium uit elk putje. </li><li> Fix cellen in 4% paraformaldehyde gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de putjes 3 keer met 1X PBS. </li><li> Permeabel de cellen met 150 ul 0,3% Triton X-100 (in PBS) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was de putjes 3 keer met 1X PBS. </li><li> Voeg 200 gl blokkerende oplossing (PBS + 5% normaal geit serum (Vector, S-1000)) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Bereid een 1:250 verdunning van anti-SERPHIN-1 (anti-konijn, mAB, Sigma, S5950-200 ul) in blokkeeroplossing. </li><li> EenSpirate de blockingbuffer en voeg 150 ul van de verdunning van 1:250 van AntiSERPINH-1. Incubeer 1-2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was de putjes 3 keer met 1X PBS. </li><li> Bereid een 1:200 geit-anti-konijn monoklonaal antilichaam (Alexa Fluor geit anti-konijn IgG (H + L), Invitrogen, A11008) in blockingbuffer. </li><li> Voeg 150 ul van 1:200 geit-anti-konijn monoklonaal antilichaam aan elk putje. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Wassen wells eenmaal met 1 x PBS. </li><li> Zuig het PBS, en til de kamers af om alleen de dia te onthullen. </li><li> Monteer de dia met een 2-3 druppels montage medium met DAPI (Vector, H-1200). </li><li> Analyseer de dia onder een fluorescentiemicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met dit protocol, kan relatief zuivere culturen van de huid fibroblasten worden verkregen. De fibroblasten hebben karakteristieke morfologische kenmerken van langwerpige, spindel-achtige cellichamen, rond tot ovaal celkernen, en de fibroblasten groeien uitgelijnd en in bundels bij samenvloeiing. De media ondersteunt de groei van fibroblasten terwijl andere celpopulaties zoals keratinocyten nodig extra toeslagen en groeifactoren, of zijn mitotically minder actief, dit zorgt voor relatief zuiver fibroblastculture...

<table><tbody><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm weefselkweek-petrischaal</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6-wells weefkweekplaat </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wegwerpscalpels van roestvrij staal (2), mesje nr. 15, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>Steriele pincetten met scherpe punt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conische buizen</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2 mL serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-pipetten</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Houd er rekening mee dat u geen brontekst heeft verstrekt om te vertalen. Upload of plak de Engelse tekst van het JoVE-artikel, protocol of de trefwoordenlijst die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands, en ik zal de vertaling direct uitvoeren volgens uw strikte richtlijnen.&quot;&gt;&lt;sterk&gt;Tabel A. Tabel met specifieke reagentia en apparatuur.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM: hoge glucoseconcentratie</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% foetaal runderserum</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-glutamine</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM niet-essentiële aminozuren </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X penicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_stap&quot;&gt;&lt;sterk&gt;Tabel B. Reagentia.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

huid punch biopsie explantatiestatus cultuur voor afleiding van primaire humane fibroblasten

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Weefsels en cellijnen afgeleid van een individu met de ziekte zijn ideaal bronnen ziektegerelateerde cellulaire fenotypes bestuderen. Patiënten afkomstige fibroblasten in dit protocol zijn met succes gebruikt bij de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen tot modelziekte 1. Vroege passages van deze fibroblasten kunnen ook worden gebruikt voor cel-gebaseerde functionele assays voor specifieke biologische veranderingen, mechanismen 2 en volgende geneesmiddelen screeningsmethoden bestuderen. Het voordeel van het gepresenteerde protocol via enzymatische procedures zijn 1) de reproduceerbaarheid van de techniek van kleine hoeveelheden weefsel afkomstig van oudere patiënten, bijvoorbeeld patiënten die met de ziekte van Parkinson, 2) de technisch eenvoudige benadering via moeilijker methodologieën middels enzymatische behandelingen, en 3 ) de tijd houden: dit protocol duurt 15-20 minuten en kan direct na aankomst biopsie worden uitgevoerd. Enzymatische behandelingen kan tot 4 uur en hebben de problemen vanoverdigestion, vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende aanhechting van cellen wanneer ze niet goed behandeld. Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van een 4-mm menselijke huidbiopsie voor het afleiden van een fibroblast cultuur en heeft een zeer hoog slagingspercentage wat belangrijk is bij de behandeling van patiënten afkomstige weefselmonsters. In deze cultuur, keratinocyten migreren uit de biopsie weefsel binnen de eerste week na de bereiding. Fibroblasten weergegeven 7-10 dagen na de eerste uitloper van keratinocyten. DMEM hoge glucose media aangevuld met 20% FBS bevordert de groei van fibroblasten dan keratinocyten en fibroblasten zal de keratinocyten overwoekeren. Na 2 passages keratinocyten werden verdund uit wat resulteert in relatief homogene fibroblastculturen die de fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47) uitdrukt. Met deze aanpak kan 15-20000000 fibroblasten worden afgeleid in 4-8 weken voor mobiele bankieren. De huid dissectie duurt ongeveer 15-20 minuten, worden de cellen dan een keer per dag bewaaktonder de microscoop, en de media werden elke 2-3 dagen na hechting en uitgroei van cellen.

Keratinocyten groeien uit de biopsie stukken zo spoedig 48 uur na dissectie. Eerste fibroblasten uitgroei kan worden waargenomen ongeveer een week na verwerking. Zodra de putjes confluentie hebben bereikt, worden fibroblasten gepasseerd voor twee passages op drie 150 cm kolven (T150) te bereiken en de cellen worden ingevroren. We genereren deze werkwijze 15-20.000.000 cellen. De fibroblasten zijn positief voor anti-SERPINH1 (ook bekend als HSP-47) (figuur 1), die een collageen-specifieke moleculaire cha...

De fibroblast explantaatkweek protocol uit menselijke huid stansbiopsieën is een technisch robuuste en eenvoudige manier om huidcellen te leiden binnen 4-8 weken voor het bankwezen van ongeveer 15-20 miljoen cellen bij een lage passage nummer.

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Weefsels en cellijnen afgeleid van een persoon met een ziekte zijn ideale bronnen om ziektegerelateerde cellulaire fenotypes te bestuderen. Patiënt-afgeleide fibroblasten ...

Hallo. Welkom bij de video-tutorial over het verwerken van huidbiopten. Begin met het plaatsen van de benodigde materialen in de kweekkast. Alle objecten die de kast ingaan, moeten worden besproeid met 70% ethanol en worden afgeveegd. Label een plaat met het PI-nummer, de datum, initialen en het type medium. Voeg 1 ml 0,1% gelatine toe aan elke wand en draai de plaat rond om ervoor te zorgen dat de bodem volledig met gelatine is gecoat.Laat de plaat een uur rusten voor gebruik. De eerste stap is het overbrengen van het biopsaat van de buis naar de snijschaal. Een snijschaal is het deksel van een Petri-schaal van 10 centimeter waarop het biopsaat zal worden gedissecteerd.Voeg 1,5 milliliter DMEM 20%FBS toe aan het midden van de snijschaal. Verdeel het medium vanuit het midden. Hier is het huidbiopsaat te zien.De volgende stap is om het biopt vanuit de buis naar het midden van de snijschaal over te brengen. Plaats het stukje huidbiopt met een steriele pincet in het midden. Wees hierbij voorzichtig; het is essentieel om de steriliteit te bewaren.Dek het snijschaatje af en plaats het onder de dissectiemicroscoop in de laminaire flowkast. De volgende stap is om de biopsie te dissecteren

skin-punch-biopsy-explant-culture-for-derivation-primary-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.

Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het vaststellen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.

Isolatie, cultuur en karakterisering van primaire dermale fibroblasten uit menselijk keloïde weefsel

Dit manuscript beschrijft een tweestapsprotocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten via episomale herprogrammering in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en daaropvolgende differentiatie in podocyten.

Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Leer een fibroblasten-explantcultuurprotocol voor huidbiopsies om primaire humane fibroblasten te verkrijgen. Deze methode levert 15-20 miljoen cellen op bij lage passage binnen 4-8 weken.

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Meer video's verkennen