Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor

Hoi, ik ben Shamal, postdoctoral fellow bij TUR Kika aan het National Center for Biological Sciences in India. In deze video ga ik laten zien hoe u een bio-micro-apparaat kunt vervaardigen met behulp van soft-lithografie technieken in een reguliere laboratoriumomgeving. Ik ga deze apparaten gebruiken voor cellulaire en subcellulaire beeldvorming met een hoge resolutie van genetische modelorganismen.

Het huidige protocol stelt onderzoekers in staat om deze time-lapse imaging uit te voeren in intacte organismen zonder gebruik van anesthetica. Laten we beginnen. We hebben een eenvoudig microfonisch apparaat ontwikkeld voor anesthetica-vrije in vivo imaging van genetische modelorganismen zoals C. elegans, intacte Drosophila en zebravissen.

In deze studie demonstreren we een membraangebaseerd apparaat voor heldere immobilisatie, gefabriceerd met behulp van zachte gietvorming van PDMS. Om een enkel organisme te immobiliseren, lokaliseren we een individueel dier onder een stereomicroscoop en pakken we het dier op met een kleine druppel bufferoplossing met een micropipet, waarna we het individuele dier in het stroomkanaal plaatsen en immobiliseren onder het PTMS-membraan. Hierbij wordt gebruikgemaakt van een aangesloten stikstofgas onder druk via een driewegkogelkraan.

Ontwerp de micro-fluïdische structuren met behulp van CAD-software. Reinig silicium wafers van twee centimeter bij twee centimeter in 20% KH gedurende één minuut en spoel na met gedestilleerd water. Blaas de stukken droog met stikstofgas en dehydrateer ze bij 120 Celsius gedurende vier uur.

Spincoat hexa metal op siliciumstukken bij 500 RPM gedurende vijf seconden en bij 3000 RPM gedurende 30 seconden. Spincoat SU 8 2 0 2 5 op siliciumwafers bij 500 RPM gedurende vijf seconden en bij 2000 RPM gedurende 30 seconden. Voer een soft bake uit op de gecoate siliciumstukken bij 65 °C gedurende één minuut en bij 95 °C gedurende 10 minuten.

Belicht de gebakken SU-8 gecoate wafers met een UV-lamp van 200 watt door het fotomasker voor ontwerp één en ontwerp twee voor respectievelijk een stroomlaag en een controllaag. Voer een post-bake uit op de wafers bij 65 °C gedurende één minuut en bij 95 °C gedurende 10 minuten. Ontwikkel de stukken met SUA-ontwikkelaar gedurende 20 minuten.

Coat de onderdelen met trichloorperfluorcyclohexaan-damp in een desiccator gedurende twee uur. Meng de polydyl xox-basis en het hardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1. Ontgas het mengsel om alle luchtbellen die tijdens het mengen zijn ontstaan te verwijderen.

Giet een 5 mm dik PDMS-mengsel over siliciumwafers met het SC-gewichtspatroon van het ontwerp. Doe dit voorzichtig om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Spincoat een uniforme laag PDMS op de siliciumwafers met het ontwerp voor de stroomlaag bij 500 RPM gedurende vijf seconden en vervolgens bij 1500 RPM gedurende 30 seconden.

Bak beide stukken van ontwerp één en ontwerp twee die PDMS bevatten gedurende zes uur bij 50 °C. Snijd het PDMS-stuk uit het siliciumsubstraat met behulp van een sub-mes dat SCH-patroon twee bevat. Pons een klein gat bovenop het reservoir dat de hoofdval in de PDMS-mal verbindt.

Gebruik een naald met de grootste diameter of een 18 gauge naald. Stel het onderste oppervlak van de controllaag en het bovenste oppervlak van de stroomlaag twee minuten lang bloot aan 18 watt luchtplasma. Plaats de twee plasmabehandelde oppervlakken tegen elkaar met lichte druk en bak ze twee uur lang bij 50 °C.

Snijd de gebonden apparaten uit het siliciumsubstraat met SUH-ontwerp één en pons toegangsgaten bij de inlaat- en uitlaatreservoirs van het stroomkanaal. Leg de onderste PDMS-zijde van het apparaat en een schone glazen afdekplaat bloot. Behandel deze gedurende twee minuten met luchtplasma bij 18 volt.

Plaats de twee plasmabehandelde oppervlakken met lichte druk op elkaar en bak ze twee uur lang bij 50 °C. Bewaar het apparaat in een schone omgeving voor toekomstig gebruik. Na de fabricage van de apparaten laat ik u zien hoe u een PDMS-membraan gebruikt om C. elegans in het apparaat te immobiliseren. Verbind één uiteinde van een microflex-buisje met een drukregelaar voor stikstofgas en het andere uiteinde van het hoofdreservoir van de val via een naald van 18 gauge.

Een driewegkraan in het midden van de slangverbinding maakt het mogelijk om de druk op het membraan aan te brengen of op te heffen. Vul de slang en de verbinding met het PDMS-apparaat met een kolom gedestilleerd water van 10 centimeter voordat deze wordt aangesloten op het reservoir van de hoofdvang. Draai de klep van de stikstoftoevoer open tot een druk van protein PSI en observeer bij lage vergroting met een omgekeerde microscoop hoe het membraan van de hoofdvang afbuigt in de richting van het stroomkanaal.

Draai de driewegkraan vervolgens en breng het membraan in de rustpositie. Vul het stroomkanaal gedurende 10 minuten met buffer. Lokaliseer vóór een experiment een enkel exemplaar van sea elegance met behulp van een microscoop met lage vergroting.

Pak een enkel dier op met een klein volume bufferoplossing in een microtip. Duw het individuele dier door de inlaat van het stroomkanaal. Pas de pipetteerdruk aan om het individuele dier onder de hoofdvangst te positioneren.

Verhoog de druk van het PDMS-membraan langzaam om het dier tegen de rand van het kanaal te positioneren en immobiliseer het met een druk van 7 tot 14 PSI. Gebruik een omgekeerde microscoop met de gewenste instelling voor hoge-resolutie brightfield- of fluorescentie-imaging. Leg enkele of tijdgestuurde fluorescentiebeelden vast met een vooraf gedefinieerde frame-rate.

Laat de druk van de val ontsnappen en observeer het locomotiegedrag van het dier. Spoel het dier gedurende vijf minuten bij lage vergroting uit en voeg een nieuw dier toe. Om de DevOp-stappen te herhalen, gebruikt u de afgesneden micropipetpunt om een enkele oph-larve op te pakken en deze in het grotere micro-ferrische apparaat te plaatsen.

Duw de enkele larve door de inlaat van het stroomkanaal. Verhoog langzaam de druk van het PDMS-membraan en immobiliseer deze met zeven ESI-druk. Gebruik een omgekeerde microscoop voor fluorescentie-imaging bij lage vergroting en leg time-lapse fluorescentiebeelden vast voor transportimaging.

Laat de druk van de val los en monitor het locomotiegedrag van de larve bij lage vergroting. Gebruik hetzelfde apparaatprincipe om zebrafish-embryo's 30 uur na bevruchting te immobiliseren en time-lapse beelden hiervan vast te leggen. Val hart.

Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om soortgelijke micro-apparaten in uw eigen laboratorium te vervaardigen en deze succesvol te gebruiken voor het immobiliseren van organismen voor experimenten met een hoge resolutie. Bedankt voor het bekijken van de video en veel succes met uw experimenten.