Name: Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor In vivo Beeldvorming van C. elegans, Drosophila En zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer microfluïdische apparaten fabriceren voor anestheticavrije in vivo beeldvorming van C. elegans, Drosophila en zebravis. Deze methode maakt tijdreeksimaging van biologische processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr Krishanu Ray voor Drosophila voorraden, Tarjani Agarwal voor het handhaven van een Drosophila kooi, Peter Juo voor nuIs25 en CGC voor C. elegans stammen. SPK gemaakt jsIs609 in het laboratorium van Michael Nonet&#39;s. Wij danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) voor zijn hulp bij time-lapse imaging van mitochondriën transport van jsIs609 dieren in microfluïdische apparaten. We zijn dankbaar voor Dr Vatsala Thirumalai en Surya Prakash voor het verstrekken van ons met zebravis embryo&#39;s. Wij danken dr. Krishna en CIFF bij de NCB&#39;s voor het gebruik van de draaiende schijf confocale microscoop wordt ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie-Centrum voor Nanotechnologie (nr. SR/55/NM-36-2005). We danken ook Kaustubh Rau, V. Venkatraman en Chetana Sachidanand voor discussies. Dit werk werd gefinancierd door de DBT post-doctorale beurs (SM), DST versnelde regeling (SM) en een DBT subsidie ​​(SPK). SA werd ondersteund door DST en CSIR subsidies aan SPK.

1. SU8 Master Fabrication <ol><li> Ontwerp de microfluïdische structuren met behulp van Clewin software en af ​​te drukken met behulp van 65.024 DPI-laser plotter met minimale feature size van 8 micrometer op de printplaat film. </li><li> Reinig 2 cm x 2 cm silicium wafers met native oxide in 20% KOH gedurende 1 min en spoel in gedeïoniseerd water, een wafer elk van de stroming laag en de bijbehorende regellaag. </li><li> Föhnen de stukken met stikstofgas en op een hete plaat bij 120 ° C drogen gedurende 4 uur. Laat de stukken afkoelen tot kamertemperatuur alvorens de volgende stap. </li><li> Plaats silicium stukken een voor een op de spinner boorkop en schakel het vacuüm. Bedek de siliciumoppervlakken met ~ 20 pi hexamethyl-disilazaan (HMDS) en coat ze met een spinner SPIN150 bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 3000 rpm gedurende 30 sec. </li><li> Volledig te bedekken silicium wafers met ~ 1,5 ml SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) en coat wafers met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 sec. Deze draaiende protocol levert een fotoresist dikte van ~ 40 urn die geschikt is voor de controle en stroom lagen voor vroege larvale stadia van C. elegans. </li><li> Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 sec tot een dikte van fotoresist ~ 80 um dat geschikt is voor stroming laag fabricage is voor late larvale stadia van C. verkrijgen elegans, basale stroom laag voor Drosophila / zebravis larven en de bijbehorende controle lagen. </li><li> Plaats de siliconen stukken op hete plaat met de SU8 gecoate laag op de top. Zacht bakken de beklede stukken silicium bij 65 ° C gedurende 1 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Laat de stukken afkoelen tot kamertemperatuur alvorens de volgende stap. </li><li> Plaats de zachte gebakken silicium stukken op de blootstelling podium met SU8-2025 gecoate surgezicht op de bovenkant naar de UV lamp. Gebruik het fotomasker met design I (L1, Figuur 1B) en ontwerp II (L2, figuur 1B) voor de stroom laag en regellaag patroon respectievelijk vroege larvale stadia van C. elegans. Plaats het fotomasker bovenop de SU8 laag en het masker zorgen plat tegen de aangebrachte laag. Open het schuifje van de UV-lamp en bloot de soft-gebakken SU8 wafers tot 200 Watt UV lamp door de foto masker gedurende 15 sec. </li><li> Gebruik de foto masker met ontwerp I (L1, figuur 1B) en ontwerp II (L2, figuur 1B) op SU8-2050 gecoate stukken (bereid in stap 1.6) om de stroom laag en controle laag fabriceren voor late larvale stadia van C. elegans. Gebruik het fotomasker met het ontwerp I (L1, figuur 1C) en ontwerp II (L2, figuur 1C) voor de basale laag en stroom regellaag respectievelijk Drosophila / zebravis larven op wafers gecoat met SU8-2050 (bereid in stap 1.6). Maak de SU8 oppervlakken door de foto masker om de 200 Watt UV lamp gedurende 15 sec. </li><li> Plaats de belichte silicium stukken op een hete plaat met de beklede laag geplaatst. Plaats de wafers bakken bij 65 ° C gedurende 1 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Laat de stukken afkoelen voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Ontwikkelen van de stukken met de SU8 ontwikkeloplossing gedurende 20 minuten. Spoel de stukken in isopropylalcohol (IPA) en föhnen met behulp van stikstofgas. </li><li> Plaats de silicium stukken in een exsiccator met de SU8 patroon op de top. Coat de stukken met 50 pi tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaangas in een exsiccator gedurende 2 uur. </li></ol> Voorzorgsmaatregelen: Neem voorzorgsmaatregelen voor behandeling van chemicaliën tijdens KOH behandeling, fotolak coating en ontwikkelen. Silaan damp coating moet worden uitgevoerd in een exsiccator in een geventileerde ruimte. Bescherm SU8 weerstaan ​​van meer dan blootstelling aan licht. Gebruik beschermende brillen met een UV-light bron. 2. PDMS Mold Fabrication <ol><li> Bereid 10:01 PDMS door het combineren van 50 g Sylgard 184 base met 5 g uithardingsmiddel in een plastic beker. Handmatig Meng de inhoud voor ca. 3 min.. Degas het mengsel in een exsiccator tot alle luchtbellen gevormd tijdens het mengen te verwijderen. </li><li> Giet een 5 mm dikke PDMS mengsel over de silicium wafers met SU8 patroon van het ontwerp II, voor de controle laag, zachtjes om de vorming van luchtbellen te voorkomen. In het geval dat bellen worden gevormd tijdens het gieten, ontgas de PDMS op de SU8 patroon in laag vacuüm om alle bubbels weg te nemen. </li><li> Plaats de silicium wafers met SU8-2025 patroon van het ontwerp I, voor de stroom laag, op spinner boorkop en schakel de stofzuiger aan te houden. Bedek de wafers met ~ 1 ml van PDMS mix en bedek de wafers met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 1500 rpm gedurende 30 sec. </li><li> Coat ~ 1 ml PDMS mix op silicium wafers met 80 urn SU8-2050 patroon van ontwerp I (L1, figuur 1B), hetstroom laag voor de late larvale stadia van C. elegans met de spinner SPIN150 bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 1000 rpm gedurende 30 sec. Coat een dikke laag PDMS mix op de silicium stukken met SU8-2050 stromingspatroon laag ontwerp I (L1, figuur 1C) voor Drosophila / zebravis larven, met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 35 sec. </li><li> Bak PDMS gecoate silicium stukken van het ontwerp I en wafeltjes, met bijbehorende ontwerp II voor de controle laag met PDMS voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven in een hete luchtcirculatie oven bij 50 ° C gedurende 6 uur. </li><li> Knip de PDMS stuk van het silicium substraat dat de SU8 patroon II voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven met een scherp mes. Pons een gaatje van ~ 1 mm diameter bovenop het reservoir die de belangrijkste trap in het PDMS mal met een Harris puncher. </li><li> Plaats de geperforeerde PDMS blok (met de 40 urn dikke mal voor controllaag L2) op een plastic bakje met de gevormde kant van de laag naar boven. Plaats de PDMS gecoate silicium wafer met de 40 pm dik SU8 ontwerp heb ik op dezelfde lade, met de PDMS gecoate oppervlak naar boven. Plaats de lade in de kamer van plasma schoner en zet het vacuüm gedurende 2 minuten. Vervolgens zet de plasma stroom en laat de druk in de verbrandingskamer tot de kamer wordt licht roze van kleur. Expose beide oppervlakken tot 18 Watt lucht plasma onder laag vacuüm gedurende 2 minuten. </li><li> Plaats de geperforeerde PDMS blok verwijderd van de 80 pm dik SU8 meester bevattende patroon II voor late larvale stadia van C. elegans of Drosophila / zebravis larven op een plastic bakje, met de gevormde kant van de laag naar boven. Plaats de overeenkomstige gebakken PDMS laag gespincoat op de silicium wafer met 80 urn ontwerp I later C. elegans stadia of Drosophila / zebravis larven tegelijkertijd op hetzelfde lade met de platte PDMS gecoate surface naar boven. Gebruik hetzelfde protocol genoemde om ze bloot te stellen aan lucht plasma. </li><li> Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven met lichte druk en bakken in heteluchtconvectie oven bij 50 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Knip de gekoppelde apparaten uit het silicium substraat met SU8 ontwerp ik voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven. Punch toegangsgaten in de inlaat en uitlaat reservoirs van het stromingskanaal. </li><li> Plaats de gebonden PDMS mal op een plastic dienblad voor C. elegans, met de gevormde zijde van de stroom laag ontwerp naar boven. Schoon glas dekglaasje (22 X 22 mm, nr. 1 dikte) en plaats het op dezelfde plastic bakje. Schuif de lade met PDMS mal en glazen afdekplaat slip in de plasmakamer. Bloot onder PDMS oppervlak van het apparaat en glazen dekglas tot 18 Watt luchtplasma bij lage druk gedurende 2 minuten. Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken met genTLE druk en bakken in heteluchtconvectie oven bij 50 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Berg het apparaat op in een schone omgeving voor toekomstig gebruik. </li></ol> 3. Aanvullende stappen voor Drosophila / zebravis Device <ol><li> Bloot schoon glazen oppervlak van grootte 2 cm x 2 cm met 50 pi tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaangas in een exsiccator gedurende 2 uur. </li><li> Spin ~ 1 ml van 10:1 PDMS mengsel bereid in stap 2.1 op de gesilaniseerde glazen oppervlak met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 35 sec. Bak de PDMS gecoate glazen substraten in een hete luchtoven bij 50 ° C gedurende 6 uur met het beklede oppervlak naar boven. Laat de PDMS-laag afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat met de volgende stap. </li><li> Punch de aangebrachte laag met een op maat gemaakte scherpe metalen puncher in het midden van de PDMS, de PDMS spacer laag. De vorm van het metaal puncher vergelijkbaar is ontworpen om de stroom ontwerp voor Drosophila / zebravis (L1, Figuur 1C </strong&gt;). </li><li> Maak de PDMS spacer laag en de single-gebonden blok (stroom laag en controle laag, gemaakt in stap 2.9 voor Drosophila / zebravis larven) tot 18 Watt lucht plasma met behulp van plasma reiniger bij lage vacuüm. Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken en bakken in een hete luchtoven bij 50 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Snij de gebonden inrichting van het glas, punch toegangsgaten bij de inlaat en uitlaat reservoirs en binding aan een glazen dekglaasje (22 X 22 mm, dikte nr. 1) met een plasma reiniger zoals vermeld in stap 2.11. Dit zou een immobilisatie toestel de eerste instar larven Drosophila met een goothoogte van ~ 500 urn. Voor zebravis larven, dupliceer de PDMS spacer laag fabricageproces met een extra hechting stap. De dubbele laag PDMS-S produceert een goothoogte van 900 urn voor 30 HFP zebravis larven. </li></ol> Voorzorgsmaatregelen: Vermijd stofdeeltjes tijdens device fabricage. Twee plasma gereinigde oppervlaks moeten volledig stof vrij te zijn voor een goede hechting. De apparaten opslaan in een exsiccator in situaties waar een speciale clean room niet beschikbaar te minimaliseren ophoping van stofdeeltjes in apparaten. 4. Met behulp van PDMS Membraan <ol><li> Sluit een uiteinde van een micro-flex buis (binnendiameter ~ 1,6 mm, buitendiameter ~ 4,8 mm) een onder druk staande stikstof gas regulator en het andere uiteinde aan de belangrijkste trap reservoir door een 18 gauge naald (buitendiameter 1,25 mm ~) gelijmd aan de buis. Een 3-weg kraan in het midden van de buis-verbinding kan het lossen van de druk op het membraan. </li><li> Vul de buis verbonden met de PDMS apparaat met een 10 cm kolom gedestilleerd water alvorens het aan het reservoir van de belangrijkste val van een C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven apparaat. </li><li> Draai de klep van de toevoer van stikstof naar 14 psi lezen en het membraan van de belangrijkste trap afbuigen naar th bewakene stromingskanaal bij lage vergroting van een omgekeerde microscoop. Lengte van de waterkolom in de micro-flex buis samengedrukt wanneer de 3-weg kraan geopend. Randen van de afgebogen membraan zijn zichtbaar in doorvallend licht (Figuur 1I en 1J). Membraan vervorming veroorzaakt verplaatsing van stofdeeltjes / blaasjes onder de PDMS membraan en duwt deze het kanaal grenzen. </li><li> Wacht tot de vloeistof voorzijde vult de microchannel volledig zonder de ingesloten lucht. </li><li> Nadat de druk door de 3-wegkraan de membraan ontspannen in de ruststand. </li></ol> 5. Plaatsen van C. elegans, Drosophila en zebravis larven in het apparaat en immobiliseren ze onder de Flexibele PDMS membraan <ol><li> Vul het stromingskanaal met M9 buffer [3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O tot 1 L, steriliseren autoclaving] voor C. elegans 18 of 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4, H 2 O tot 1 L, steriliseren in autoclaaf] voor Drosophila / zebravis larven 19 gedurende 10 minuten voordat een experiment. </li><li> Zoek een C. elegans van de vereiste fase op een NGM plaat 18 (of eerste instar Drosophila larven en agar-agar ei plaat of handmatig dechorionated 30 hpf zebravis larven in vloeibaar medium 20) met behulp van een lage vergroting stereomicroscoop. Sla een dier met een kleine hoeveelheid bufferoplossing in een micro tip. Gebruik een micro tip met het einde gesneden om de grotere Drosophila of zebravis larven in buffer tegemoet te komen. </li><li> Duw de enkel organisme door het stroomkanaal inlaat. Stel de pipetteren druk op het individuele dier plaatsen onder de belangrijkste trap. </li><li> De druk van de PDMS membraan langzaam het dier tegen het kanaal positionerennel grens en immobiliseren met 14 psi druk C. elegans, Drosophila 7 psi voor en 3 psi zebravis larven. </li><li> Plaats de geïmmobiliseerde dier in het centrum van de microscopische gezichtsveld. Gebruik een omgekeerde microscoop op de gewenste instellingen voor hoge resolutie helderveld of fluorescentie beeldvorming. Acquire een-of time-lapse fluorescentie beelden op vooraf bepaalde frame rate. </li><li> Laat de val druk en toezicht op de motoriek van het dier gedurende 5-10 minuten bij een lage vergroting. </li><li> Spoel het dier en plaats een nieuwe dier aan de bovenstaande stappen te herhalen. </li><li> Was alle dieren uit het afval reservoir met behulp van gedestilleerd water toegepast met behulp van een spuit. Droog het kanaal door te drukken op lucht met behulp van een injectiespuit voor toekomstig hergebruik. </li></ol> Voorzorgsmaatregelen: Dieren die hogere pipetteren druk te stromen in het hoofdkanaal hebben de neiging om een slechte motoriek / gezondheid blijkt na de release van de val en moeten worden vermeden voor imaGing. Reinig de stromingskanaal voor spoor van buffer tot verstopping van het kanaal voorkomen kristallen. Als olie wordt gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming, Reinig de glazen dekglaasje kunnen goede signaal-ruisverhouding te behouden voor verdere experimenten.

<ol><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).</li>
<li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization%2C+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab Chip. 8, 653-656 (2008).</li>
<li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9, 151-157 (2009).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li>
<li>Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+currents+regulate+sensitivity+and+dynamic+range+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons.</a> Neuron. 20, 763-772 (1998).</li>
<li>Snow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95, 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).</li>
<li>Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+and+behavioral+effects+of+carbon+dioxide+on+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. The zebrafish book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+C.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).</li>
<li>Fatouros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tau+aggregation+in+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li>
<li>Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+axonal+kinesin-3+motor+for+fast+anterograde+vesicle+transport+that+facilitates+retrograde+transport+of+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).</li>
<li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).</li>
<li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li>
<li>Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+development+in+the+zebrafish.+I.+Myocardial+fate+map+and+heart+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation.</a> Development. 119, 31-40 (1993).</li>
<li>Hall, D. H., Hedgecock, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li>
<li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200(2010).</li>
<li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li>
<li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A.+Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

PDMS microfluïdische inrichtingen zijn optisch transparant kan daarom worden gebruikt voor hoge resolutie in vivo beeldvorming van elke doorzichtige / doorschijnende modelorganisme. Ons ontwerp is geschikt voor een sterke vergroting van spatio-temporele Beeldvorming van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen in intacte levende dieren. Microfabricage met behulp van zachte lithografie technieken maakt een eenvoudige manipulatie van het apparaat afmetingen voor verschillende maten van modelorganismen. Inricht...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Siliciumschijven </td><td> Universiteit wafer </td><td> 150 mm (100) Mech Grade SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb software </td><td> Versie 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Laser plotter </td><td> Fine Line Imaging </td><td> 65.024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Ontwikkelaar </td><td> Microchem </td><td> SU8 Developer </td><td></td></tr><tr><td> Silaan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> UV lamp </td><td> Erker </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel Light </td></tr><tr><td> Hete lucht oven </td><td> Ultra Instrumenten </td><td> Custom made </td><td> Op 50 ° C </td></tr><tr><td> Kookplaat </td><td> IKA Laboratory Equipment </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Plasma reiniger </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Spinner </td><td> Semiconductor Production Systems </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Glazen dekglas </td><td> Gold Seal </td><td> 22 X 22 mm, dikte nr. 1 </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {chaGAL4} / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebravis </td><td> Indische wild-type </td><td> Wildtype </td><td></td></tr><tr><td> Tygon slang </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro naald </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Gesneden in 1 cm stukjes </td></tr><tr><td> 3-weg kraan </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Harris puncher </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> Gecomprimeerd stikstofgas </td><td> Plaatselijke gasleverancier </td><td></td><td> Gebruik een regulator om de druk </td></tr><tr><td> Stereo microscoop &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Andor &amp; Olympus </td><td> Yokogawa draaiende schijf confocale microscoop </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Java gebaseerde beeldverwerking-programma </td></tr></tbody></table>

eenvoudige microfluïdische inrichtingen voor<em&gt; in vivo</em&gt; beeldvorming van<em&gt; c. elegans</em&gt;,<em&gt; drosophila</em&gt; en zebravis

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro gefabriceerd fluïduminrichtingen zorgen voor een toegankelijke micro-omgeving voor in vivo studies op kleine organismen. Eenvoudige fabricage processen zijn beschikbaar voor microfluïdische apparaten met behulp van zachte lithografie technieken 1-3. Microfluïdische inrichtingen zijn gebruikt voor subcellulaire imaging 4,5, in vivo laser microchirurgie 2,6 en 4,7 cellulaire beeldvorming. In vivo beeldvorming immobilisatie van organismen vereist. Dit is bereikt met zuig 5,8, taps toelopende kanalen 6,7,9, vervormbare membranen 2-4,10, zuig met extra koeling 5, narcosegas 11, temperatuurgevoelige gels 12, 13 en cyanoacrylaatlijm anesthetica zoals levamisole 14 , 15. Veelgebruikte anesthetica synaptische transmissie beïnvloeden 16,17 en is bekend nadelige effecten op subcellulair neuronale transport 4 hebben. In deze stUdy demonstreren we een membraan uit poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) apparaat dat verdoving vrije immobilisatie van intacte genetisch model organismen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larven en zebravis larven mogelijk. Dit model organismen zijn geschikt voor in vivo studies in microfluïdische inrichtingen vanwege hun kleine diameters en optisch transparant of doorschijnend organen. In diameters van ~ 10 pm tot ~ 800 urn voor vroege larvale stadia van C. elegans en zebravis larven en vereisen microfluïdische apparaten van verschillende afmetingen om volledig te immobiliseren voor hoge resolutie time-lapse imaging bereiken. Deze organismen worden geïmmobiliseerd met behulp van druk van gecomprimeerd stikstofgas door een vloeistofkolom en afgebeeld met een omgekeerde microscoop. Dieren vrijgelaten uit de val terug naar de normale voortbeweging binnen 10 minuten. We tonen vier toepassingen van time-lapse imaging in C. elegansnamelijk beeldvorming mitochondriaal vervoer in neuronen, pre-synaptische blaasje transport in een transport-defecte mutant, glutamaat receptor transport en Q neuroblast celdeling. Gegevens van dergelijke films laten zien dat microfluïdische immobilisatie is een nuttig en nauwkeurig middel verkrijgen in vivo data van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen ten opzichte van verdoofde dieren (Figuur 1J en 3C-F 4). Afmetingen van het apparaat werden veranderd om time-lapse beeldvorming van de verschillende stadia van C. Laat elegans, eerste instar Drosophila larven en zebravis larven. Transport van blaasjes gemarkeerd met synaptotagmin getagd met GFP (syt.eGFP) in sensorische neuronen toont gerichte beweging van synaptische blaasjes markers uitgedrukt in cholinerge sensorische neuronen in intacte eerste instar Drosophila larven. Een dergelijke inrichting is gebruikt voor het uitvoeren van time-lapse beeldvorming van hartslag in ~ 30 uur na de bevruchting (HPF)zebravis larven. Deze gegevens tonen dat de eenvoudige apparaten we hebben kan op een aantal modelsystemen verschillende celbiologische en ontwikkeling verschijnselen te bestuderen in vivo.

De immobilisatie apparaat is een dubbellaag PDMS blok vervaardigd door verbinden van twee lagen: een stroom laag (laag 1) en een regellaag (Layer 2) zoals getoond in figuur 1. De belangrijkste trap is verbonden met een stikstofgas cilinder via een regulator en een 3-weg stopkraan noodzakelijk (3-14 psi) op het membraan zich via een vloeistofkolom (Figuur 1A). De afgebogen membraan immobiliseert C. elegans, Drosophila en zebravis larven in het stromingskanaal ontworpen met versc...

Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te voeren<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en zebravis larven. Het apparaat maakt gebruik van een vervormbare PDMS membraan om deze modelorganismen immobiliseren om time-lapse imaging van tal van processen zoals hartslag, celdeling en sub-cellulaire neuronale transport uit te voeren. We demonstreren het gebruik van dit apparaat en tonen voorbeelden van verschillende soorten gegevens uit verschillende modelsystemen.

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; En zebravis

Microgefabriceerde fluïdische apparaten bieden een toegankelijke micro-omgeving voor in vivo-studies naar kleine organismen. Eenvoudige fabricageprocessen zijn ...

Hoi, ik ben Shamal, postdoctoral fellow bij TUR Kika aan het National Center for Biological Sciences in India. In deze video ga ik laten zien hoe u een bio-micro-apparaat kunt vervaardigen met behulp van soft-lithografie technieken in een reguliere laboratoriumomgeving. Ik ga deze apparaten gebruiken voor cellulaire en subcellulaire beeldvorming met een hoge resolutie van genetische modelorganismen.Het huidige protocol stelt onderzoekers in staat om deze time-lapse imaging uit te voeren in intacte organismen zonder gebruik van anesthetica. Laten we beginnen. We hebben een eenvoudig microfonisch apparaat ontwikkeld voor anesthetica-vrije in vivo imaging van genetische modelorganismen zoals C. elegans, intacte Drosophila en zebravissen.In deze studie demonstreren we een membraangebaseerd apparaat voor heldere immobilisatie, gefabriceerd met behulp van zachte gietvorming van PDMS. Om een enkel organisme te immobiliseren, lokaliseren we een individueel dier onder een stereomicroscoop en pakken we het dier op met een kleine druppel bufferoplossing met een micropipet, waarna we het individuele dier in het stroomkanaal plaatsen en immobiliseren onder het PTMS-membraan. Hierbij wordt gebru

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Grootschalige 2D elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is de toepassing van EM met nanoschaalresolutie op weefselbreed niveau. Hier beschrijven we een universele methode voor nanotomy toegepast om de larvale hersenen van de zebravis te onderzoeken in gezondheid en bij niet-invasieve hersenletsels.

Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Een innovatieve methode voor het vervaardigen van microfluïdische apparaten met behulp van polyethyleentereftalaat (PET) laminering vermindert de kosten en complexiteit van het vangen en afbeelden van meerdere levende zebravisembryo's aanzienlijk.

Goedkope Polyethyleentereftalaat Laminering Microfluidics Ontwerpen voor Gemultiplexte Zebravis Beeldvorming

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft op microfluïdische wijze gebaseerde C. elegans time-lapse-beeldvorming gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling.

Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

Leer microfluïdische apparaten fabriceren voor anestheticavrije in vivo beeldvorming van C. elegans, Drosophila en zebravis. Deze methode maakt tijdreeksimaging van biologische processen mogelijk.

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor

Meer video's verkennen