Conditietraining protocol en Longitudinale Prestaties Testen voor Drosophila melanogaster

Het doel van het volgende experiment is om Dsof en Melanogaster te trainen met een nieuw uithoudingsinspanningsprogramma en de effecten van deze training te beoordelen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een geautomatiseerd apparaat dat herhaaldelijk verschillende flesjes vliegen optilt en laat vallen, waardoor de instinctieve klimrespons van de vlieg wordt geactiveerd en de vliegen zo een trainingssessie krijgen. De vliegen worden dagelijks getraind volgens een oplopend schema van twee tot drie uur over een trainingsperiode van drie weken.

Vervolgens worden de vliegen onderworpen aan verschillende gedragsassays om de effecten van lichaamsbeweging te meten. De resultaten laten zien dat vliegen die lichaamsbeweging hebben ondergaan sneller klimmen, gemeten via de assay voor snel geïnduceerde negatieve geotaxis of de ringassay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals uithoudingstraining bij andere dieren, is de uitgebreide collectie beschikbare hulpmiddelen voor de manipulatie van de genetica van drosophila.

Bij de studie naar uithoudingsvermogen tijdens inspanning kregen we het idee voor deze methode toen we veelvuldig assays voor negatieve geotaxis uitvoerden. We vroegen ons af hoe lang vliegen konden blijven klimmen en of we hen op deze manier konden trainen voor uithoudingsvermogen. De power tower is gebouwd op een rechthoekig stuk multiplex dat aan een tafel is geklemd.

Een rotatiesnelheid van 4,5 per minuut. De tandwielmotor rust op verschillende planken en is aangesloten op een snelheidsregelaar, een zekering en een aan/uit-schakelaar. In een aansluitdoos is een ventilator van drie inch, geplaatst in een metalen buis, op de motor gericht voor koeling.

Aan de motor is een draaiarm met een roller verbonden. Tijdens het draaien van de motor en de arm wordt één zijde van een gebogen staaf, die aan het multiplex is bevestigd, naar beneden geduwd. Aan de andere zijde van de staaf is, via een deuurscharnier, een wiel bevestigd zodat dit tegen een platform kan rollen.

Het beweegt op en neer terwijl de motor draait; het vermogen van de motor is zo ingesteld dat een volledige rotatieperiode 15 seconden duurt. Op het platform zijn rekken met vliegenbuisjes bevestigd met elastieken, en de buisjes in deze rekken zijn vastgezet met een scherm dat eveneens aan het platform is bevestigd. Dankzij de elastieken kan het platform op en neer glijden langs standaard ladegeleiders, en een kussen van piepschuim dempt de schok van de val. De power tower wordt bediend in een temperatuurgecontroleerde ruimte om de omstandigheden te matchen waaronder de dieren worden gekweekt.

Voor het uitvoeren van een inspanningsexperiment zijn minimaal 240 leeftijd-gematchte mannelijke vliegen nodig voor longitudinale monitoring van het uithoudingsvermogen en de negatieve geo-as of klimcapaciteit. Houd de vliegen in populaties van 20 per vial. Verdeel de vials over twee gelijk grote groepen, waarvan er één getraind zal worden; de vials van die groep moeten worden afgesloten met flugs, terwijl de controlegroep moet worden afgesloten met sponsstoppers.

Een spons wordt gebruikt voor immobilisatie omdat de aanpasbare grootte een eenvoudige plaatsing nabij de bodem van het vial mogelijk maakt. Het zachtere sponsmateriaal vermindert bovendien letsel veroorzaakt door de hardere pluggen. De voedingsvials moeten om de dag worden vervangen vóór de test.

Tijdens de training blijven de vliegen in de voedingsbuisjes, omdat er bij gebruik van lege buisjes veel meer vliegen traininggerelateerde verwondingen oplopen. Druk bij het plaatsen van de buisjes met controlevliegen op de powertower de sponsstoppers tot ongeveer drie millimeter boven het voedingsniveau naar beneden, om zo de vliegen te beperken.

Beweging voor consistente resultaten. Test beide groepen vliegen vijf opeenvolgende dagen per week, waarbij een geleidelijk schema wordt gehanteerd dat de tijd per sessie over een periode van drie weken verhoogt van twee naar drie uur per dag. Uiteraard kan elk gewenst regime worden toegepast.

Consistentie in behandeling, tijdstip van de dag en assaymethoden over een periode van drie weken is essentieel. Een zorgvuldige planning en het oefenen van procedures verminderen de kans op fouten door vermoeidheid. Assays kunnen longitudinaal worden uitgevoerd op vliegen vóór, na of tijdens het trainingsregime.

Het kan ook worden gebruikt om een veiligere respons op een omgevingsvariabele te beoordelen. Voer de vermoeidheidstest uit op een dag waarop geen training plaatsvindt. Laad aan het begin van de dag beide groepen vliegen op de power tower.

Activeer het apparaat en observeer elk vials elke 10 minuten. Als bij vier opeenvolgende druppels vijf of minder vliegen in een vial hoger dan twee inches klimmen, dan wordt die cohort vliegen als vermoeid beschouwd. Verwijder de vermoeide vliegen uit de power tower terwijl deze nog in werking is en noteer het tijdstip van verwijdering.

Observe alle vials gedurende maximaal 10 uur en stel de resultaten samen. Eén assay voor kwantificering. De effecten van de training worden bepaald door een dagelijkse meting van de loopsnelheid, die gedurende het hele trainingsregime en daarna kan worden uitgevoerd.

Om het langetermijneffect van training te meten. Om de klimsnelheids- of ringtest te beginnen, worden de vliegen eerst overgebracht naar nieuwe lege flacons en wordt een rij van zes flacons in een flaconrek geplaatst. Opgeloste stukjes tape worden gebruikt om de flacons aan het rek te bevestigen.

Plaats het rek vervolgens voor een lichtbron, zoals een röntgen-kijkkast, die een gelijkmatige verlichting van de vials biedt. Stel nu een camera in om het rek te fotograferen, zodat de positie van elke vlieg in elk vial zichtbaar is. Tik vervolgens tegen de zes vials aan om alle vliegen naar de bodem van de vials te doen vallen en maak een tijdgestelde foto.

Twee seconden nadat de vliegen allemaal zijn verdoofd. Indien de flitser van de camera wordt gebruikt, dient dit consistent te gebeuren. Herhaal dit proces vier keer voor elke set flesjes voordat u verdergaat met de power tower.

Om de gegevens te analyseren, scoort u elke foto afzonderlijk met behulp van software om de boven- en ondergrenzen van het buisje te bepalen. Meet vervolgens de klimhoogte voor elke vlieg. Kopieer daarna de klimhoogtes naar Excel.

Elke vlieg in elk flaconnetje krijgt een score van nul tot vier, overeenkomend met de hoogte van het kwadrant. Ze klimmen naar vier voor het hoogste kwadrant en nul voor het helemaal niet klimmen. Bereken voor elk flaconnetje de score voor elk van de 20 vliegen en bepaal de gemiddelde score van de cohort.

Dit wordt de klimindex genoemd. Voor de data-analyse wordt het gemiddelde van de vier klimindices van elke cohort op die dag gebruikt. Als er geen beeldbewerkingssoftware beschikbaar is, kunnen kwadrantlijnen op de lege flacons worden getekend en kunnen de vliegen handmatig kwadrantwaarden worden toegewezen terwijl type vliegen reageerden op een uithoudingsprotocol met een verminderde ouderdomsgerelateerde afname van het klimvermogen.

Dit bleef voortbestaan na het beëindigen van de training, zoals weerspiegeld in longitudinale ring-assays over een periode van vijf weken. De inductie van beweging door het power tower-programma kan dus worden gebruikt als een gedragsmatige input, waarbij de mate waarin genetische of omgevingsfactoren dit effect kunnen moduleren, kan worden beoordeeld. Omgekeerd kan de power tower ook als output worden gebruikt.

Bijvoorbeeld, wanneer vliegen met een variërend percentage sucrose in hun dieet werden getest op de tijd tot vermoeidheid, correleerde een verhoogd sucrosegehalte met een verhoogde uithoudingscapaciteit. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle vliegencohorten qua leeftijd gelijk zijn en dat de methoden consistent worden uitgevoerd gedurende het gehele experiment.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u vliegen van elk genotype kunt uitputten, trainen en beoordelen.