Name: Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer de omgekeerde transport van dopamine meten in voltage-geklemde neuronen via simultane patch clamp en amperometrie. Deze methode maakt real-time analyse van DAT-gemedieerde afgifte mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr Sanika Chirwa voor kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DA026947, DA021471, en NS071122).

1. Apparatuur en benodigdheden <ol><li> Monteer een Faraday kooi bovenop de anti triltafel (TMI) om de achtergrondruis te verminderen. </li><li> De gelijktijdige patch clamp amperometrie opname systeem vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC optiek en een lange werkafstand lens. Sluit de microscoop vuurtoren op een auto-accu. Deze DC lichtbron voor het systeem verdere daling van het elektrische ruis. </li><li> Hydraulische micromanipulators (Siskiyou) verdere daling lawaai. In onze configuratie, gebruiken we een rechtshandige manipulator voor de hele cel opname, en de linker overhandigd voor amperometrie. </li></ol> 2. Bereid Elektroden voor opnemen <ol><li> Trek patch elektroden gebruik van kwarts pipetten op een P-2000 trekker (Sutter). Onze pull duurt ongeveer 5 sec, met twee warmte cycli. Deze warmte tijd heeft geresulteerd in een constante weerstand (3-4 MQ) in onze hele cel patch pipetten. </li><li> Vul de elektrode met depipetoplossing die 2 mM dopamine en monteren op de juiste manipulator. Wikkel de container met de pipet oplossing die DA met aluminiumfolie. Blijf op ijs. Dopamine oxideerbaar. Houd de oplossing op ijs beschermd tegen licht vermindert de oxidatiesnelheid van dopamine. </li><li> Verwijder een ProCFE (Dagan) een laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode uit de opbergdoos, vullen met kwik, mount op de amperometrische adapter (zoals afgebeeld in figuur 1), en dan monteren op de juiste maniupulator. Bescherm de tip van de koolstofvezel tegen beschadiging door die het einde van de koolstofvezel. Inspecteer de elektrode met een lab microscoop te zorgen voor de tip schoon en onbeschadigd. </li><li> Onderzoek de integriteit van de amperometrische elektrode zetten de elektrode in een glazen bodem petrischaal met externe oplossing. Neem een ​​basislijn stroom in afwezigheid van dopamine. Voeg 10 ul van een 1 mM oplossing DA de schotel. Een goede amperometrische elektrode rekoorden een verhoging van de oxidatieve stroom. Herhaal deze stap aan het begin en einde van elk experiment om er zeker van de amperometrische electrode werkt. </li></ol> 3. Bereid de primaire neuronale Cultuur van dopamine neuronen of cellen Ontworpen om Dopamine Transporter Express in Glass Bottom Petrischalen <ol><li> Voorzichtig wassen de cellen of dopamine neuronen drie keer met warm externe oplossing. </li><li> Monteer de glazen bodem petrischaal op de microscoop podium. </li></ol> 4. Visualiseer Cel-en uitvoeren Experiment <ol><li> Zoek de juiste brandpunt om duidelijk te visualiseren de cellen. Plaats positieve druk op de patch elektrode. Daarna voorzichtig brengen beide elektroden naar beneden in de oplossing, en dicht bij de cel. </li><li> Plaats de amperometrische elektrode naast de cel (aan de linkerkant) en de patch elektrode rechts. </li><li> Gigaohm bereiken een afdichting op de cel met de patch elektrode. Breuk van de afdichting met afzuiging naarbereiken gehele cel configuratie. </li><li> Toestaan ​​5-8 min. voor dialyse van interne oplossing die dopamine in de cel. </li><li> Gebruik de gewenste spanning stap of ramp-protocol. Gelijktijdige meten gegevens van de patch pipet en amperometrische elektrode gehele cel stromen te meten en terug transport van dopamine door de dopamine transporter terwijl de membraanpotentiaal wordt via de patch pipet. </li></ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Gelijktijdige voltage-clamp en amperometrie heeft de volgende voordelen. Alle celtypen zijn toegankelijk en kunnen worden gebruikt voor opname. De identificatie van de cellen of neuron waar de opnames worden gedaan, is eenvoudig en ongecompliceerd. Met name wanneer de cel fluorescent gelabelde door toevoeging van een fluorescerend label aan het eiwit van belang de experimentator kan eenvoudig de doelcel of neuron. De experimentele configuratie maakt uniforme en gecontroleerde afgifte van farmacologische middelen hetzij ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Anti-vibratie tafel w / kooi van Faraday </td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> 63 tot 500 serie </td><td> gebruiken we het model 63 tot 543 </td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> gestaakt </td><td> nu Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Twee low noise versterkers axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BU headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipethouder </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D converter </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Twee manipulatoren Siskyou, linksen rechtshandig </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipet trekker </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Laag geluidsniveau kwarts pipet </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> QF100-70-7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-volt accu van de auto </td><td></td><td></td><td> schaal beschikbaar </td></tr><tr><td> Auto acculader </td><td></td><td></td><td> schaal beschikbaar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfaat (MgSO4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchloride (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloridedihydraat (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchloridehexahydraat (MgCl2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige voltage-klem en amperometrie

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Na de introductie in de synaptische spleet, dopamine oefent zijn biologische eigenschappen via de pre-en post-synaptische doelstellingen 1. De dopamine signaal wordt beëindigd door diffusie 2-3, extracellulaire enzymen 4 en membraan transporters 5. De dopamine transporter, gelegen in het peri-synaptische spleet van dopamine neuronen wist de vrijgekomen aminen door middel van een naar binnen dopamine flux (opname). De dopamine transporter kan ook in omgekeerde richting om aminen vrijgeven van binnen naar buiten in een proces genaamd naar buiten vervoer of efflux van dopamine 5. . Meer dan 20 jaar geleden Sulzer et al. rapporteerden de dopamine transporter kan in twee vormen van activiteit: vooruit (opname) en achteruit (efflux) 5. De neurotransmitter model via efflux door de transporter kunt een grote hoeveelheid dopamine naar de extracellulaire ruimte, en blijkt een belangrijke regulerende rol spelen in extracellulaire dopamine homeostasis 6. Hier beschrijven we hoe gelijktijdige patch clamp en amperometrie registratie kan worden toegepast om model dopamine meten via de efflux mechanisme milliseconde tijdsresolutie wanneer de membraanpotentiaal wordt geregeld. Hiervoor zijn gehele celstroom en oxidatieve (amperometrische) signalen gelijktijdig gemeten met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, een low-pass filter set Bessel bij 1000 Hz voor whole-cell huidige opname). Voor amperometrie opnemen van een koolstofvezel elektrode is verbonden met een tweede versterker (Axopatch 200B) en grenzend aan het plasmamembraan en +700 mV gehouden. De volledige cel en oxidatieve (amperometrische) stromen kunnen worden opgenomen en de stroom-spanning relatie kan worden gegenereerd met een spanningssprong protocol. In tegenstelling tot de gebruikelijke amperometrische kalibratie, die omzetting concentratie is vereist, wordt de stroom direct gerapporteerd zonder de effectieve volume 7. Aldus de verkregen datavertegenwoordigen een ondergrens aan dopamine efflux omdat sommige zender wordt verloren aan de bulk oplossing.

Gecombineerde patch clamp met amperometrie kan meten spanningsafhankelijke DAT-gemedieerde efflux DA. Figuur 2A toont een representatieve experimentele configuratie en opnemen van DAT-gemedieerde efflux DA wanneer de intracellulaire milieu en de membraanpotentiaal worden vastgeklemd door een volledige cel patch pipet. Met deze techniek cellen die YFP-DAT eiwitten voltage-geklemd met een gehele cel patch pipet terwijl een amperometrische elektrode wordt op de plasmamembraan (Figuur 2A). ...

De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale &quot;activiteit&quot; van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

Na de afgifte in de synaptische spleet oefent dopamine zijn biologische eigenschappen uit via zijn pre- en postsynaptische doelwitten1. Het dopaminesignaal is ...

Het doel van deze procedure is om het omgekeerde transport van dopamine te meten in een neuron dat spanningsgeclamp is, waarbij gelijktijdige patchclamp en pyrometrie worden gebruikt om de DAT-gemedieerde dopaminevrijgave te meten. Dit wordt bereikt door eerst de integriteit van de pyrometrische elektrode met dopamine te testen. De tweede stap is om de pyrometrische elektrode nabij de cel te plaatsen en een whole-cell patch van het neuron te realiseren met een patchpipet.Vervolgens wordt de spanning van de cel geregeld met de patchpipet, terwijl de door DAT gemedieerde dopamineafgifte van de cel gelijktijdig wordt geregistreerd met een pyrometrische elektrode. De laatste stap is het toevoegen van de DAT-blokker en het opnieuw registreren van de whole-cell- en pyrometrie-stromen, zodat de specifiek door de dopaminetransporteur gemedieerde stroom kan worden afgetrokken. Het belang van deze techniek is de mogelijkheid om het omgekeerde transport van dopamine via de dopaminetransporteur te meten, terwijl de spanning van het dopaminerge neuron gelijktijdig wordt gecontroleerd.Het systeem voor gelijktijdige patchclamp- en barometrie-registratie vereist een omgekeerde microscoop met uitst

single-cell-measurement-dopamine-release-with-simultaneous-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video laten we zien hoe een geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron opgenomen in de whole cell configuratie in hersenen van de rat plakjes. Deze techniek heet de dynamische klem.

Toepassing van een NMDA-receptor Conductance in Rat middenhersenen dopaminerge neuronen Met behulp van de Dynamic clamp techniek

Met behulp van fast-scan cyclische voltammetrie elektrisch opgeroepen presynaptische dopamine dynamiek te meten in de hersenen striatale plakjes.

Presynaptische Dopamine Dynamiek in het striatum Brain Plakjes met Fast-scan cyclische voltammetrie

This video demonstrates the implantation of electrodes and cannulas in an anesthetized rat to measure dopamine release in the nucleus accumbens using a potentiostat and the infusion of drugs to modulate dopaminergic activity in the ventral tegmental area.

Monitoring Dopamine Release in a Rat Model with VTA Dopaminergic Neuron Receptor Manipulation

The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila's ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Subcellulaire patch-clamp opnames bieden de mogelijkheid om de functionele eigenschappen van dendrieten te onderzoeken. Deze fijne structuren zijn echter niet gemakkelijk toegankelijk vanwege hun kleine diameter. Het hier beschreven protocol is bedoeld om het verzamelen van stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopamine neuronen in slicen in vitro te vergemakkelijken.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Snelle-scan cyclische voltammetrie kan in vivo dopamine neurotransmissie in de context van drugs, ziekte en andere experimentele manipulaties monitoren. Dit werk beschrijft de implementatie van QNsim1.0, een software voor het modelleren van elektrisch gestimuleerde dopamine responsen volgens het kwantitatieve neurobiologische model om schattingen van dopamine release en reuptake dynamics te kwantificeren.

Modellering Snel-scannen Cyclische Voltammetrie Gegevens van Elektrisch Gestimuleerde Dopamine Neurotransmissie Gegevens Met behulp van QNsim1.0

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Deze paper gegevens het gebruik van vaste-potentieel amperometrische opnamen met behulp van koolstofvezel elektroden en de enzymatische biosensor technologie voor het meten van de vrijlating van dopamine en glutamaat met hoge temporele resolutie tijdens natuurlijke lonende gedrag in de vrouwelijke hamster.

Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Leer de omgekeerde transport van dopamine meten in voltage-geklemde neuronen via simultane patch clamp en amperometrie. Deze methode maakt real-time analyse van DAT-gemedieerde afgifte mogelijk.

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

Meer video's verkennen