Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie
21 november 2012
De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.
Het doel van deze procedure is om de omgekeerde transport van dopamine in een neuron te meten dat voltage-geklemd is, met behulp van gelijktijdige patch clamp en pyrometrie om de DAT-gemedieerde D-afgifte te meten. Dit wordt bereikt door eerst de integriteit van de pyrometrische elektrode met dopamine te testen. De tweede stap is om de pyrometrische elektrode in de buurt van de cel te plaatsen en een volledige celpatch van de neuron te bereiken met een patchpijpje.
Vervolgens wordt de spanning van de cel geregeld met de patchpijp en wordt de DAT-gemedieerde dopamine die door de cel wordt vrijgegeven, gelijktijdig opgenomen met een pyrometrische elektrode. De laatste stap is om de DAT-blokker toe te voegen en de volledige cel en pyrometriestromen opnieuw op te nemen om de stroom die specifiek wordt gemedieerd door de dopaminetransporter af te trekken. De betekenis van deze techniek is de mogelijkheid om omgekeerde transport van dopamine via de dopaminetransporter te meten terwijl tegelijkertijd de spanning van de dopaminerge neuron wordt geregeld.
Het gelijktijdige patch clamp en barometrie opnamesysteem vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC-optiek en een lens met een lange werkafstand om een DC-lichtbron voor het systeem te genereren. Met lage elektrische ruis, sluit de microscoop vuurtoren aan op een autobatterij. De hydraulische micro manipulatoren worden gebruikt omdat ze niet significant bijdragen aan de ruisniveaus in onze configuratie.
Een rechterhandige manipulator wordt gebruikt voor de spanningsklemp, volledige celopname en de linkerhandige manipulator voor de pyrometrie. Om de elektrode voor groothandelopname voor te bereiden, trekt u een kwartspijpje met een P 2000 trekker. Gewoonlijk gebruiken we een pijpje met een weerstand van drie tot vier mega ohm.
Vervolgens vult u de elektrode met de pijpjeoplossing die één millimolair dopamine bevat. Bevestig het vervolgens op de pijpjeshouder aan de rechter manipulator. Zorg ervoor dat u de container die de dopaminebevattende pijpjeoplossing bevat, omwikkelt met aluminiumfolie en deze op ijs bewaart wanneer deze niet in gebruik is.
Aangezien dopamine oxideerbaar is, zal het houden van de oplossing op ijs en beschermd tegen licht de oxidatiesnelheid verlagen. Draai de zilveren draad in de elektrodehouder en draai vervolgens de am parametrische adapter op de elektrodehouder. Vul vervolgens de tric elektrode met voldoende kwik om contact te maken met de zilveren draad.
Wanneer de elektrode op de adapter is gemonteerd, zorg er dan voor dat u de pro CFE lage ruis koolstofvezel en parametrische elektrode onder de microscoop inspecteert om ervoor te zorgen dat de punt schoon en intact is. Zorg ervoor dat u het uiteinde van de koolstofvezel vasthoudt om de punt van de koolstofvezel tegen schade te beschermen. Monteer vervolgens de pro CFE Tric elektrode.
Monteer vervolgens de geassembleerde elektrode op de linker hydraulische manipulator om de integriteit van de tric elektrode te onderzoeken. Laat het zakken in een glazen bodem Petri-schaal met de externe oplossing. Neem de baseline stroom op in de afwezigheid van dopamine.
Voeg vervolgens 10 microliter van een één millimolair dopamine-oplossing toe aan de schaal. Een goede emper metrische elektrode zou een toename in de oxidatieve stroom moeten registreren. Zorg ervoor dat u de integriteit van de emper metrische elektrode controleert voor en na de experimenten.
In deze procedure haalt u de dopamine-neuronen of cellen die zijn geëngend om dopaminetransporter tot expressie te brengen, die in de glazen bodem Petri-schaal zijn geplaatst, uit de incubator. Was de cellen of dopamine-neuronen voorzichtig drie keer met warme externe oplossing. Om de cellen te visualiseren en het experiment uit te voeren, monteert u de glazen bodem Petri-schaal op de microscooptafel en vindt u het juiste brandpunt om de cellen duidelijk te visualiseren.
Breng vervolgens positieve druk aan op de patchelektrode. Gebruik een enkele milliliter spuit om beide elektroden voorzichtig in de oplossing te brengen en dichter bij de cel met de micro manipulatoren. Positioneer vervolgens de emper metrische elektrode aan de linkerkant van de cel en de patchelektrode aan de rechterkant.
Wanneer de patchelektrode de cel raakt. Pas lichte zuiging toe met de mond of spuit om een giga seal op de cel te vormen. Daarna, breek de seal met zuiging om een volledige celconfiguratie te bereiken, en laat vijf tot acht minuten voor het dialyse van de dopaminebevattende interne oplossing in de cel.
Neem vervolgens DAT-gemedieerde stromen op door de celmembraanspanning tussen min 60 en plus 100 millivolts te verhogen vanuit een houdspanning van min 40 millivolts via de pijp. Om de specifieke DAT-gemedieerde dopamine flx te bepalen, registreert u de emper metrische stromen in de afwezigheid en aanwezigheid van een DAT-antagonist. De specifieke DAT-gemedieerde tric-stroom wordt vervolgens bepaald door de sporen die zijn opgenomen in de aanwezigheid van DAT-antagonist af te trekken van de emper-sporen die zijn opgenomen zonder de antagonist.
Een opwaartse afbuiging in de tric-stromen komt overeen met een uitwaartse flux van dopamine die hier wordt getoond. Een DAT-gemedieerde stroom die wordt opgenomen door de membraanspanning te verhogen met 20 millivolt tussen min 60 en plus 100 millivolts vanaf een houdspanning van min vier C millivolts met de pijp die twee millimolair dopamine bevat in de volledige cel patch-modus. Hier is de Emper metrische stroom die gelijktijdig met de volledige celstroom is verkregen.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u omgekeerde transport van dopamine via de dopaminetransporter in een voltage-geklemd neuron kunt meten. Vergeet niet om de integriteit van de parametrische elektrode vóór en na experimenten te controleren, en vergeet niet om de sporen die zijn opgenomen in de aanwezigheid van die antagonist af te trekken van de tric-sporen die zijn opgenomen zonder de antagonist.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek om het omgekeerde transport van dopamine in neuronen te meten met behulp van gelijktijdige patchclamp en pyrometrie. De methode maakt het mogelijk om de door de dopaminetransporter (DAT) gemedieerde afgifte te beoordelen terwijl de spanning van het neuron wordt gecontroleerd.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurotransmitterdynamiek
Achtergrond
- Dopamine is een cruciale neurotransmitter die betrokken is bij diverse hersenfuncties.
- De dopaminetransporter speelt een sleutelrol bij de regulatie van dopamineniveaus.
- Inzicht in mechanismen van revers transport is essentieel voor het begrip van dopaminerge signalering.
- Deze techniek combineert voltageclamping met amperometrische metingen voor een verbeterde nauwkeurigheid.
Doel van de studie
- Om het revers transport van dopamine in voltage-clamped neuronen te meten.
- Om de relatie tussen DAT-activiteit en dopamine-afgifte te onderzoeken.
- Om een methode te bieden voor het bestuderen van de functie van dopaminerge neuronen in real-time.
Gebruikte Methoden
- Het testen van de integriteit van de pyrometrische elektrode met dopamine.
- Het verkrijgen van een whole-cell patch van het neuron met behulp van een patchpipet.
- Het beheersen van de celspanning met de patchpipet.
- Het registreren van DAT-gemedieerde dopaminevrijgave met de pyrometrische elektrode.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van dopaminevrijgave tijdens voltage clamping.
- Het effect van DAT-blokkers op dopaminetransport is aangetoond.
- Inzichten verschaft in de reguleringsmechanismen van dopaminetransport.
- De methode voor het bestuderen van neuronale dopaminedynamiek is gevalideerd.
Conclusies
- De techniek meet effectief het revers transport van dopamine.
- Simultane controle van de spanning verbetert het begrip van de DAT-functie.
- Deze methode kan worden toegepast in verdere studies naar dopaminerge signalering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode maakt directe meting van dopamine-efflux via de dopaminetransporter onder spanningscontrole mogelijk, wat mechanistisch inzicht biedt in de transporterfunctie die relevant is voor de ontdekking van neuropsychiatrische geneesmiddelen. Door DAT-gemedieerde afgifte in realtime te isoleren, ondersteunt het de target-validatie en vermindert het de risico's van hypothesen over dopaminerge signalering in ziektemodellen. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door transporteractiviteit te koppelen aan neurotransmitterdynamiek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt het effluxmechanisme van de dopaminetransporter om functionele target-engagement in levende neuronen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gelijktijdige elektrofysiologische en amperometrische registratie mogelijk om het membraanpotentieel te correleren met de transporter-gemedieerde dopamineflux.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdopgeloste oxidatieve stroommetingen die de DAT-afhankelijke dopamineafgifte weerspiegelen onder gecontroleerde voltagesprongen.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbaar assay-formaat voor het meten van transporter-gemedieerde efflux, wat screening van verbindingen voor DAT-modulatoren ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt de DAT-effluxactiviteit aan de extracellulaire dopamine-homeostase, wat nuttige informatie verschaft voor ziektemodellen waarbij transporterdisfunctie een rol speelt.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelevant systeem om genetische of farmacologische verstoringen van de dopamine-transporterfunctie te beoordelen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking door mechanische risicoreductie van dopaminetransporteur-doelwitten mogelijk te maken voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van mechanismen voor transporter-reversie en verduidelijking van signaalpaden in dopaminerge neuronen.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve outputs voor het evalueren van de effecten van verbindingen op DAT-gemedieerde efflux.
- Analytics: Maakt gelijktijdige whole-cell stroommetingen en amperometrische metingen mogelijk om DAT-specifieke signalen te isoleren via farmacologische subtractie.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door dopamine-dysregulatie te modelleren in spanningsgestuurde neuronale systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van transporterfuncties in meerdere neuronale modellen of ziektecontexten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de efflux-gemedieerde dopaminevrijgave direct te meten onder fysiologische spanningscontrole.
- Operationele waarde: Bevordert de standaardisatie van assays door gesynchroniseerde patchclamp en amperometrie, waardoor de variabiliteit in metingen van de neurotransmitterflux wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het werkingsmechanisme van de transporter te verduidelijken, wat uitval in een laat stadium door mechanische misinterpretaties vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van DAT-gerichte verbindingen mogelijk op basis van functionele gegevens over efflux-modulatie.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, amperometrie en neuronale kweek om de integriteit van de elektroden en de getrouwheid van het signaal te waarborgen.
- Is afhankelijk van instrumenten met een laag ruisniveau, waaronder hydraulische manipulatoren, dubbele Axopatch 200B-versterkers en koolstofvezelelektroden voor gelijktijdige registratie.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams van spanningsprotocollen en methoden voor antagonist-subtractie om de vergelijkbaarheid tussen experimenten te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende neuronale modellen, in het bijzonder met betrekking tot de expressieniveaus van dopaminetransporteurs en de membraangezondheid.
- Bevat praktische beperkingen zoals de oxidatie van de dopamine-oplossing, wat beschermende behandeling en baseline-validatie voor en na de experimenten vereist.
