Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie
March 18th, 2012
Wij beschrijven het gebruik van een gestopt-flow instrument zowel de reductieve en oxidatieve halve reacties van onderzoeken Aspergillus fumigatus Siderofoor A (Sida), een flavine-afhankelijke mono-oxygenase. Vervolgens hebben we laten zien de spectra die overeenkomt met de soort in de reactie van SIDA en berekenen we de snelheidsconstanten voor hun vorming.
Deze procedure gebruikt een gestopt stroominstrument om de verschillende spectrale vormen van SID A te detecteren en snelheden te meten. De reactie gekatalyseerd door SID A kan worden verdeeld in reducerende en oxidatieve halfreacties van FAD. Het geoxideerde flavine bindt aan N-A-D-P-H en reageert om gereduceerd flavine en NADP plus te vormen. De reactie van moleculair zuurstof en binding van ornithine resulteert in de vorming van C vier.
Een hydroxyflavine na hydroxylatie van ornithine, de hydroxyflavine dehydrateert om het geoxideerde enzym te vormen. NA DP plus blijft gedurende de hele katalytische cyclus gebonden en is het laatste substraat dat wordt vrijgegeven. Het gestopt stroominstrument vergemakkelijkt snelle menging van kleine volumes van reactanten en records.
De spectrale veranderingen in de loop van de tijd. Stuff verliesspectrometer staat toe om de snelheid van vorming en van een enzym gekatalyseerde reactie specifiek van voorbijgaande intermediairen te meten. Twee leden van mijn lab, Rita Robinson en Enviro Romero zullen deze experimenten demonstreren met set A bij flavor mono oxygenase als een modelsysteem. Giet 250 milliliter van 100 millimolair kaliumfosfaat buffer in een 500 milliliter buchner kolf met een roerstaaf.
Versluit de kolf met een rubberen stop, plaats het dan op een roerplaat en verbind de korte buis van de kolf met een sch flank lijn. Degasseer de buffer onder vacuüm gedurende een uur bij kamertemperatuur met roeren, gevolgd door spoelen met argon. Herhaal vijf keer.
Spoel ten slotte de kolf gedurende 10 seconden met Argonne. Ontkoppel de kolf van de vacuümaansluiting en plaats het in de handschoenenkast. Blijf krachtig roeren met de open kolf.
Vul de reservoir spuiten met 18,13 eenheden per milliliter glucose oxidase en 100 millimolair glucose oplossingen. Stel nu de aandrijfkleppen op de laadpositie. Vul de aandrijfspuiten.
Draai vervolgens de F klep naar de aandrijfpositie. Gebruik de pro data control software, klik leeg de stop spuit, en duw vervolgens de buffer van de aandrijfspuiten F door het stroomscircuit door handmatig de corresponderende aandrijf ram omhoog te brengen. Ga door met de andere drie aandrijfspuiten. Equilibreer gedurende een uur.
Hervul nu de reservoir spuiten en herhaal het spoelen van het gestopt stroomsysteem. Om zuurstofverzadigde buffer voor te bereiden. Laat de oplossing gedurende een uur met roeren met 100% zuurstof borrelen.
Verwijder vervolgens de korte naald uit de flacon en wacht 10 seconden. Ga door met het verwijderen van de lange naald en plaats de gesloten flacon in de handschoenenkast. Voor de N-A-D-P-H oplossing.
Plaats een 1,5 milliliter einor buisje met één milligram N-A-D-P-H in de handschoenenkast. Los op in 300 microliters anaërobe, 100 millimolair kaliumfosfaat buffer. pH 7,5.
Verwijder 30 microliters om de N-A-D-P-H concentratie te bepalen. Om nu zuurstof uit het enzym voorraad te verwijderen, breng de oplossing over in een 25 milliliter flacon met een roerstaaf, dop met een korrel en stop en aluminium afdichting. Plaats op ijs.
Verbind met een schlink lijn, vervolgens degasseer door vacuüm gedurende 20 minuten, gevolgd door spoelen met argon. Spoel ten slotte de flacon gedurende 10 seconden met Argonne en ontkoppel deze van de vacuümaansluiting. Plaats de flacon op ijs in de handschoenenkast.
In het controlepaneel venster van de pro data control software. Selecteer fotodiode array, externe trigger en logaritmische schaal. Start ook de pro data viewer software en definieer de map voor gegevensbestand opslag.
Vervang nu de oplossing in de reservoir spuiten C en F met anaërobe 100 millimolair kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Draai de C en F kleppen naar de aandrijfpositie. Klik leeg de stop spuit in de pro data control software.
Duw vervolgens de buffer van beide aandrijfspuiten door het stroomscircuit door handmatig de corresponderende aandrijf ram omhoog te brengen. Herhaal het spoelen met reservoir spuiten C en F nog drie keer. Om een volledige verwijdering van glucose oxidase uit het stroomscircuit te garanderen, klik op baseline in de pro data control software.
Vervang de oplossing van de reservoir spuit F met de enzymoplossing. Draai de F klep naar de aandrijfpositie. Klik leeg de stop spuit in de pro data control software.
Duw de enzymoplossing van de aandrijfspuiten F door het stroomscircuit door handmatig de corresponderende aandrijf ram omhoog te brengen. Keer terug naar de pro data control software om de acquisitietijd in te stellen op 60 seconden. Controleer of beide aandrijfspuiten gevuld zijn met hun corresponderende oplossingen en dat de aandrijf rams in contact zijn met de aandrijfspuiten.Pistons.
Draai beide kleppen naar de aandrijfpositie en klik op verwerven in de pro data control software om de aandrijving uit te voeren. Verwerf spectrale gegevens van de geoxideerde vorm van het enzym in drievoudigheid met behulp van de A 4 52 nanometer waarde verkregen uit de aandrijvingen. Bepaal de enzymconcentratie vóór het mengen en bereid vier milliliter N-A-D-P-H oplossing voor.
1,5 maal meer geconcentreerd, vul reservoir spuit C met de N-A-D-P-H oplossing en leeg en vul de stop spuit drie keer op zoals eerder getoond. Verwerf nu spectra tijdens de reductie van het enzym. Spoel de inhoud uit het stroomscircuit met anaërobe 100 millimolair kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Klik vervolgens op baseline in de pro data control software.
Meng vervolgens 200 microliters enzym voorraadoplossing met 1000 microliters anaërobe, 100 millimolair kaliumfosfaat buffer. pH 7,5. Vervang de oplossing van de reservoir spuit A met de enzymoplossing.
Draai de A klep naar de aandrijfpositie in de pro data control software. Klik de stop spuit leeg. Duw de enzymoplossing van de aandrijfspuiten A door het stroomscircuit door handmatig de corresponderende aandrijf ram omhoog te brengen.
Stel de vertragingstijd in op 0,5 seconden en de acquisitietijd op 60 seconden. Controleer of alle aandrijfspuiten
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van een stopped-flow instrument om de reductieve en oxidatieve halfreacties van Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA), een flavine-afhankelijke monooxygenase, te analyseren. Het onderzoek omvat spectrale analyse van de reactie-intermediaten en de berekening van snelheidsconstanten voor hun vorming.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Enzymologie
- Spectroscopie
Achtergrond
- Aspergillus fumigatus is een belangrijke schimmelpathogeen.
- Siderophore A (SidA) speelt een cruciale rol bij ijzeropname.
- Flavine-afhankelijke monooxygenases zijn belangrijk voor verschillende biochemische reacties.
- Het begrijpen van de reactiemechanismen kan helpen bij het ontwikkelen van antischimmelstrategieën.
Doel van het onderzoek
- Om de reactiemechanismen van SidA te onderzoeken.
- Om de snelheidsconstanten van reactie-intermediaten te meten.
- Om inzichten te geven in de katalytische cyclus van flavine-afhankelijke enzymen.
Gebruikte methoden
- Stopped-flow spectroscopie voor snelle menging en spectrale analyse.
- Voorbereiding van anaërobe omstandigheden voor enzymreacties.
- Meting van spectrale veranderingen in de tijd om de reactiekinetiek te bepalen.
- Gebruik van specifieke buffers en reagentia om de reacties te vergemakkelijken.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verschillende spectrale vormen van SidA tijdens reacties.
- Berekening van snelheidsconstanten voor de vorming van reactie-intermediaten.
- Demonstratie van de katalytische cyclus met NADP en zuurstof.
- Karakterisering van transiente intermediaten in de reactieroute.
Conclusies
- De stopped-flow techniek is effectief voor het bestuderen van enzymkinetiek.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar flavine-afhankelijke enzymen informeren.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van schimmelmetabolisme.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Stopped-flow spectrophotometry enables precise kinetic dissection of flavin-dependent monooxygenase reactions, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By resolving reductive and oxidative half-reactions and quantifying transient intermediates, this approach enhances predictive confidence for enzyme-targeted portfolios. The method's adaptability to other flavin-dependent systems positions it as a reusable capability for biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of intrinsic rate constants for mechanistic hypothesis testing.
- Supports identification and characterization of catalytic intermediates for functional target validation.
- Facilitates biological de-risking by clarifying enzyme reaction pathways.
- Improves predictive confidence for advancing enzyme targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated spectral readouts for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative tracking of enzyme redox states for reliable compound evaluation.
- Supports preparation of robust biological systems for downstream screening workflows.
- Allows platform reuse across flavin-dependent monooxygenase targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with disease-relevant enzyme systems when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage kinetic validation to preclinical model selection.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying catalytic mechanisms.
- Supports translational biomarker development through quantitative intermediate detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving reductive and oxidative half-reactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of rate constants and detection of transient intermediates for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical model selection when enzyme targets are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to other flavin-dependent monooxygenases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and kinetic data analysis.
- Needs access to stopped-flow spectrophotometry and anaerobic handling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer preparation and instrument calibration.
- Adaptable to various flavin-dependent monooxygenase systems with appropriate optimization.
- Dependent on maintaining strict anaerobic conditions for accurate half-reaction measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
