Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

Deze procedure maakt gebruik van een stopped-flow instrument om de verschillende spectrale vormen van SID A te detecteren en snelheden te meten. De reactie gekatalyseerd door SID A kan worden onderverdeeld in reductieve en oxidatieve halfreacties van FAD. Het geoxideerde flavine bindt aan N-A-D-P-H en reageert tot gereduceerd flavine en NADP; de daaropvolgende reactie met moleculaire zuurstof en de binding van ornithine resulteren in de vorming van C vier.

Een hydroxyflavine na hydroxylering van ornithine; het hydroxyflavine dehydrateert om het geoxideerde enzym te vormen. NADP⁺ blijft gedurende de gehele katalytische cyclus gebonden en is het laatste substraat dat wordt vrijgegeven. Het stopped-flow instrument faciliteert het snel mengen van kleine volumes reactanten en registreert deze.

De spectrale veranderingen in de loop van de tijd met een spectrofotometer maken het mogelijk om de vormingssnelheid en het verlies van een enzymgecatalyseerde reactie te meten, specifiek van transiënte tussenproducten. Twee leden van mijn laboratorium, Rita Robinson en Enviro Romero, zullen deze experimenten demonstreren met behulp van set A, waarbij flavor mono-oxygenase als modelsysteem dient. Giet 250 milliliters van 100 millimolar kaliumfosfaatbuffer in een 500 milliliter Buchnerkolf die een roerstaaf bevat.

Sluit de kolf af met een rubberen stop, plaats deze vervolgens op een roerplaat en verbind de korte tube van de kolf met een sch flank-lijn. Ontgas de buffer onder vacuüm gedurende een uur bij kamertemperatuur met agitatie, gevolgd door spoelen met argon. Herhaal dit vijf keer.

Spoel de kolf tot slot 10 seconden door met argon. Koppel de kolf los van het vacuümmanifold en plaats deze in de glovebox. Ga door met krachtig roeren terwijl de kolf open blijft.

Vul de reservoirspuiten met glucose-oxidase-oplossingen van 18,13 units per milliliter en glucose-oplossingen van 100 millimolar. Zet nu de aandrijfkleppen in de laadpositie. Vul de aandrijfspuiten.

Draai vervolgens de F-klep naar de drive-positie. Klik in de pro data-besturingssoftware op 'empty the stop syringe' en duw de buffer vanuit de drive-spuit F door het stroomcircuit door de overeenkomstige drive-zuiger handmatig omhoog te bewegen. Herhaal dit voor de andere drie drive-spuiten en laat het systeem een uur equilibreren.

Vul nu de reservoirspuiten opnieuw en herhaal het doorspoelen van het gestopte flowsysteem. Om zuurstofsaturatiebuffer te bereiden: belucht de oplossing gedurende één uur met 100% zuurstof onder agitatie.

Verwijder vervolgens de korte naald uit het vial en wacht 10 seconden. Verwijder daarna de lange naald en plaats het gesloten vial in de glovebox. Voor de N-A-D-P-H oplossing.

Plaats een eppendorfbuisje van 1,5 milliliter met één milligram NADPH in de glovebox. Los dit op in 300 microliter anaërobe, 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffer, pH 7,5.

Verwijder 30 µL om de NADPH-concentratie te bepalen. Om nu zuurstof uit de enzymvoorraad te verwijderen, brengt u de oplossing over in een flacon van 25 mL met een roerkop, dop en aluminium zegel.

Sluit het flesje aan op een Schlenk-lijn, ontgas vervolgens gedurende 20 minuten via vacuüm en spoel daarna met argon. Spoel het flesje tot slot 10 seconden met argon en ontkoppel het van het vacuümmannifold. Plaats het flesje op ijs in de glovebox.

Selecteer in het venster van het controlepaneel van de pro data-besturingssoftware de fotodiodearray, de externe trigger en de logaritmische schaal. Start daarnaast de pro data-viewer-software en definieer de map voor de opslag van de gegevensbestanden.

Vervang nu de oplossing in de reservoir-spuiten C en F door anaerobe 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffer pH 7.5. Draai de kleppen C en F naar de drive-positie. Klik in de pro data-besturingssoftware op empty the stop syringe.

Duw vervolgens de buffer vanuit beide aandrijpspuiten door het stroomcircuit door de overeenkomstige aandrijfram handmatig omhoog te bewegen. Herhaal het spoelen met reservoirspuiten C en F nog drie keer. Klik in de pro data control-software op baseline om volledige verwijdering van glucose-oxidase uit het stroomcircuit te waarborgen.

Vervang de oplossing in de reservoirspuit F door de enzymoplossing. Draai de F-klep naar de stand 'drive'. Klik in de pro data-besturingssoftware op 'empty the stop syringe'.

Duw de enzymoplossing vanuit aandrijfspuit F door het stroomcircuit door de bijbehorende aandrijfzuiger handmatig omhoog te bewegen. Keer terug naar de pro data-besturingssoftware om de acquisitietijd op 60 seconden in te stellen. Controleer of beide aandrijfspuiten gevuld zijn met de overeenkomstige oplossingen en of de aandrijfzuigers in contact staan met de zuigers van de aandrijfspuiten.

Zet beide kleppen in de drive-positie en klik op acquire in de pro data-besturingssoftware om de drive uit te voeren. Verzamel in drievoud spectrale gegevens van de geoxideerde vorm van het enzym met behulp van de A 452 nanometer waarde die uit de drives is verkregen. Bepaal de enzymconcentratie vóór het mengen en bereid vier milliliter NADPH-oplossing.

Vul reservoirspuit C met een 1,5 keer meer geconcentreerde N-A-D-P-H-oplossing en maak de stopspuit drie keer leeg en vul deze opnieuw, zoals eerder getoond. Neem nu spectra op tijdens de reductie van het enzym; spoel de inhoud uit het stroomcircuit met anaerobe 100 millimolar kaliumfosfaatbuffer pH 7,5. Klik nu op baseline in de pro data control-software.

Meng vervolgens 200 µL van de enzymvoorraadoplossing met 1000 µL anaerobe, 100 mM kaliumfosfaatbuffer, pH 7.5. Vervang de oplossing in reservoir spuit A door de enzymoplossing.

Zet klep A in de software voor pro-databeheer op de stand drive. Klik op stop syringe empty. Duw de enzymoplossing uit drive-spuit A door het stroomcircuit door de corresponderende aandrijfwand handmatig omhoog te bewegen.

Stel de vertragingstijd in op 0,5 seconden en de acquisitietijd op 60 seconden. Controleer of alle spuiten van de aandrijfunit zijn gevuld met de overeenkomstige oplossingen en of de aandrijfstempels in contact staan met de zuigers van de spuiten. Zet vervolgens alle aandrijfventielen in de aandrijfpositie en klik op 'acquire' in de pro data control-software.

Verkrijg in drievoud spectrale gegevens van de geoxideerde vorm van het enzym. Vervang vervolgens de vloeistof in reservoirspuit B door een N-A-D-P-H-oplossing die 1,5 keer geconcentreerder is dan de enzymoplossing in spuit A. Zet de B-klep in de drive-positie en maak de stopspuit drie keer leeg en vul deze opnieuw, zoals eerder getoond in het bedieningspaneelvenster.

Stel de vertragingstijd in op 0,5 seconden. Bij een acquisitie van 20 seconden wordt de oplossing van de reservoir-spuit vervangen door de gezuurstofde buffer. Draai de C-klep naar de aandrijfpositie.

Spoel drie keer door in de pro data control software. Stel de vertragingstijd in op 15 seconden en de acquisitietijd op 900 seconden. Ga door met het verwerven van spectra tijdens de re-oxidatie van het volledig gereduceerde enzym in het stopped-flow apparaat.

De anaerobe reductie van SID A met N-A-D-P-H kan worden gevolgd door veranderingen in de redoxtoestand van de flavine te meten met behulp van absorptie bij 452 nm. Spectrale veranderingen worden in de loop van de tijd geregistreerd, van geoxideerd SID A tot het laatste spectrum van volledig gereduceerd SID A. De snelheid van deze enzymatische stap kan worden bepaald door de gegevens te fitten aan de juiste vergelijking. De oxidatiesnelheid en de reactie-intermediairen kunnen ook worden bepaald met behulp van de double mixing-modus van de stopped flow in deze reactie door AF Sid A. Het C4A-hydroxyflavine-intermediair wordt duidelijk gedetecteerd met een lambda max van 380 nm en het geoxideerde enzym heeft een lambda max van 450 nm.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier tot zes uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Denk eraan om te controleren of de oplossingen anaeroob zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel het relatieve als het ulceratieve ion van FLA onafhankelijk mono kan worden onderzocht voor verdere downstream-experimenten zoals snelle chemische analyse.

Quentin kan helpen om de aard van de tussenproducten te verduidelijken.