Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Het algemene doel van deze procedure is om humane IPS-cellen te genereren via retrovirus-gemedieerde overexpressie van OCT vier, SOX 2K LF vier en M met een GFP-reportersysteem. Dit wordt bereikt door eerst de juiste hoeveelheid afzonderlijke GFP-expresserende retrovirus toe te voegen. Vervolgens worden de GFP-expresserende virus-geïnfecteerde cellen overgebracht naar platen bedekt met 0,1% gelatine en muis embryonale fibroblasten.

De derde stap van de procedure is het vervangen van het medium door menselijk embryonaal stamcelcultuurmedium. Uiteindelijk worden GFP-gesilencede IPS-kolonies geïsoleerd die een vergelijkbare morfologie vertonen als menselijke embryonale stamcellen. Uiteindelijk tonen de resultaten de expressie van endogene pluripotente markers aan door immunofluorescente kleuring en R-T-Q-P-C-R.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden zoals lifestyle-kleuring met pluripotente oppervlaktemarker en observatie van een morfologische verandering is de gewenste iPad. Celkolonies kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd door gebruik te maken van het verlies van GFP-expressie als marker voor de pluripotente cellen Om de cultuur te beginnen. Menselijke fibroblasten in fibroblastenmedium een dag voor infectie, plateer eenmaal 10 tot de vijfde menselijke fibroblasten in één put van een zesputsplaat de volgende dag, aspibeer het medium om dode cellen te verwijderen en voeg twee milliliter vers fibroblastenmedium toe met vijf microgram per milliliter protaminesulfaat.

Voeg vervolgens zorgvuldig de juiste hoeveelheid van elk GFP-expresserend virus toe die overeenkomt met een infectiemultipliciteit van vijf. Incubeer de cellen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius één dag na infectie. Verwijder de virale supernatant en was drie keer met twee milliliter PBS.

Voeg vervolgens twee milliliter fibroblastenmedium toe drie dagen na infectie. Controleer de GFP-fluorescentie en vul de put aan met twee milliliter. Fibroblastenmedium de volgende dag plateer eenmaal 10 tot de vierde per vierkante centimeter van bestraalde muis embryonale fibroblast of meth feeder-cellen in fibroblastenmedium op een 10 centimeter petrischaal bedekt met 0,1% gelatine.

Incubeer de cellen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag los de geïnfecteerde menselijke fibroblasten met één milliliter van 0,05% tripsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 G. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter fibroblastenmedium en speel de cellen opnieuw op vooraf bedekt 0,1%gelatine met mfs. 24 uur later.

Vervang het medium door HESC-cultuurmedium en ververs het medium dagelijks. ESC-achtige kolonies zullen 20 tot 27 dagen na infectie beginnen te verschijnen na het verschijnen van ESC-achtige kolonies onder een fluorescentiemicroscoop. Controleer de afwezigheid van GFP-fluorescentie in een kolonie die een vergelijkbare morfologie vertoont als HSC's.

Gebruik een 10 microliter pipet. Kies individuele IPSC-kolonies en plaats ze in één put van een gelatine- en meth-gecoate 12-putsplaat en supplemeer met HESC-medium. Ververs het medium dagelijks door de cellen te passen door de plaat te wassen met één milliliter van DMM F 12.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter collageenase toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was de cellen twee keer met DM A MF 12. Voeg vervolgens twee milliliter vers HESC-medium toe.

Gebruik vervolgens een cellifter om de kolonies in kleine stukjes te breken en de resterende cellen van de plaat los te maken. Breng de gesuspendeerde stukjes kolonies over in één put van een gelatine- en MEF-gecoate zes. Putsplaat en incubeer gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius.

Om de cellen te controleren door immunofluorescentie. Was ze drie keer met PBS en fixeer ze met 4% paraldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS en perme ze met 0,2% tritton X 100 in PBS gedurende 30 minuten.

Blokkeer niet-specifieke binding door de cellen gedurende twee uur te incuberen met 3% BSA in PBS. Incubeer vervolgens de cellen met primaire antilichamen gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Was vervolgens de cellen drie keer met PBS en incubeer ze gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met secundair antilichaam.

Was de cellen drie keer met PBS tijdens de laatste wasbeurt. Voeg dappy toe en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Beeld de cellen af met behulp van een fluorescentiemicroscoop voor kwantitatief realtime.

PCR isoleer totaal RNA van humane IPC's afgeleid van humane fibroblasten. Gebruik een RNA-isolatiekit. Synthetiseer eerst streng cDNA met behulp van reverse transcriptase.

Gebruik het vervolgens als sjabloon voor QPCR om pluripotentiegenen te detecteren. Humane fibroblasten, BJ een die geïnfecteerd waren met een cocktail van retrovirussen die OCT vier, SOX twee, KLF vier en Mick dragen, hier getoond zijn de morfologische veranderingen die waargenomen werden tijdens herprogrammering van dag vijf. Vandaag 10, 14 en 21, beginnen de cellen de HESC-achtige morfologie te vertonen na 21 dagen en worden de IPC's herkend door GFP-fluorescentie.

Pluripotente stamcellen zoals ESC's en IPC's tot expressie brengen van de moleculaire machinerie om provirale genexpressie te onderdrukken. Echter, de retrovirale vectoren die hier worden gebruikt, tot expressie brengen van GFP samen met herprogrammeringsgenen door retrovirale LTR. Daarom worden cellen die continu GFP tot expressie brengen als cellen beschouwd die transgenen tot expressie brengen zonder provirale gen-silencing, zoals hier getrouw wordt gezien, herprogrammeerde IPSC-kolonies die het pluripotentie moleculaire netwerk verwerven, tonen de afwezigheid van GFP-expressie.

Deze figuur toont immunohistologische analyse van kolonies afgeleid van Detroit 5 51 fibroblasten met antilichamen tegen TRA 180 1, TRA een 60 SSEA vier T vier en nano zoals succesvol kan worden gezien. Herprogrammeerde IPC's tot expressie brengen van al deze markers. Bovendien werd kwantitatieve R-T-P-C-R uitgevoerd om genexpressie te analyseren en werd onthuld dat T vier SOX twee, KLF vier M en nano significant verhoogd