Name: Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer menselijke iPSCs genereren via retrovirale transductie met GFP-reportersysteem. Deze methode maakt eenvoudige identificatie van geherprogrammeerde kolonies mogelijk voor stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door Yale School of Medicine and Child Health Research Award van Charles Hood Foundation.

1. Herprogrammering door Retrovirus uitdrukken herprogrammeren factoren <ol><li> Menselijke fibroblasten worden gekweekt in fibroblast medium (10% FBS in DMEM met Pen / Strep). </li><li> Een dag voor infectie, plaat 1x10 5 menselijke fibroblasten in een putje van een 6-wells plaat. </li><li> Zuig medium om de dode cellen te verwijderen en 2 ml vers fibroblast medium toe te voegen. Voeg protaminesulfaat bij een uiteindelijke concentratie van 5 pg / ml. </li><li> Voorzichtig toevoegen geschikte hoeveelheid van elk GFP-expressie virus overeenkomt met een multipliciteit van infectie (MOI) 5 5. </li><li> Op een dag na infectie, verwijder dan de virale supernatant, Was driemaal uit met 2 ml PBS, voeg 2 ml fibroblast medium. </li><li> Drie dagen na infectie, controleer dan de GFP-fluorescentie en vervult de goed met 2 ml fibroblast medium. </li><li> Vier dagen na infectie plaat 1x10 4 / cm 2 bestraalde muis embryo fibroblasten (MEF) feeder cellen fibroblast medium op een10 cm petrischaal bekleed met 0,1% gelatine. Incuberen bij 37 ° C geroerd. </li><li> Vijf dagen na infectie los geïnfecteerd humane fibroblasten met 1 ml 0,05% typsin / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 200 g. Zuig het medium en resuspendeer de cellen met 10 ml van fibroblast medium. Breng de cellen in een voorgecoate 10 cm plaat. </li><li> Na 24 uur, vervang dan de medium met hESC kweekmedium (20% Knock-Out serum vervanging, DMEM/F12, 0,1 ml Niet-essentiële aminozuren, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutamaat, beta-merceptoethanol). Dagelijks veranderen het medium. ESC-achtige kolonies start te verschijnen op dag 20-27 na de infectie. </li></ol> 2. Isolatie en uitbreiding van iPSCs <ol><li> Onder een fluorescentiemicroscoop, controleren op de afwezigheid van GFP-fluorescentie in een kolonie die een vergelijkbare morfologie toont aan hESC &#39;s. </li><li> Met behulp van een pipet 10 ul, pak individuele IPSC kolonies en plaats ze in een putje van een gelatine-en MEF-CoAted 12-well plaat en aangevuld met hESC medium. Dagelijks veranderen medium. </li><li> Voor passages de plaat was 1 ml DMEM/F12, voeg 0,5 ml collagenase, en incuberen gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Twee keer Spoel de cellen met DMEM/F12. </li><li> Voeg 2 ml vers hESC medium. Met behulp van een cel lifter, breken de kolonies in kleine stukjes en los resterende cellen van de plaat. </li><li> Breng de geresuspendeerde stukken kolonies in een putje van een gelatine-en MEF beklede 6-wells plaat. </li></ol> 3. Immunofluorescentie Analyse van pluripotente Markers <ol><li> Was de cellen drie keer met PBS en vast met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voorzichtig te wassen van de cellen drie keer met PBS en permeabilize met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten. </li><li> Blokkeren van niet-specifieke binding door incubatie cellen met 3% BSA in PBS gedurende twee uur. </li><li> Overnacht incuberen van de cellen met primaire antilichaam bij 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Was de cellen drie keer met PBS en geïncubeerd de cellen met specifieke secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur afscherming van licht. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS en voeg DAPI de laatste wassen gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Detecteer de kleuring met een fluorescentie microscoop. </li></ol> 4. Kwantitatieve real-time PCR-test voor de pluripotente Markers <ol><li> Isoleer totaal RNA uit de menselijke iPSCs uit humane fibroblasten met RNeasy kit Qiagen&#39;s. </li><li> Samenstel de eerste streng cDNA met SuperScript II Reverse Transcriptase. </li><li> Voer qPCR om pluripotentie genen met behulp van primers eerder gemeld op te sporen. 6 </li></ol> 5. Representatieve resultaten <ol><li> Morfologische verandering tijdens de herprogrammering We geïnfecteerd menselijke fibroblasten BJ1 en Detroit 551 met een cocktail van retrovirussen die OCT4, SOX2, KLF4 en MYC,en waren in staat om morfologische veranderingen te detecteren tijdens de herprogrammering (figuur 1). Eenentwintig dagen na infectie, herkennen we kleine IPSC kolonies door hun hESC-achtige morfologie. Verder herkennen we iPSCs door de GFP-fluorescentie. Pluripotente stamcellen, zoals de SER&#39;s en iPSCs, drukken de moleculaire machinerie van de provirale genexpressie onderdrukken 7-9. Onze unieke retrovirale vector uitdrukt GFP samen met de herprogrammering genen door retrovirale LTR. Zo worden de cellen continu uiten GFP als transgenen te uiten zonder provirale gene silencing. Trouw geprogrammeerd IPSC kolonies die de pluripotentie moleculair netwerk te verwerven blijkt de afwezigheid van GFP expressie (Figuur 2) 10. </li><li> Karakterisering van pluripotentie menselijke iPSCs We analyseerden kolonies afgeleid van Detroit-551 fibroblasten via immunohistochemie met Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 en NANOG antilichamen ( <strong&gt; Tabel 2). Succesvol geprogrammeerd iPSCs uiten van deze merkers (Figuur 3A). Ook geanalyseerd genexpressie via kwantitatieve RT-PCR analyse. We zagen dat de expressie van OCT4, SOX2, KLF4, MYC en NANOG aanzienlijk werd verhoogd ten opzichte van het ouderlijk fibroblast cellen, maar in verhouding met die van H9 hESC &#39;s (Figuur 3B). </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Figuur 1. Morfologische veranderingen van het retrovirus-geïnfecteerde menselijke fibroblasten. (AD) Progressive morfologische verandering in kolonies van Detroit-551 fibroblasten die besmet zijn met herprogrammering factoren. Dag 5 (A), dag 10 (B), dag 14 (C), dag 21 (D). Cellen geven de hESC-achtige morfologie na 21 dagen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger GFP fluorescentie expressie in cellen ondergaan herprogrammering. </strong&gt; BJ en Detroit 551 fibroblasten werden besmet met retrovirus uiten vier herprogrammering factoren 4 en geïncubeerd in hESC medium voor vier weken. BJ fibroblasten (A, B) en Detroit 551 (C, D) vertonen gelijkaardige morfologische. Vanaf dag 21, GFP negatieve kolonies beginnen te vormen, die staan ​​voor de bonafide iPSCs 10. (E, F) tonen getransformeerd Detroit 551 cellen die geen behandeling hebben ondergaan juiste herprogrammering. (A, C, E) kolonies in fase contrast. (B, D) op de juiste geherprogrammeerd cellen die de GFP silencing te laten zien. (F) heldere GFP expressie van getransformeerde kolonie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Figuur 3. Karakterisering van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. (A) Menselijke 551-iPS-K1 celkolonies uiten markers gebruikelijk om pluripotente cellen. DAPI kleuring geeft het totale celinhoud per veld. (B) Kwantitatieve real-time-PCR (RT-qPCR) voor de expressie van OCT4, SOX2, KLF4, MYC in ouderlijke fibroblast, 551-iPS-K1 iPSCs, en H9 menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s). Gegevens werden genormaliseerd tegen β-actine-gen huishoudelijke en uitgezet ten opzichte van het expressieniveau in de parentale fibroblastcellen 4.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Wij hebben niets te onthullen.</p

Expressie van vier transcriptiefactoren herprogrammeert humane fibroblasten met iPSCs. Veel pogingen werden gedaan om de menselijke iPSCs behulp van niet-integratie of niet-genetische benaderingen van klinisch veilige iPSCs genereren. Tot nu toe, deze methoden blijkt extreem lage efficiëntie en de verdere optimalisatie van de reproduceerbaarheid 11-14 te verbeteren. Retro-of lentivirale methoden gemakkelijk worden gebruikt voor het afleiden en toe te passen iPSCs voor menselijke in vitro ziekte-model...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;ethanol (14.3 M) of MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel 1. Kweekmedium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatine, varkens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>MEF feeder-cellen</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscopie: omgekeerde microscoop met GFP-filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel 2. Reagentia en apparatuur&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) met behulp van retrovirale vector met gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) zijn pluripotent en een onschatbare cellulaire bronnen voor in-vitro-en vaatziekten modellering en regeneratieve geneeskunde 1. Het is eerder aangetoond dat de menselijke somatische cellen kunnen worden geherprogrammeerd om pluripotentie door ectopische expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4 en Myc) en worden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 2-4. Net als hESC &#39;s, de menselijke iPSCs zijn pluripotent en een potentiële bron voor autologe cellen. Hier beschrijven we het protocol voor de menselijke fibroblast cellen te herprogrammeren met de vier herprogrammering factoren gekloneerd in GFP-bevattende retrovirale backbone 4. Met behulp van de volgende protocol, genereren we de menselijke iPSCs in 3-4 weken in de menselijke cultuur ESC staat. Human IPSC kolonies lijken op hESC &#39;in morfologie en aangeven dat de GFP als gevolg van retrovirale transgene silencing. IPSC kolonies mechanisch geïsoleerd onder een fluorescentie microscoie zich op een vergelijkbare manier als hESC &#39;s. In deze cellen zien wij de expressie van meerdere genen en pluripotentie oppervlaktemerkers.

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Menselijke embryonale stamcellen (hESC's) zijn pluripotent en vormen een onschatbare cellulaire bron voor in vitro ziektemodellering en regeneratieve geneeskunde1. Er is ...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke iPS-cellen te genereren via retrovirale overexpressie van OCT4, SOX2, KLF4 en MYC met een GFP-rapportagesysteem. Dit wordt bereikt door eerst de juiste hoeveelheid individueel GFP-exprimerend retrovirus toe te voegen. Vervolgens worden de met het GFP-exprimerende virus geïnfecteerde cellen overgebracht naar platen gecoat met 0,1% gelatine met embryonale muis-fibroblasten.De derde stap van de procedure is het vervangen van het medium door kweekmedium voor menselijke embryonale stamcellen. Tot slot worden GFP-gestillede IPS-koloniën geïsoleerd die een vergelijkbare morfologie vertonen als menselijke embryonale stamcellen. Uiteindelijk tonen de resultaten de expressie van endogene pluripotentiemarkers via immunofluorescente kleuring en R-T-Q-P-C-R.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals levendskleuring met pluripotente oppervlaktemarkers en het observeren van morfologische veranderingen, is de wenselijke iPad. Celkolonies kunnen eenvoudig worden geïsoleerd door het verlies van GFP-expressie als marker voor de pluripotente cellen te gebruiken om de cultuur te starten. Zaai menselijke f

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

TALEN-gemedieerde genre-editing op het veilige haven-locus AAVS1 maakt hoog-efficiënte toevoeging van transgenen mogelijk in menselijke iPSC's. Dit protocol beschrijft de procedures voor het voorbereiden van iPSC's voor TALEN en donorvector-levering, het transfecteren van iPSC's en het selecteren en isoleren van iPSC-klonen om gerichte integratie van een GFP-gen te bereiken voor het genereren van reporter-lijnen.

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Leer menselijke iPSCs genereren via retrovirale transductie met GFP-reportersysteem. Deze methode maakt eenvoudige identificatie van geherprogrammeerde kolonies mogelijk voor stamcelonderzoek.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP (Video) | JoVE Journal

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Meer video's verkennen