Name: Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Leer een fenotypische screeningsmethode om Toxoplasma gondii-mutanten met temperatuurgevoelige egress-defecten te isoleren. Deze aanpak verrijkt efficiënt mutanten voor onderzoek naar parasitaire uitstootmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Amerikaanse Heart Association Scientist Development Grant 0635480N en de National Institutes of Health onderzoek te verlenen AI081220. BIC wordt ondersteund door een Tempeliers Eye Foundation onderzoek te verlenen.

Overzicht Protocollen aan eerste definiëren dosering van het mutageen leidt tot een 70% doden van parasieten (protocol 1). De volgende procedure wordt verstrekt aan de uitgang geïnduceerde mutanten verrijken van een gemutageniseerde parasiet pool (protocol 2, figuur 2). Dit wordt gevolgd door een protocol bij de incidentie van uitgang mutanten te testen in de verrijkte zwembad, of aan de uitgang fenotype in individuele mutanten (protocol 3) te valideren. Ten slotte wordt een protocol verstrekt aan een parasiet klonen genereren uit verrijkt populaties door beperkende verdunning (protocol 4). 1. Titratie van de mutagene stof Wees extra voorzichtig, zoals dubbele handschoenen, bij het werken met zeer mutagene stoffen en vloeistoffen. Gescheiden in te zamelen vloeibaar afval voor de juiste afvoer. <ol><li> Inoculeer T25 weefselkweekflessen samenvloeiing met de menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen met 1 ml vers gelyseerd tachyzoites en groeien 18-25 uur bij 37 °; C onder 5% CO2 in ED1 medium (D-MEM aangevuld met 1% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 0,2 mM L-glutamine, 50 E / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 0,25 ug / ml amfotericine B ). Zie Roos et al.. voor de algemene groei en media van de HFF cellen en parasieten 21. </li><li> Vervangen medium met 10 ml 0,1% Foetaal runderserum medium (verdund 1:10 in ED1 D-MEM) en laat in bevochtigde 37 ° C incubator onder 5% CO2 (zogenaamde &quot;37 ° C incubator&quot; van hier) gedurende 10 min . </li><li> Voeg 0, 12,5, 25, 50 of 100 ul ENU (1 M Stock in DMSO) of EMS (1 M Stock in DMSO) per vat (mutageen werkverdunningen zijn 1,25, 2,5, 5 en 10 mM, respectievelijk). Voeg DMSO 100 ul per fles. Incubeer 4 uur in een 37 ° C incubator. </li><li> Was driemaal 10 seconden bij kamertemperatuur door spoelen monolaag met 10 ml koud PBS (voorgekoeld bij 4 ° C). </li><li> Voeg 5 ml PBS, schraap de monolaag los met een rubberen spatel (cel scraper), langs de cellen geschraapt door middel van een 26,5 G naald om de parasiet fysiek te verwijderen uit de fibroblasten (clip van de as buiten de naald met zware schaar om niet bloot de naald), en het filter met 3,0 micrometer polycarbonaat filter. Meerdere naald passages zal de efficiëntie van het vrijgeven van parasieten van de gastheercel. </li><li> Tel de parasiet concentratie met behulp van een hemocytometer. Laat de parasieten gedurende 5 min in de hemocytomer vestigen vóór het tellen. </li><li> Verdun de parasieten tot 10.000 parasieten per 3 ml in ED1 (voor 10 ml 33.333 parasieten nodig zijn). </li><li> Goed Inoculeer een in een 6 wells plaat met 3 ml van het verdunde parasieten (met 10.000 parasieten). Serieel verwatering van de parasieten 10-voudig over 3 putten in een 6-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen met 2,7 ml ED1 door de overdracht van 300 ul uit de eerste put. Laat platen ongestoord in de 37 ° C incubator gedurende 7 dagen. </li><li> Zuig medium, vast 15 min met 3 ml / putje 100% ethanol, vlekmet 3 ml / putje kristalvioletoplossing (12,5 g kristalviolet in 125 ml ethanol met 500 ml 1% ammoniumoxalaat) gedurende 15 minuten spoelen met 3 ml / putje PBS (1 minuut) en drogen. Alle bij kamertemperatuur. </li><li> Tel plaques en selecteer de concentratie van de mutagene stof die nodig is om overleving van 30% van de blootgestelde parasieten (70% doden van de dosering: zie figuur 1) te bereiken. Een dosering van 70% doden is historisch gezien 14 gebruikt en veroorzaakt minder dan 100 puntmutaties per genoom (Farrell, Marth, Gubbels et al.., Manuscript ingediend). </li></ol> 2. Verrijking van uitgaand mutanten (figuur 2) <ol><li> Voer mutagenese zoals hierboven beschreven gebruik van een mutageen dosering het induceren van 70% doden. Grow up van de gemutageniseerde bevolking voor een passage in een nieuwe fles van gastheercellen. </li><li> Infecteren van een T25, HFF samenvloeiende weefselkweek kolf met 120.000 vers gelyseerd parasieten van een gemutageniseerde populatie in 10 ml ED1. Incubeer 2 uur in een 35 ° C incubator onder 5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde &quot;35 ° C incubator&quot;). </li><li> Zuig medium en 10 seconden spoelen met 10 ml koud PBS en 10 ml ED1 medium aangevuld met 25 mg / ml dextransulfaat (DS) 13. Incubeer 26 uur in een 40 ° C incubator onder 5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde &quot;40 ° C incubator&quot;). </li><li> Bereid te werken oplossing van uitgang enhancers. Verdun de uitgang inductor naar keuze bij het werken concentratie in een 15 ml Falcon buis met 10 ml HBSSc aangevuld met 25 mg / ml DS. Pre-warm de verdunningen gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 voor het bewerken concentraties. </li><li> Zuig medium van de parasiet-geïnfecteerde kolven en voeg voorverwarmde egress inductor oplossing. Incubeer in het 37 ° C incubator gedurende de aangegeven tijdsduren in tabel 1. </li><li> Zuig medium en spoel 10 seconden met 10 ml koud PBS en voeg dan 10 ml ED1 aangevuld met 25 mg / ml DS en 50 uM pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC: add 5 pi 100 mM PDTC Stock in PBS) 13. Incubeer 5 uur in een 35 ° C incubator. </li><li> Zuig medium en spoel een keer 10 seconden met 10 ml PBS (kamertemperatuur) en voeg dan 10 ml ED1 medium. Plaats kolven in de 35 ° C incubator tot parasieten te vernietigen de monolaag: dagelijks schudkolven. Dit herstel duurt ongeveer 7 dagen. </li></ol> 3. Validatie van de mutant fenotype door de uitgang assays Na het uitvoeren van de verrijking scherm en het opgroeien van de bevolking verrijkt voor een passage in HFF cellen, de fenotypes moeten worden bevestigd door een uitgang assay 11,13. Deze test moet ook worden gebruikt om enkele klonen te valideren na protocol 4. <ol><li> Inoculeer 20.000 parasieten per well in een 24-wells plaat met samenvloeiende HFF cellen gekweekt op dekglaasjes (1 ml ED1 medium per well). Incubeer 8 uur in een 35 ° C incubator vervolgens over in een 40 ° C incubator voor 24 uur. </li><li> Wassen met 1 ml / putje PBS (10 seconden bij kamertemperatuur). Voeg 1 ml uitgang inductoren (voorzien van een DMSO alleen negatieve controle), pre-opgewarmd en verdund in HBSSc en incubeer gedurende de tijden beschreven in tabel 1. </li><li> Zuig medium en vast met 1 ml / putje werd 100% methanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Als ouder parasieten hebben een autofluorescente eiwit werden gebruikt voor de mutagenese, ga dan naar # 3.5 stap 13. Als niet-fluorescerend eiwit tot expressie parasieten werden gebruikt als ouderlijn, vlekken op het vaste dekglaasjes met Diff-Quick vlek 1 min bij kamertemperatuur 11. </li><li> Was 5 min met 1 ml / putje PBS in 24-putjes plaat bij kamertemperatuur. </li><li> Voor fluorescerend eiwit tot expressie parasieten: snel Spoel de dekglaasje in DDH 2 O (dompelen) en op dia&#39;s onder gelmount om de fluorescentie-signaal te beschermen. Voor Diff-Quick lood parasieten, was 10 seconden in 100% ethanol en laat de lucht drogen voor de montage op dia. </li><li> Een (fluorescentie) microscoop met een40-60x doel telt het percentage van de vacuolen uit waren hadden ten opzichte van de vacuolen dat bleef intracellulaire (zie figuur 4). </li></ol> 4. Kloon egress mutanten door beperkende verdunning Na validatie van het fenotype van de verrijkte uitgang mutant bevolking met behulp van protocol 3, de polyklonale populatie moet worden gekloond om enkele parasiet klonen te verkrijgen. <ol><li> Tel parasiet populatie in een hemocytometer en verdun tot een concentratie van 500 parasieten per ml in ED1 medium. </li><li> In een 384-wells plaat met daarin een confluente monolaag van HFF cellen, vervangen door het medium met 40 ul / putje van ED1 medium met behulp van een multi-channel pipet. Zoals getoond in figuur 5, kunnen vier polyklonale populaties gekloneerd per plaat als volgt: pipet 40 ul / putje verdunde mutant 1 in putten C3-C12, mutant 2 in putten C13-C22, mutant 3 in putten H3-H12 en mutant 4 in putten H13-H22 (eind volume in putten is nu 80 pi). Met behulp van een multi-channel pipet, pipet de solution en neer 5 keer, vervolgens over 40 pi de rij onder de startrij (van rij C naar D of rij H I). Verder deze 2-voudige seriële verdunningen door rij G (mutanten 1 en 2) of rij N (mutanten 3 en 4). Gooi de extra 40 pi van de laatste rij. Incubeer in een 35 ° C incubator gedurende 7-10 dagen zonder verstoring van de plaat. </li><li> Controleer de putjes op een omgekeerde microscoop met 10 tot 20 doel voor de aanwezigheid van enkelvoudige platen, zichtbaar &quot;gaten&quot; in de monolaag. </li><li> Kies 4 putten per mutant met een plaquette en breng de parasieten in een weefselkweek fles samenvloeiing met HFF cellen en gevuld met ED1 medium. Grow de parasieten in een 35 ° C incubator, schud de flesjes dagelijks aan de extracellulaire parasieten verspreiden. Dit duurt gewoonlijk 7 dagen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten De mutagene ENU en EMS zijn niet stabiel wanneer ze worden bewaard gedurende een lange periode van tijd. Daarom testen mutagene kracht vande voorraden is van cruciaal belang om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Typische resultaten titratie en doden curves voor ENU en EMS in figuur 1. Wordt echter aanbevolen om plaque assays uitgevoerd voor elke mutagenèse experiment na te gaan of de juiste dosis werd gebruikt. Voor het behoud van de diversiteit in de gemutageniseerde parasiet bevolking, is het belangrijk door te gaan met de uitgang mutant scherm zo snel mogelijk. Doorgaans wordt een passage van de parasieten in een nieuwe fles uitgevoerd om te laten de overlevende parasieten te herstellen voordat ze naar voren met het scherm. Moet worden bedacht dat dit te doen zal resulteren in verdeling van de mutanten. Daarom kan niet uitgesloten worden dat meerdere klonen mutanten geïsoleerd na het voltooien van de volledige procedure exact hetzelfde genotype bevatten. Om te voorkomen dat het isoleren van de dezelfde mutant meerdere keren is het aanbevolen om slechts een enkele uitgang mutant per mutagenese te isoleren, tenzij hun fenotypen (bv. differentiële uitgang inductor gevoeligheden) zijnzeer verschillend. Aan de andere kant niet elk scherm resultaten isolatie van mutanten met het gewenste fenotype. Met name de Ca2 +-ionofoor A23187 resistent fenotype is zeldzaam zijn meerdere mutagenese experimenten en schermen te isoleren een uitgang mutant. Daarom wordt aanbevolen tot 5-10 mutagenese en scherm experimenten uit te voeren in parallel. Verrijking kracht van het scherm werd getest door het mengen van een bekende uitgang mutant met het wild-parasieten in verschillende verhoudingen. Deze mixen werden onderworpen aan het scherm en de incidentie van het mutante fenotype van de verrijkte bevolking werd beoordeeld. Door het gebruik van wild-type parasieten uiten cytoplasmatische RFP en een mutant lijn te drukken cytoplasmatisch YFP de incidentie snel kunnen worden vastgesteld door middel van flowcytometrie (figuur 3) 13. De resultaten tonen aan dat mutant fenotypen routinematig worden verrijkt met 80% zuiverheid, te beginnen met een uitgang mutant parasiet 10.000 wild-type parasites 13. Wanneer de uitgang mutant: wild-type parasiet start verhouding 1:100.000 parasieten de geïsoleerde populatie slechts 1-2% (1:100) uitgang mutanten. Daarom is de verrijking kracht van het scherm is 1.000-voudig. Omdat het scherm begint met enting van 120.000 parasieten, van die typisch 70% levensvatbaar zijn, hebben we meestal voeren twee ronden van verrijking. De geïsoleerde parasieten zijn opgegroeid tussen de verrijking rondes. Deze procedure leidt tot een 100% mutant bevolking ook bij het starten met 1:1.000.000 uitgang mutant: wild-type parasieten. De uitgang test te valideren en te karakteriseren van de fenotypes is een veelvoud van gastheercel infectie die differentiatie van de individuele vacuolen mogelijk maakt. Dit is vooral van belang bij het analyseren van omstandigheden met hoge percentages van uitgang als de individuele parasieten zijn versnipperd. Zoals getoond in figuur 4 als waren hadden populaties niet goed gescheiden is het gemakkelijk te onderschatten percentagevan uitgang door het tellen twee waren hadden vacuoles als een vacuole. Aangezien de uitgang en de invasie zijn processen, en een aantal temperatuurgevoelige fenotypes vertonen een milde fenotype bij de lagere temperatuur, zullen niet alle mutanten hebben soortgelijke invasie efficiëntie. Dergelijke mutanten moet dus worden ingeënt tegen een aantal maal hogere doseringen om een ​​voldoende hoge dichtheid vacuole te verkrijgen voor een nauwkeurige beoordeling van hun uitgang fenotype. Bovendien, sommige uitgang inductoren niet efficiënt te stimuleren uitgang van vacuolen met vier parasieten of minder. Als zodanig is het belangrijk dat vacuoles acht parasieten of meer bevatten bij het starten van de uitgang assay. In ons lab hebben we het scherm mutanten geïsoleerd met een bepaalde uitgang versterker tegen andere uitgang enhancers. Door een profiel hun cross-reactiviteit van de mutanten kunnen worden ingedeeld in verschillende klassen. Ten slotte zullen niet alle uitstappen mutanten zijn temperatuurgevoelig. In het bijzonder mutanten geïsoleerd met uitgang inductoren triggering stappen voor de release van intracellular Ca2 + gevoelig zijn niet temperatuur gevoelig fenotype. Dit komt door de parallelle trajecten die kunnen leiden tot uittreden voor het signaal convergeert de vrijmaking van intracellulair Ca2 +. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figuur 1. Chemische mutageen dosistitratie. A. plaque assays uitgevoerd in een 6-wells plaat met verschillende concentraties EMS en verschillende aantallen parasieten per ook aangegeven. De witte vlekken parasiet plaques gevormd in de HFF monolaag. B, C. overlevingscurven van parasieten bij blootstelling aan verschillende doseringen EMS (B) en ENU (C). Overleving werd bepaald door plaque assays. Een dosering induceren 70% gedood wordt gekozen voor mutagenèse experimenten. Gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten + / - standaardafwijking worden weergegeven. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figuur 2. Schematische weergave van de uitgang mutant verrijking scherm. De temperatuur wordt aangegeven op de y-as, terwijl de tijd progressie wordt vertegenwoordigd door de x-as. Green parasieten reflecteren uitgang mutant parasieten, rode parasieten reflecteren wild-type parasieten. De timing van veranderingen ondergaan en stimulering door uitgang inductor aangegeven bij de bovenkant en is aangeduid met pijlen de blauwe lijn weerspiegelt de temperatuurprofiel. Aangenomen van Eidell et al.. 13. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figuur 3. Typische verrijking van uitgang mutant fenotypen. Enrichment resultaten van een uitgang mutant gemengd wild-type parasieten in verschillende verhoudingen (x-as). Het percentage uitgang mutant fenotypen in de populatie gegroeid na het scherm wordt uitgezet op de y-as en werd bepaald door flow cytometrie (uitgang mutant parasieten uitgedrukt cytoplasmatische YFP wild-type parasieten uitgedrukt cytoplasmic RFP). Resultaten van drie onafhankelijke experimenten worden vertegenwoordigd door rood, blauw en groen datapunten. Aangenomen van Eidell et al.. 13. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figuur 4. Typische resultaten van een uitgang assay. A. Pijlen geven vier intact vacuoles met 4-8 parasieten. B. Pijlen geven vier groepen van verspreide parasieten als gevolg van vier onafhankelijke uit waren hadden vacuolen. Egress werd geïnduceerd door A23187 (B) of DMSO als een negatieve controle (A). Parasieten drukken cytoplasmatische YFP 22. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figuur 5. Serial verwatering voor klonale parasiet lijnen. Vier polyklonale populaties (rood, blauw, geel, groen) worden serieel verdund in een 384-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen. Rij C en ik ontvang 10 parasieten per goed enzijn 2-voudig verdunde (40 pi + 40 pi) tot rijen H en N resp. De schaduw van grijs geeft aan het dalende aantal parasieten per putje. Meestal worden enkele klonen te vinden in rijen DF en JL. <table border="1"><tbody><tr><td> Samenstelling </td><td> Voorraad </td><td> Werkconcentratie </td><td> il nodig T25 (10 ml) </td><td> Incubatie tijd (min) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M in DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> ethanol </td><td> 190 standaardsterkte </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 1 pM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin * </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin kan niet worden gebruikt in de verrijkenment scherm als de parasieten niet overleven nigericin stimulatie, alleen nigericin gebruiken in de validatie van uitgang mutanten. Tabel 1. Egress inductoren gebruikt in procedures. Verdunnen in 10 ml HBBSc met 25 mg / ml DS voor het scherm, of geen DS voor mutant validatie (egress test). Alle verbindingen van Sigma-Aldrich.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

<html> De beschreven protocol biedt een efficiënte methode om Toxoplasma mutanten te isoleren met een uitgang defect. We hebben succes geïsoleerd mutanten langs verschillende stappen van de uitgang route, waarvan een dubbele invasie fenotype 13. Mogelijke effecten op de invasie kan worden bepaald met behulp van de zogenaamde rood-groen-test, die zich onderscheidt van niet-inval parasieten binnengevallen door differentiële antilichaam kleuring 23,24. Zowel invasie en uitgang assays het kan g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M Stock in DMSO, bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M Stock in DMSO, bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Dextransulfaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM Stock in PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> Merck Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Filterhouder </td><td> Cole Parmer- </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 pm polycarbonaatfilter </td><td> Whatman papierSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijk </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-incubatoren </td><td> Diverse fabrikanten </td><td></td><td> Bevochtigd, 5% CO2, 35, 37 en 40 ° C </td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Diverse fabrikanten </td><td></td><td> Idealiter omgekeerd, breed veld met 63x of 100x olie doel </td></tr></tbody></table> HBSSc (volgens Black et al. 11.) <ul><li> 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalogusnummer SH30588) </li><li> 100 pi 1 M MgCI2 (100 mM end) </li><li> 100 pi 1 M CaCl2 (100 mM end) </li><li> 2,0 ml 1 M Hepes pH 7,3 (20 mM einde) </li><li> 84 mg NaHCÛ3 (10 mM end) </li></ul>

een genetische screen te isoleren toxoplasma gondii host-cel egress mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

De wijdverspreide, obligaat intracellulaire, protozoaire parasiet Toxoplasma gondii veroorzaakt opportunistische ziekte in immuno-gecompromitteerde patiënten en veroorzaakt aangeboren afwijkingen bij congenitale infectie. De lytische replicatiecyclus wordt gekenmerkt door drie stappen: 1. actief invasie van een kern gastheercel, 2. replicatie in de gastheercel; 3. actieve uitgang van de gastheercel. Het mechanisme van de uitgang wordt steeds meer gewaardeerd als een uniek, sterk gereguleerde proces, dat nog steeds slecht begrepen wordt op moleculair niveau. De signaalwegen die ten grondslag liggen uitgang werden gekenmerkt door het gebruik van farmacologische stoffen die op verschillende aspecten van de trajecten 1-5. Als zodanig verschillende onafhankelijke triggers van uitgang zijn aangewezen, die allemaal samen op het vrijkomen van intracellulaire Ca 2 +, een signaal dat ook is van cruciaal belang voor de gastheercel invasie 6-8. Dit inzicht op de hoogte van een kandidaat gen aanpak die heeft geleid tot de identificatieMOETEN VOLDOEN van planten, zoals calcium, afhankelijk proteïne kinase (CDPK) betrokken bij uitgang 9. Daarnaast hebben een aantal recente doorbraken in het begrijpen van uitgang is gemaakt met behulp van (chemische) genetische benaderingen 10-12. Om de rijkdom van de farmacologische informatie te combineren met de toenemende genetische toegankelijkheid van Toxoplasma we onlangs een scherm mogelijk maakt de verrijking voor de parasiet mutanten met een defect in gastheercel uitgang 13. Hoewel de chemische mutagenese met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethyl methaansulfonaat (EMS) is gebruikt voor tientallen jaren in de studie van Toxoplasma biologie 11,14,15, pas onlangs heeft genetische kaart brengen van mutaties ten grondslag liggen aan de fenotypes routine 16 -18. Bovendien, door het genereren van temperatuurgevoelige mutanten, kan essentiële processen worden ontleed en de onderliggende genen direct geïdentificeerd. Deze mutanten gedragen als wild-type onder de permissieve temperatuur (35 ° C), maar niet proliferate de beperkende temperatuur (40 ° C) als gevolg van de mutatie in kwestie. Hier tonen een nieuw fenotypische screening methode mutanten te isoleren met een temperatuurgevoelige uitgang fenotype 13. De uitdaging voor uitgaand schermen is af te scheiden uit waren hadden van niet-uit waren hadden parasieten, die wordt bemoeilijkt door een snelle re-invasie en de algemene kleverigheid van de parasieten aan gastheercellen. Een eerder vastgestelde uitgaand scherm was gebaseerd op een omslachtige reeks biotinylatie stappen om intracellulair te scheiden van extracellulaire parasieten 11. Met deze methode ook niet het genereren van voorwaardelijke mutanten wat resulteert in zwakke fenotypes. De hier beschreven methode overwint de sterke binding van egressing parasieten door er een glycan concurrent dextransulfaat (DS), die voorkomt parasieten kleven aan de gastheercel 19. Bovendien zijn extracellulaire parasieten specifiek gedood door pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC), die intracellulaire parasieten verlaatongedeerd 20. Daarom, met een nieuwe fenotypische scherm om specifiek parasiet mutanten te isoleren met defecten in geïnduceerde uitgang, kan de kracht van de genetica nu worden ingezet om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen gastheercel uitgang te ontrafelen.

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van hoe<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses uit de gastheercel. Protocollen worden verstrekt aan chemisch mutageniseren parasieten, te verrijken voor mutanten met defecten in geïnduceerde uitgang en valideren het fenotype van gekloonde mutanten.

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

De wijdverspreide, obligate intracellulaire protozoaire parasiet Toxoplasma gondii veroorzaakt opportunistische ziekten bij immuungecompromitteerde patiënten en veroorzaakt congenitale...

Deze video illustreert een nieuwe fenotypische screeningsmethode om mutanten met een temperatuurgevoelig egress-fenotype te isoleren. Mutageen en parasieten worden toegevoegd aan culturen van met toxoplasma geïnfecteerde menselijke foreskin-fibroblasten. Gedurende twee uur worden de niet-invallende parasieten verwijderd en wordt de kolf overgebracht naar 40 °C om de ontwikkeling van het fenotype te induceren.Na 26 uur bevatten de vacuolen acht tot 16 parasieten. Vervolgens worden de cellen gestimuleerd met verbindingen die egress induceren. Mutante parasieten met een defect in de egress blijven intracellulair, terwijl wildtype parasieten zullen egresseren in het medium.De wildtype parasieten worden verwijderd door middel van wassing en de resterende cellen worden opnieuw geïncubeerd bij 35 °C om de mutante populatie te verrijken. Ten slotte wordt het mutante fenotype geverifieerd en worden individuele parasietklonen uit de verrijkte populatie geïsoleerd via limiterende verdunning. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de bio-inhalatiemethode, is dat de specifieke verrijking van egress-mutanten veel efficiënter is.We hebben de ID voor deze methode voor het eerst verkregen toen we een egress-mutant identificeerden uit een panel van mutanten met groeidefecten. Met behulp van die mutant optimaliseren we de screeningsprocedure door deze in verschillende verhoudingen te mengen met wildtype-parasieten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Bradley Coleman, een postdoc in mijn lab.Deze procedure maakt gebruik van sterk mutagene verbindingen en vloeistoffen, evenals de infectieuze parasiet Toxoplasma gondii. Het gebruik van geschikte beschermende uitrusting, waaronder een laboratoriumjas, dubbele handschoenen en een biologische veiligheidskast, is essentieel. Alle geproduceerde vloeibare afvalstoffen moeten apart worden verzameld voor een correcte afvoer.Begin met het inoculeren van confluente humane foreskin fibroblasten of HFF-cellen met één milliliter vers gelyseerde tachyzoïten in medium. Plaats de kolf vervolgens in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2 gedurende 18 tot 25 uur. Vervang de volgende dag het medium door 10 milliliters medium met 0,1% foetaal runderserum en incubeer dit gedurende 10 minuten bij 37 °C.Voeg na de incubatie nul, 12,5, 25, 50 of 100 µL ENU-mutageen per kolf toe. De werkverdunningen zijn respectievelijk 1,25, 2,55 en 10 mM. Voeg tot 100 µL DMSO toe aan elke kolf.Incubeer vier uur in een incubator op 37 °C. Spoel de monolaag drie keer 10 seconden lang met 10 mL koud PBS. Voeg 5 mL PBS toe en gebruik een celkrabber om de monolaag los te maken.Knip vervolgens met een stevige schaar het uiteinde van de naaldkap af, zodat de naald niet bloot komt te liggen. Breng de cellen daarna over in een spuit en breng ze door een naald met een diameter van 26,5 gauge. Om de parasiet fysiek uit de fibroblasten te verwijderen, zullen meerdere passages door de naald de efficiëntie van het vrijmaken van parasieten uit de gastheercel verhogen.Bevestig een polycarbonaatfilter van 3,0 micrometer aan een spuit. Zuig de cellen met de naald op in de spuit en druk ze door het filter in een buisje; breng vervolgens de parasieten over op een hemocytometer voor het tellen. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is het onderscheiden van parasieten van debris.Om succes te garanderen, is het belangrijk dat u de parasieten laat bezinken voordat u gaat tellen. Tel de parasieten nadat u ze vijf minuten heeft laten bezinken. Zodra de concentratie toxoplasma is bepaald, verdunt u deze tot 3.333 parasieten per milliliter in ED een voor 10 milliliters.Er zijn 33.333 parasieten nodig. Voeg drie milliliter toe aan de eerste put van een zes-wellplaat met HFF-cellen om deze te inoculeren met 10.000 parasieten. Verdun de parasieten vervolgens serieel tienvoudig over de volgende drie putten door 300 microliter van de ene put naar de volgende over te brengen.Laat de platen zeven dagen ongestoord in de incubator bij 37 °C staan. Aspireer na een week het medium en fixeer de cellen door drie milliliter 100% ethanol aan elke put toe te voegen gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens de ethanol en kleur de cellen door drie milliliter kristalviolet-oplossing aan elke put toe te voegen gedurende 15 minuten.Spoel ten slotte elke put één minuut lang uit met drie milliliters PBS. Zodra de plaat droog is, worden de plaques geteld en wordt de concentratie mutageen geselecteerd die nodig is om een overleving van 30% van de blootgestelde parasieten te bereiken. Een dosis van 70% sterfte is historisch gebruikt en induceert minder dan 100 puntmutaties per genoom.De volgende stap van de procedure is het verrijken van de egress-mutanten in de populatie. Zodra de populatie is uitgebreid, voegt u 120.000 vers gelyseerde parasieten toe aan confluente HFF-cellen in 10 milliliters. Incubeer deze vervolgens gedurende twee uur bij 35 °C.Dit zal de populatie synchroniseren door de invasietijd te beperken. Zuig na de incubatie het medium af en spoel de cellen 10 seconden lang met 10 milliliter koud PBS; voeg vervolgens 10 milliliter medium toe dat is aangevuld met 25 milligram per milliliter dextraansulfaat.Dit zal de glycaanbindende oppervlakte-eiwitten op de parasieten verzadigen, zodat ze zich niet opnieuw kunnen hechten aan en de gastheercel niet opnieuw kunnen binnendringen. Incubeer de kolf gedurende 26 uur in een bevochtigde incubator bij 40 °C met 5% CO2. Gedurende deze tijd zullen normaal gevouwen eiwitten worden vervangen door verkeerd gevouwen, temperatuurgevoelige eiwitten.Verdun de volgende dag de gekozen egress-inductor tot de werkconcentratie in een buis van 15 milliliter die 10 milliliter H-B-S-S-C bevat, aangevuld met 25 milligram per milliliter dextraansulfaat. Plaats de buis in een waterbad om de oplossing 30 minuten voor te verwarmen.S吸ireer het medium uit de met parasieten geïnfecteerde kolven en voeg de voorverwarmde egress-induceeroplossing toe. Incubeer bij 37 °C zoals aangegeven in het bijbehorende document. Aspireer vervolgens het medium en spoel gedurende 10 seconden.Voeg aan 10 milliliters koud PBS 10 milliliters ED one toe, aangevuld met 25 milligrams per milliliter dextraansulfaat en 50 micromolar pyridine-DIO-carbamaat, en incubeer dit gedurende vijf uur bij 35 graden Celsius. Aspireer na de incubatie het medium en spoel één keer gedurende 10 seconden met PBS.Voeg vervolgens 10 milliliter EED-medium toe en plaats de kolf terug in de incubator op 35 graden Celsius. Schud dagelijks om de vrijkomende parasieten te verspreiden.Zet de incubatie voort tot de parasieten de monolaag hebben vernietigd. Ongeveer zeven dagen na de verrijkingsscreening wordt de populatie gedurende één passage voortgeplant. Vervolgens worden de fenotypes bevestigd met een egress-assay.Inoculeer 20.000 parasieten in elke put van een 24-wells plaat met confluente HFF-cellen die op dekglasjes zijn gekweekt, en incubeer gedurende acht uur in een incubator van 35 °C om invasie van alle parasieten in het medium bij de permissieve temperatuur mogelijk te maken. Verplaats de plaat vervolgens naar een incubator van 40 °C gedurende 24 uur om het fenotype te induceren en oïstaten te laten groeien die acht tot 24 parasieten bevatten, nadat elke put gedurende 10 seconden is gewassen met één milliliter PBS. Voeg bij kamertemperatuur één milliliter voorverwarmde en in H-B-S-S-C verdunde egress-induceerder toe; incubeer gedurende de tijden die beschreven staan in het bijbehorende schriftelijke protocol.Zuig het medium af en fixeer door één milliliter 100% methanol aan elke put toe te voegen en 15 minuten te incuberen bij kamertemperatuur. Was vervolgens met één milliliter PBS bij kamertemperatuur. Na het wassen en het monteren van de preparaten wordt een microscoop met een 40- tot 60x objectief gebruikt om het percentage S-egress versus de intracellulaire vacuolen te tellen. Na validatie van het fenotype van de verrijkte egress-mutantenpopulatie wordt de polyklonale populatie gekloond om enkelvoudige parasietklonen te verkrijgen.Nadat de parasietconcentratie is bepaald, wordt deze verdund tot 500 parasieten per milliliter in ED one-medium in een 84-wells plaat met een confluente monolaag van HFF-cellen. Vervang het medium met 40 µL per well ED one-medium met behulp van een meerkanaalpipet. Vier polyklonale populaties zijn weergegeven als rood, blauw, geel en groen.In deze illustratie kan er op een plaat worden gekloond om dit te bereiken met de pipet. 40 µL per well van verdunde mutant één in wells C3 tot C12, mutant twee in wells C13 tot C22, mutant drie in wells H3 tot H12, en mutant vier in wells H13 tot H22. Het totale volume in elke well moet nu 80 µL zijn.Pipetteer vervolgens met een meerkanaalspipet de oplossing vijf keer op en neer en breng 40 µL over naar de rij onder de startrij. Zet deze tweevoudige seriële verdunningen voort tot en met rij H mutant één en twee of rij N mutant drie en vier. Verwijder de overgebleven 40 µL uit de laatste rij.Incubeer gedurende zeven tot 10 dagen in een incubator van 35 °C zonder de plaat te verstoren. Controleer de volgende week de wells met een geïnverteerde microscoop met een 10- tot 20x objectief op de aanwezigheid van enkele plaques, die zichtbaar zijn als gaten in de monolaag. Selecteer vier wells per mutant met een enkele plaque en breng de parasieten over naar een T 12,5 weefselkweekfles die confluent is met HFF-cellen en is gevuld met vijf milliliter.Kweek de parasieten in ED one-medium in een incubator van 35 °C. Schud de kolven dagelijks om de extracellulaire parasieten te verspreiden. Dit duurt doorgaans zeven dagen.Plaque-assays werden uitgevoerd in een six-well plaat met verschillende concentraties EMS-mutageen en verschillende aantallen parasieten per well. Zoals in deze video te zien is, zijn de witte vlekken op de hier getoonde wells parasietenplaques die zijn gevormd in de HFF-monolaag op platen behandeld met EMS. De resultaten van deze plaque-assays werden gebruikt om overlevingcurves te genereren van parasieten die waren blootgesteld aan toenemende doses EMS en ENU.De dosis die 70% dodelijkheid induceerde, werd vervolgens gekozen voor mutagenese-experimenten. In een ander experiment werd het percentage van het egress-mutantfenotype in de populatie na verrijking bepaald via flowcytometrie, zoals hier wordt getoond. Wanneer de startratio van egress-mutante ten opzichte van wild-type parasieten één op 10.000 was, werd een zuiverheid van 80% bereikt door verrijking.Wanneer de startratio echter één op 100.000 parasieten bedroeg, maakte de geïsoleerde populatie slechts 1 tot 2% uit. Deze gegevens suggereren dat de verrijkingkracht van de screening 1000-voudig is. In een derde experiment werd egress geïnduceerd door het calciumionofoor A23187. In deze afbeeldingen markeren de pijlen vier verschillende VAE's die vier tot acht parasieten bevatten die YFP tot expressie brengen in de controles.De pijlen markeren echter vier groepen verspreide parasieten, wat wijst op vier onafhankelijke egress-VA's. De verhouding tussen mutante en wildtype fenotypen kan dus eenvoudig worden bepaald door deze procedure te volgen en de parasieten te tellen. Aanvullende methoden, zoals cosmic complementatie of whole genome sequencing, kunnen worden uitgevoerd om de veroorzakende mutatie en daarmee het gen van belang te identificeren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een mutagen van interesse kunt titreren, een populatie Toxoplasma-parasieten kunt mutageneren en individuele temperatuurgevoelige egress-mutanten kunt isoleren uit die mutagenpopulatie. Vergeet niet dat werken met paramethylmine-resistente Toxoplasma-parasieten extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Hier gepresenteerd is een protocol om de remming werkzaamheid van chemische verbindingen te evalueren tegen in vitro intracellulaire groei van Toxoplasma gondii met behulp van een luciferase-gebaseerde groei test. De techniek wordt gebruikt om remmingsspecificiteit te bevestigen door genetische verwijdering van het overeenkomstige doelgen. De remming van LHVS tegen TgCPL protease wordt als voorbeeld geëvalueerd.

Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Hier presenteren we een protocol om Toxoplasma gondii-stammen snel te identificeren en te genotypen met behulp van draagbare nanopore-sequencing van geselecteerde genetische markers, waardoor schaalbare, gerichte stamidentificatie in laboratoriumonderhouden isolaten mogelijk is met mogelijke toekomstige toepassing in surveillance-omgevingen.

Multi-locus sequencing voor stamtypering van Toxoplasma gondii

Leer een fenotypische screeningsmethode om Toxoplasma gondii-mutanten met temperatuurgevoelige egress-defecten te isoleren. Deze aanpak verrijkt efficiënt mutanten voor onderzoek naar parasitaire uitstootmechanismen.

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Meer video's verkennen