Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit
13 april 2012
Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.
Het doel van dit experiment is om het gen of de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantenorganellen. Dit wordt bereikt door eerst Ethel methaan sulfonaat als chemisch middel toe te voegen aan mutageen atopie zaden die de fluorescente marker voor organellen dragen. De tweede stap is het verzamelen van zaden van individuele planten van de eerste mutageen generatie om lijnen van de volgende mutante generatie M twee te laten groeien.
Vervolgens worden de mutageen a Eliana zaden onderzocht met behulp van een confocale of fluorescente microscoop om het afwijkende organellale fenotype te identificeren. De laatste stap is het genereren van de derde mutageen generatie en het bevestigen van de aanwezigheid van het mutante fenotype. Uiteindelijk kan de recessieve mutatie worden gekaart met behulp van next generation sequencing-tools.
Zodra de locatie van het mutante gen is geïdentificeerd, zou transformatie met het wildtype gen het afwijkende organellale fenotype moeten herstellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over het behoud van de morfologische en functionele integriteit van plantenorganellen. Atill methaan, sulfonaat behandeling van atop sta zaden induceert cytosine timing veranderingen in het genoom wat resulteert in cytosine gwan naar timing.
Het toevoegen van mutaties. EMS behandeling is een belangrijke stap in dit protocol om een perfecte verhouding mutatie binnen M twee individuen te garanderen. Om te beginnen Arabidopsis zaden van de wild type Columbia Ecotype die eerder zijn ontworpen om een relevante organelle fluorescente marker te dragen.
Breng 0,8 gram of ongeveer 40.000 zaden over naar een 50 milliliter falconbuis. Voeg vervolgens 25 milliliter gedistilleerd water en 0,2% Ethel methaan sulfonaat toe. Incubeer het mengsel gedurende 16 uur op een mutageen mixer op lage snelheid, volg de incubatie, aspireer de vloeistof en gooi deze weg in een flass met één molair natriumhydroxide.
Om de EMS te inactiveren, voeg 25 milliliter water toe aan de Falconbuis met de zaden. Sluit de buis en draai vijf keer om de zaden te wassen. Nadat alle zaden zijn bezonken, aspireer het water en gooi het weg in de één molair natriumhydroxide flacon.
Herhaal deze wasstap tot 10 keer na de laatste wassing, Reese spend de zaden in een minimale hoeveelheid water. Ga door met zaadsterilisatie door 25 milliliter 10%bleach toe te voegen en krachtig te schudden gedurende 30 seconden. Zodra de zaden op de bodem zijn bezonken, giet de bleekvloeistof af en spoel met 25 milliliter steriele water.
Na het verwijderen van het steriele water, voeg 25 milliliter 70%ethanol toe. Schud de buizen gedurende 30 seconden en laat de zaden bezinken tot de bodem. Giet het ethanol af en spoel met 25 milliliter steriele water.
Herhaal de steriele waterwas twee keer. Giet vervolgens de zaden op een plastic Petrischaal met drie mm filterpapier. Laat de zaden drogen onder de kap na incubatie van de zaden gedurende twee dagen bij vier graden Celsius.
Plaats de zaden in een 150 millimeter Petrischaal op ongeveer 250 tot 300 zaden per plaat in half Magi en scoog medium bevattende fighter gel. Groei de zaden van de M1 generatie op platen gedurende twee weken als geleermiddel. Transplanteer de zaailingen in de grond en laat de planten verder groeien.
Na 30 tot 45 dagen zullen de planten de volwassen fase bereiken waarbij volwassen, so leaks duidelijk zichtbaar zijn. Op dit punt verzamel M twee zaden van individuele M1 planten om 1000 onafhankelijke M twee lijnen te genereren. Om de zaailingen met een confocale of fluorescente microscoop te observeren, kweek 60 zaden van elke M twee lijn gedurende zeven tot 10 dagen op plastic Petrischotels in de helft.
Moreish en scoog medium bevattende fighter gel laten ook vijf zaailingen van de niet met EMS behandelde controle op dezelfde plaat groeien. Zodra de zaailingen zijn gekweekt, monteer vijf tot tien cos lead-ins met de ABAC-zegelzijde naar de 40-maal lens op een microscoopglas en bedekt met een dekglas onder fluoresceine, observeer elke olein van de corticale naar mediale regio voor veranderde subcellulaire verdeling van de organellenmarker. Na transplantatie van positieve planten in de grond en groei dat de zaailingen zoals net beschreven, bevestig dat het mutante fenotype in de M drie generatie is.
Verwijder de besmettende achtergrondmutaties door minimaal drie keer terug te kruisen naar een wildtype genoom dat de gewenste organellale fluorescente marker bevat, zoals beschreven in het geschreven protocol. Om te beginnen met kaarten, gebruik cogen DN Easy Z plant mini kit om ongeveer drie microgram genomisch DNA uit M drie te extraheren, wat de homozygote mutante Columbia DNA vertegenwoordigt. Dien dit DNA in voor Illumina genome analyzer two 14 sequencing.
De volgende stap is om de zago mutant Colombia met Las Berger te kruisen om de een nakomeling te genereren na zelfbestuiving waarin de combinatie kan optreden. De dove tand generatie zal resulteren en uiteindelijk dienen als een kaartpopulatie die het gen van belang bevat, dat de mutatie veroorzaakt. Door de genomische DNA van deze populatie te vergelijken met de genomische DNA van well type planten, kan de locatie van de mutatie in het genoom worden geïdentificeerd.
Na groei van de F twee planten, verzamel tussen de 70 en 100 F twee individuen die het afwijkende fenotype vertonen en hetzelfde aantal F twee planten met een wildtype fenotype, verzamel een bladschijf van elke plant met behulp van een volledige pons. De bladschijf moet worden verzameld van bladeren van dezelfde leeftijd. Om te zorgen voor vergelijkbare hoeveelheden DNA, kunnen de monsters afzonderlijk of in groepen worden verwerkt voor genomische extractie.
In dit geval is het mogelijk om vijf tot tien monsters voor elke eend of ph buis te verzamelen, zodat er minder buizen zijn waaruit genomisch DNA moet worden geëxtraheerd. Gebruik de master pure plant blad DNA zuiveringskit om het genomische DNA te extraheren. Het genomische DNA dat uit elk monster is verkregen, kan vervolgens worden gekwantificeerd met een NanoDrop.
Combineer vervolgens gelijke hoeveelheden DNA
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit onderzoek heeft tot doel de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantenorganellen. Met behulp van fluorescentiemicroscopie en next-generation sequencing stellen de onderzoekers een methode voor om deze genetische mechanismen te onderzoeken.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Plantenbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van organellenidentiteit is cruciaal in de biologie van eukaryotische cellen.
- Plantenorganellen spelen een belangrijke rol in cellulaire functies.
- Fluorescente markers kunnen helpen bij het visualiseren van organellenstructuren.
- Next-generation sequencing kan genetische mutaties identificeren.
Doel van het onderzoek
- Om genen te identificeren die de integriteit van organellen in planten handhaven.
- Om mutagenese en fluorescentiemicroscopie te gebruiken voor genidentificatie.
- Om recessieve mutaties in kaart te brengen met behulp van geavanceerde sequencingtechnieken.
Gebruikte methoden
- Toepassing van Ethel methaan sulfonaat als een mutageen.
- Verzameling van zaden van met mutageen behandelde planten.
- Observatie van zaden met behulp van confocale of fluorescente microscopie.
- In kaart brengen van mutaties door middel van next-generation sequencing.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van abnormale organellenfenotypen in mutante planten.
- Succesvolle generatie van meerdere mutante plantenlijnen.
- In kaart brengen van recessieve mutaties naar specifieke genen.
- Validatie van de voorgestelde methode voor het onderzoeken van organellenintegriteit.
Conclusies
- De methode identificeert effectief genen die verband houden met organellenintegriteit.
- Fluorescentiemicroscopie is een waardevol hulpmiddel in plantengenetica.
- Next-generation sequencing verbetert het in kaart brengen van genetische mutaties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput fluorescence-microscopy screening combined with next-generation sequencing enables rapid identification of genes critical for organelle integrity in model systems. This workflow supports early discovery efforts by linking phenotypic screening to genetic mapping, accelerating target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence for downstream functional genomics and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function impacting organelle morphology and integrity.
- Supports biological de-risking by directly linking genotype to subcellular phenotype.
- Facilitates rapid triage of candidate genes for further mechanistic studies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, fluorescence-based phenotypic assays for high-content screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for robust comparison of mutant and wild-type lines.
- Prepares scalable platforms for screening additional genetic or chemical perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Provides a foundation for identifying conserved pathways relevant to organelle dysfunction in disease models.
- Enables continuity from genetic discovery to functional validation in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with clear mechanistic links to cellular integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification by connecting phenotypic screening with genetic mapping and validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing for gene function in organelle maintenance.
- Screening: Delivers standardized, quantitative phenotypic readouts for mutant identification.
- Analytics: Provides high-resolution mapping of causative mutations using next-generation sequencing and array genotyping.
- Translational Research: Lays groundwork for biomarker discovery and cross-species pathway validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to diverse organelles and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene-function assignments and target validation.
- Operational Value: Streamlines screening and mapping processes for rapid, reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by clarifying mechanistic underpinnings of phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, plant genetics, and bioinformatics analysis.
- Demands access to confocal imaging systems and next-generation sequencing platforms.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation and data analysis across teams.
- Adaptable to other model systems with appropriate marker engineering and mapping resources.
- Dependent on robust phenotypic screening to ensure accurate mutant identification.
