Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen
June 9th, 2012
We ontwikkelden een nieuw protocol om de efficiëntie van de in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen te verbeteren. De gedifferentieerde ES-cellen verworven motorische neuronen heeft, zoals blijkt uit de expressie van neuronale en motor neuron markers met behulp van immunohistochemische technieken.
Het algemene doel van deze procedure is om muizen embryonale stamcellen te differentiëren in motorneuronen. Eerst kweekt u muis embryonale stamcellen op primaire muis embryonale fibroblasten en suppleert u met leukemie remmend factor. Vervolgens verbetert u het normalisatieproces door noggin BFG F en FGF acht toe te voegen, induceert u de specificatie van motorneuronen door incubatie met retinoïnezuur en smoothened agonist, gevolgd door verlenging van het axon en rijping van motorneuronen.
Gebruik ten slotte immunofluorescence microscopie om gedifferentieerde MES-cellen te onderzoeken die sterke GFP-fluorescentie vertonen. Het genereren van grote hoeveelheden motorneuronen vergemakkelijkt het onderzoek naar motorneuronziekten in vergelijking met de huidige bestaande protocollen. Deze aanpak van het differentiëren van muis embryonale stamcellen in motorneuronen is efficiënter. Deze methode kan inzicht geven in spinale musculaire atrofie.
Het kan ook worden toegepast op andere motorneuronziekten zoals amyotrofische laterale sclerose Om primaire embryonale muis fibroblasten te plateren, bedekt u vier 100 millimeter weefselkweekschotels met acht milliliter 0,1%gelatine oplossing. Gooi na 30 minuten bij kamertemperatuur het overtollige vocht weg. Verdun nu een flesje mitomycine C in geactiveerde PMEF in 40 milliliter PMEF media, plateer op de vier platen en kweek maximaal een week.
Ontdooi vervolgens een flesje MES-cellen in een waterbad van 37 graden. Was de cellen met vijf milliliter E ES-media in een 15 milliliter buisje. Na centrifugeren bij 800 RPM gedurende vijf minuten.
Zuig het supernatant af en suspendeer MES-cellen in 20 milliliter ES-media met vers toegevoegde leukemie remmend factor. Verwijder 10 milliliter media uit de PMEF-culturen en vervang het door 10 milliliter van de HBG drie ES-celsuspensie. Bewaak de progressie van MES-cellen in de loop van de tijd van kleine kolonies na 24 uur tot kolonies van ongeveer 100 micrometer in diameter na 72 uur na plateren.
Ververs het medium dagelijks om de proliferatie van cellen voor de inductie van MES-cellen te onderhouden. Differentiatie in motorneuronen. De muis embryonale stamcellen moeten eerst worden gescheiden van de PMEF feeder cellen en vervolgens worden gekweekt in een suspensie omgeving op de dag van inductie.
Voor elke 100 millimeter ES-kweek, bereidt u een T one 50 flesje voor, gecoat met 0,1%gelatine Na 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u het overtollige gelatine en wast u drie keer met PBS. Ga verder met het voorzichtig aspireren van het medium uit de ES-kweek, zorg ervoor dat u losjes gehechte kolonies niet losmaakt. Was vervolgens eenmaal met 10 milliliter PBS.
Nu om MES-cellen van PMEF te scheiden, voegt u drie milliliter van 0,25%trypsin EDTA toe en incubeert u gedurende drie tot vijf minuten. Controleer bij 37 graden Celsius of de stamcellen en de PMEF zich hebben losgemaakt van de plaat. Voeg vervolgens 15 milliliter vers ES-media toe en verstoort u kolonies door te pipetteren.
Breng de celsuspensie over in het voorbereide gelatine gecoate T one 50 flesje, incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voor PFS om aan het gelatineerde oppervlak te hechten. Verzamel nu de zwevende MES-cellen in een 50 milliliter buisje en pellet door centrifugatie. Suspendeer de cellen in 10 milliliter neurale differentiatie.
Medium telt u met behulp van een hemo cytometer en plateer vervolgens op een 100 millimeter suspensiekweekschotel voor differentiatie. Verifieer op dag een door middel van microscopie dat de MES-cellen kleine zwevende aggregaten hebben gevormd die embryonale lichamen worden genoemd. Omdat eventuele overgebleven PMEF aan de schotel hechten, brengt u de ES-suspensiecellen en media over in een 15 milliliter buisje, centrifugeert u vervolgens bij 500 RPM gedurende drie minuten.
Om de embryonale lichamen te oogsten, zuigt u voorzichtig het medium af, voegt u 10 milliliter vers neurale differentiatiemedium toe aan de gepelletiseerde ebs en plateert u cellen in een nieuwe bacteriële schotelcultuur gedurende 24 uur voor differentiatie. Op dag twee, draait u de kweekschotel en brengt u het media en EBS over in een 15 milliliter buisje. Laat EBS door zwaartekracht bezinken, zuig vervolgens voorzichtig het medium af en suspendeer EBS en 10 milliliter motorneuron differentiatie.
Medium kweek EBS gedurende vijf dagen in een nieuwe bacteriële schotel voor differentiatie. Op dag zeven, verifieert u dat EBS ongeveer 150 tot 200 micrometer in diameter zijn en sterke GFP-signalen vertonen bij differentiatie. Op dag vijf, twee dagen voordat EBS worden gedissocieerd, plaatst u 12 millimeter ronde deksels op de bodem van een 24-putjesplaat.
Voeg vervolgens 0,5 milliliter van 100 microgram per milliliter poly DL ornithine toe en incubeer bij vier graden Celsius overnacht. Zuig de poly DL ornithine af, laat de platen en deksels in een weefselkweekkap drogen en bedek ze in een weefselkweekkap. Spoel de plaatputjes drie keer met dubbel gedestilleerd water.
Laat het drogen om de deksels te bedekken. Maak een verse verdunning van twee microgram per milliliter muis laminine in vijf milliliter ijskoud een XPBS. Voeg 0,5 milliliter per put toe en incubeer bij vier graden Celsius overnacht.
Was twee keer met PBS bij differentiatie. Op dag zeven, verzamelt u de EBS in een 15 milliliter buisje en laat u EBS door zwaartekracht bezinken. Na vier wasbeurten met PBS, voegt u één milliliter ACU max toe aan de EBS, mengt u voorzichtig en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zuigt u vervolgens overtollig ACU max af dat de ebs bedekt.
Voeg nu drie milliliter MND-medium toe en dissocieer EBS door ongeveer 20 keer te pipetten met behulp van een een milliliter einor micropipet, incubeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, passeer de celsuspensie door een celtrainer dop in een 12 bij 75 millimeter buisje. Herhaal deze dissociatiestap met resterende
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor de efficiënte differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen. De gedifferentieerde cellen vertonen kenmerken van motorneuronen, bevestigd door de expressie van specifieke markers via immunohistochemische technieken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcellenbiologie
- Motorneurononderzoek
Achtergrond
- Motorneuronziekten vormen grote uitdagingen in het onderzoek.
- Huidige protocollen voor differentiatie zijn vaak inefficiënt.
- Verbetering van differentiatiemethoden kan onderzoeksresultaten verbeteren.
- Muis embryonale stamcellen zijn een waardevol model voor het bestuderen van motorneuronen.
Doel van de studie
- Om een efficiënter protocol te ontwikkelen voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen.
- Om onderzoek naar motorneuronziekten te vergemakkelijken.
- Om inzichten te bieden in aandoeningen zoals spinale musculaire atrofie.
Gebruikte methoden
- Het kweken van muis embryonale stamcellen op primaire muis embryonale fibroblasten.
- Het suppleren van culturen met leukemie-remmend factor.
- Het toevoegen van noggin, BFGF en FGF8 om motorneuronspecificatie te induceren.
- Het gebruik van retinoïnezuur en smoothened-agonist voor rijping en axonelongatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van embryonale stamcellen in motorneuronen.
- Expressie van motorneuronmarkers bevestigd via immunofluorescentiemicroscopie.
- Generatie van grote hoeveelheden motorneuronen voor onderzoeksdoeleinden.
- Verbeterde efficiëntie vergeleken met bestaande protocollen.
Conclusies
- Het nieuwe protocol verbetert het differentiatieproces aanzienlijk.
- Deze methode kan de begrip van motorneuronziekten bevorderen.
- Toekomstig onderzoek kan dit protocol gebruiken voor therapeutische inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons addresses a critical bottleneck in disease modeling and early drug discovery for neurodegenerative disorders. This protocol enhances predictive confidence in generating disease-relevant cell types, supporting translational research and target validation for motor neuron diseases such as SMA and ALS. Improved differentiation efficiency enables scalable production of functional motor neurons, facilitating robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of disease-relevant motor neurons for hypothesis-driven target interrogation.
- Supports functional validation of candidate targets in a controlled stem cell-derived system.
- Improves mechanistic de-risking by providing reproducible neural differentiation outputs.
- Facilitates portfolio triage by enabling early-stage assessment of neurotoxicity and efficacy.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized source of motor neurons for high-content phenotypic screening.
- Enables quantitative assay development using GFP and immunofluorescent marker readouts.
- Supports reproducibility and scalability for compound evaluation workflows.
- Prepares validated cell systems for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro disease models with translational biomarker strategies for motor neuron disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using functionally characterized neurons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, disease-relevant data.
- Enhances predictive value for therapeutic candidate selection in neurodegenerative disease pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This two-step differentiation protocol integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable generation of motor neurons for target validation, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in motor neuron disease models.
- Screening: Delivers assay-ready, marker-validated motor neurons for reproducible compound testing.
- Analytics: Provides quantitative outputs via GFP expression and immunofluorescent marker analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through disease-relevant cell systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for motor neuron generation across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to fluorescence microscopy and immunostaining infrastructure for marker validation.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility of differentiation efficiency.
- May require adaptation for different stem cell lines or disease models.
- Dependent on high-quality starting stem cell populations for optimal outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Culturing Mouse Embryonic Stem Cells (Timing: 3 days)
2:34
Neural Induction (Timing: 2 days)
4:48
Motor Neuron Specification (Timing: 5 days)
5:24
Preparation of Poly-DL-Ornithine/Laminin Coated Coverslips (Timing: 2 days)
6:18
Axon Elongation (Timing: 2 days)
7:47
Results: mES Cell Differentiation into Motor Neurons
9:12
Conclusion
