Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om muizen embryonale stamcellen te differentiëren in motorneuronen. Eerst kweekt u muis embryonale stamcellen op primaire muis embryonale fibroblasten en suppleert u met leukemie remmend factor. Vervolgens verbetert u het normalisatieproces door noggin BFG F en FGF acht toe te voegen, induceert u de specificatie van motorneuronen door incubatie met retinoïnezuur en smoothened agonist, gevolgd door verlenging van het axon en rijping van motorneuronen.

Gebruik ten slotte immunofluorescence microscopie om gedifferentieerde MES-cellen te onderzoeken die sterke GFP-fluorescentie vertonen. Het genereren van grote hoeveelheden motorneuronen vergemakkelijkt het onderzoek naar motorneuronziekten in vergelijking met de huidige bestaande protocollen. Deze aanpak van het differentiëren van muis embryonale stamcellen in motorneuronen is efficiënter. Deze methode kan inzicht geven in spinale musculaire atrofie.

Het kan ook worden toegepast op andere motorneuronziekten zoals amyotrofische laterale sclerose Om primaire embryonale muis fibroblasten te plateren, bedekt u vier 100 millimeter weefselkweekschotels met acht milliliter 0,1%gelatine oplossing. Gooi na 30 minuten bij kamertemperatuur het overtollige vocht weg. Verdun nu een flesje mitomycine C in geactiveerde PMEF in 40 milliliter PMEF media, plateer op de vier platen en kweek maximaal een week.

Ontdooi vervolgens een flesje MES-cellen in een waterbad van 37 graden. Was de cellen met vijf milliliter E ES-media in een 15 milliliter buisje. Na centrifugeren bij 800 RPM gedurende vijf minuten.

Zuig het supernatant af en suspendeer MES-cellen in 20 milliliter ES-media met vers toegevoegde leukemie remmend factor. Verwijder 10 milliliter media uit de PMEF-culturen en vervang het door 10 milliliter van de HBG drie ES-celsuspensie. Bewaak de progressie van MES-cellen in de loop van de tijd van kleine kolonies na 24 uur tot kolonies van ongeveer 100 micrometer in diameter na 72 uur na plateren.

Ververs het medium dagelijks om de proliferatie van cellen voor de inductie van MES-cellen te onderhouden. Differentiatie in motorneuronen. De muis embryonale stamcellen moeten eerst worden gescheiden van de PMEF feeder cellen en vervolgens worden gekweekt in een suspensie omgeving op de dag van inductie.

Voor elke 100 millimeter ES-kweek, bereidt u een T one 50 flesje voor, gecoat met 0,1%gelatine Na 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u het overtollige gelatine en wast u drie keer met PBS. Ga verder met het voorzichtig aspireren van het medium uit de ES-kweek, zorg ervoor dat u losjes gehechte kolonies niet losmaakt. Was vervolgens eenmaal met 10 milliliter PBS.

Nu om MES-cellen van PMEF te scheiden, voegt u drie milliliter van 0,25%trypsin EDTA toe en incubeert u gedurende drie tot vijf minuten. Controleer bij 37 graden Celsius of de stamcellen en de PMEF zich hebben losgemaakt van de plaat. Voeg vervolgens 15 milliliter vers ES-media toe en verstoort u kolonies door te pipetteren.

Breng de celsuspensie over in het voorbereide gelatine gecoate T one 50 flesje, incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voor PFS om aan het gelatineerde oppervlak te hechten. Verzamel nu de zwevende MES-cellen in een 50 milliliter buisje en pellet door centrifugatie. Suspendeer de cellen in 10 milliliter neurale differentiatie.

Medium telt u met behulp van een hemo cytometer en plateer vervolgens op een 100 millimeter suspensiekweekschotel voor differentiatie. Verifieer op dag een door middel van microscopie dat de MES-cellen kleine zwevende aggregaten hebben gevormd die embryonale lichamen worden genoemd. Omdat eventuele overgebleven PMEF aan de schotel hechten, brengt u de ES-suspensiecellen en media over in een 15 milliliter buisje, centrifugeert u vervolgens bij 500 RPM gedurende drie minuten.

Om de embryonale lichamen te oogsten, zuigt u voorzichtig het medium af, voegt u 10 milliliter vers neurale differentiatiemedium toe aan de gepelletiseerde ebs en plateert u cellen in een nieuwe bacteriële schotelcultuur gedurende 24 uur voor differentiatie. Op dag twee, draait u de kweekschotel en brengt u het media en EBS over in een 15 milliliter buisje. Laat EBS door zwaartekracht bezinken, zuig vervolgens voorzichtig het medium af en suspendeer EBS en 10 milliliter motorneuron differentiatie.

Medium kweek EBS gedurende vijf dagen in een nieuwe bacteriële schotel voor differentiatie. Op dag zeven, verifieert u dat EBS ongeveer 150 tot 200 micrometer in diameter zijn en sterke GFP-signalen vertonen bij differentiatie. Op dag vijf, twee dagen voordat EBS worden gedissocieerd, plaatst u 12 millimeter ronde deksels op de bodem van een 24-putjesplaat.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter van 100 microgram per milliliter poly DL ornithine toe en incubeer bij vier graden Celsius overnacht. Zuig de poly DL ornithine af, laat de platen en deksels in een weefselkweekkap drogen en bedek ze in een weefselkweekkap. Spoel de plaatputjes drie keer met dubbel gedestilleerd water.

Laat het drogen om de deksels te bedekken. Maak een verse verdunning van twee microgram per milliliter muis laminine in vijf milliliter ijskoud een XPBS. Voeg 0,5 milliliter per put toe en incubeer bij vier graden Celsius overnacht.

Was twee keer met PBS bij differentiatie. Op dag zeven, verzamelt u de EBS in een 15 milliliter buisje en laat u EBS door zwaartekracht bezinken. Na vier wasbeurten met PBS, voegt u één milliliter ACU max toe aan de EBS, mengt u voorzichtig en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zuigt u vervolgens overtollig ACU max af dat de ebs bedekt.

Voeg nu drie milliliter MND-medium toe en dissocieer EBS door ongeveer 20 keer te pipetten met behulp van een een milliliter einor micropipet, incubeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, passeer de celsuspensie door een celtrainer dop in een 12 bij 75 millimeter buisje. Herhaal deze dissociatiestap met resterende