Name: Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een methode voor het kweken van Mycobacterium tuberculosis-biofilms op een lucht-media grensvlak en het bepalen van de frequentie van geneesmiddeltolerante persisters. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddeltolerantie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd uitgevoerd met financiële steun van het Nationaal Instituut voor Gezondheid en American Lung Association.

1. Groeiende biofilms van M. tuberculose in een 250mL schroef afgesloten fles <ol><li> Media voorbereiding: Los 0,5 g KH 2 PO 4, 0,5 g van MgSO 4, 4g van L-Asparagine, 2g van citroenzuur, 0,05 g van de IJzer ammoniumcitraat, 60 ml van glycerol in 900 ml water. Breng de pH op 7,0 met NaOH. Autoclaaf koel en vlak voor aanvang van de proef, steriele ZnSO 4 toe tot een eindconcentratie van 0,1% w / v. Sinds mc 2 7000 is een pantothenaat auxotroph deze stam vereist ook pantotheenzuur op 10μg/mL van de uiteindelijke concentratie. </li></ol> Opmerking: Dit is een standaard samenstelling van Sauton de media gebruikt voor M. tuberculosis. Indien nodig andere specifieke media worden gebruikt voor andere mycobacteriële species. <ol start="2"><li> Inoculums voorbereiding: Grow M. tuberculose in 7H9OADC met 0,05% Tween-80 een week of OD 600 van 0,7 tot 1,0. De culture kan direct gebruikt worden als entmateriaal een 1:100 verdunning. </li><li> Breng 25 ml van Sauton de media om een ​​250mL schroef bedekte polystyreen fles (Corning). Voeg 250μl van het inoculum aan het medium, dop van de fles zeer strak en leg hem ongestoord in een vochtige 37 ° C incubator voor 3 weken. Let op de fles eenmaal per dag ervoor te zorgen dat geen besmetting. </li><li> Aan het einde van de derde week, draait u de dop van het flesje voor de verdere groei van M. toe tuberculose op de interface. Als het deksel niet los dit stadium wordt de onvoldoende zuurstof concentratie in de container vertragen verdere groei van bacteriën. </li></ol> 2. De groei van M. tuberculose biofilms in 12-well platen <ol><li> Bereid de media en inoculum van mc 2 7000, zoals beschreven in delen A1 en A2. </li><li> Meng 60 ml van media met 600μl van inoculum. Breng 4,5 mL van het mengsel in elke well van de plaat. Bedek de plaat met deksel. Wikkel de plaat een paar keer met parafilm. Incubeer de plaat ongestoord bevochtigde incubator bij 37 ° C van 5 weken heeft. </li></ol> 3. Het bepalen van de frequentie van het geneesmiddel tolerante persisters in M. tuberculose biofilms <ol><li> Grow M. tuberculose biofilms in een 12-well formaat zoals beschreven in paragraaf B. Dit zal een totaal van ongeveer 5-weken. </li><li> Zodra de biofilm rijpen (na 5 weken incuberen) injecteren keuze van antibioticum op de gewenste concentratie in de media onder de biofilm met een microtip in een pipet. </li></ol> Opmerking: Het volume van de media onder de pellicles vermindert tot ongeveer 3.0mL. Dus onderzoekers dient dienovereenkomstig te berekenen van de hoeveelheid van het geneesmiddel. <ol start="3"><li> Werveling de plaat voorzichtig zodat het antibioticum grondig wordt verspreid in het medium. Voor de statistisch significante resultaten, injecteer de antibioticaotic vier putten. Parallel, injecteer de dezelfde hoeveelheid oplosmiddel waarin het antibioticum werd opgelost in andere vier putten, en laat de laatste vier putten van onaangeroerd de plaat. Bedek het bord met deksel en zet frisse lagen van parafilm rond de plaat. Zet het terug in de incubator voor de gewenste periode. </li><li> Aan het einde van de incubatie open plaat en voeg Tween-80 de uiteindelijke concentratie van 0,1% (volume / volume) in ieder van de putten. Swirl de hele plaat zachtjes uniforme verspreiding van het wasmiddel. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Meng de inhoud van elke goed met een pipet een paar keer zodat de gehele inhoud kunnen gelijkmatig worden overgedragen aan een 15 ml conische buis. </li><li> Spin down van de inhoud van de buis bij 4000rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De pellet in 5 ml verse wasbuffer (PBS met 10% glycerol en 0,05% Tween-80). Herhaal het wassen drie keer. Resuspendeer de pellet in 5 ml wasbuffer. Houd het op de wip voor de overnight bij 4 ° C. </li></ol> Opmerking: Hoewel lage temperatuur werd oorspronkelijk ontwikkeld voor M. smegmatis (tot de groei te minimaliseren tijdens de dispersie) en gebruikt voor M. tuberculosis en de langzaam groeiende soorten kunnen waarschijnlijk worden geschud bij kamertemperatuur zonder enige impact op het resultaat. Schommelen bij kamertemperatuur kan nodig zijn als die in BSL-3 faciliteit. <ol start="6"><li> Bereid een steriele injectiespuit voorzien van microtip (2-200μl) door te snijden zijn brede einde te maken aan de juiste maat, passend aan de spuit en te verpakken met parafilm. Voer de gehele inhoud van de buis door de tip-gemonteerde spuit en verzamelen in een verse 15 ml buizen. Herhaal deze stap 5 tot 6 keer tot je nemen een vrij homogene suspensie. </li><li> Bereid seriële verdunningen van de suspensie en de plaat verdunningen op 7H11OADC plaat om het aantal levensvatbare kolonies in elk putje bepalen. Incubeer de platen gedurende drie weken in 37 ° C incubator. Bepaal de frecy van persisters de biofilm populatie door de verhouding van het aantal kolonies verkregen antibiotica behandeld met deze verkregen op oplosmiddel behandelde platen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Wanneer gekweekt in een fles groei van M. tuberculose te zien in de bodem van de fles aan het einde van de eerste week. Aan het einde van de tweede week, fragmentarisch groei van bacteriën in de lucht-media interface te zien, hoewel de groei van de lucht-media interface vaste zichtbaar aan het einde van de derde week (Fig. 1A). Op dit moment de bevestiging van de bacteriën op de wand van de houder wordt waargenomen. Vanaf dit punt de groei van de cultuur gebeurt vooral op de lucht-media-interface. De vloeistof onder het oppervlak groei duidelijk. Typisch is de structuur rijpt het einde van het vijfde week (Fig. 1B). Als incubatie wordt verlengd, zullen de structuren gaan zinken naar de bodem van de houder. Intrigerendaanscherping van de kap tot het einde van de derde week is een belangrijke stap in het proces, en om onbekende redenen een losse bedekte fles aanzienlijk vertraagt ​​start van de groei op de interface 9. In de 12-well formaat, wordt een robuuste biofilm op het lucht-media interface gezien in ieder van de putten eind van vijf weken (fig. 2A). Als de platen zijn niet volledig ingepakt dan differentieel biofilm groei wordt waargenomen. In het ergste geval kunnen aanzienlijke media verdamping kraam de groei van de bacteriën (Figuur 2B). Zo wikkelen van de plaat is noodzakelijk om de verdamping te voorkomen en om omgeving voor biofilmvorming (zie vorige paragraaf). Het aantal levensvatbare bacillen in biofilms bepaald met deze techniek is vrij reproduceerbaar is. Reactie van M. tuberculosis biofilms afhankelijk van de aard van de antibiotica. Voor een bactericide antibioticum zoals rifampicine, verlies levensvatbaarheid volgens een bipha<html> sic trend 9. Een snelle daling van de levensvatbaarheid gedurende de eerste drie tot vier dagen, gevolgd door een blijvende fase waarin een klein percentage van de bevolking blijft volledig afbreekbare antibiotica onafhankelijk van de concentratie van het antibioticum of de blootstellingsduur. Figuur 3 toont het aantal levensvatbare bacillen in volwassen biofilm na 7 dagen blootstelling aan 50μg/mL (50 keer hoger dan de MIC) van rifampicine. <img alt="Figuur 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> Figuur 1A. Vroege verschijning van M. tuberculose bacillen in de lucht-media-interface van de bacteriën na 3 weken van de incubatie. <img alt="Figuur 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> Figuur 1b. Gerijpt biofilms van M. tuberculose op de lucht-media-interface na vijf weken van de incubatie. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; Figuur 2A. 5-weken oude biofilms van M. tuberculose gekweekt in 12-well formaat. <img alt="Figuur 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> Figuur 2B. Een mislukte poging om M. tuberculosis biofilms te groeien in 12-wells plaat zonder parafilm. <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> Figuur 3. Een vertegenwoordiger grafiek die de frequentie van het geneesmiddel tolerante persisters in M. tuberculose biofilms gekweekt in 12-well formaat en worden blootgesteld aan rifampicine 50μg/mL gedurende zeven dagen.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Tuberculose (TB), veroorzaakt door de infectie van Mycobacterium tuberculosis, blijft een grote bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid. Bijna een derde van de wereldbevolking wordt geschat op asymptomatisch besmet raakt met het pathogeen, ongeveer 9 miljoen nieuwe gevallen verschijnen in kliniek elk jaar met symptomen van actieve tuberculose en ongeveer 1,7 miljoen mensen sterven van de infectie elk jaar 11. De enorme last van de ziekte wordt vooral bijgedragen door het ontbreken van een vacc...

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen cultuurflessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>12-wells weefselkweekplaat</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>50-mL conische buizen</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografische koelkast</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>petrischaal</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobasisch)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>citroenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>ferriammoniumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-pantotheenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9-bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC-verrijking</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>250 mL voorraadfles</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>1-200&amp;mu;L pipetpunten</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Difco Mycobacteria 7H11-agar</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibasisch)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

groei mycobacterium tuberculosis biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, de etiologische bewerker van humane tuberculose, heeft een buitengewone vermogen om te overleven tegen milieu-invloeden zoals antibiotica. Hoewel stress tolerantie van M. tuberculose is een van de te verwachten bijdragen aan de 6-maanden durende chemotherapie van tuberculose 1, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze karakteristieke fenotype van de ziekteverwekker nog onduidelijk. Veel micro-organismen zijn geëvolueerd om in stressvolle omgevingen overleven door zelf-assemblage in zeer georganiseerd bevestigd, oppervlakte, en matrix ingekapselde structuren, genaamd biofilms 2-4. Groei gemeenschappen blijkt een voorkeursuitvoeringsvorm overlevingsstrategie van microben en wordt bereikt door genetische elementen die oppervlakte bijlage, intercellulaire communicatie en synthese van extracellulaire polymeren (EPS) 5,6 regelen. De tolerantie van ecologische stress wordt waarschijnlijk mogelijk gemaakt door EPS, en misschien door de physiologische aanpassing van de individuele bacillen om heterogene micro-omgevingen binnen de complexe architectuur van biofilms 7. In een reeks van recente papers hebben we vastgesteld dat M. tuberculose en Mycobacterium smegmatis een sterke neiging om te groeien in georganiseerde multicellulaire structuren genoemd biofilm, dat kan verdragen meer dan 50 maal de minimale remmende concentraties van anti-tuberculose middelen isoniazide en rifampicine 8-10. M. tuberculose, echter intrigerend vereist specifieke voorwaarden voor het vormen van volwassen biofilms, met name verhouding van 9:1 van de headspace: media en beperkte uitwisseling van lucht met de atmosfeer 9. Eisen die bijzondere milieu-omstandigheden zou kunnen worden gekoppeld aan het feit dat M. tuberculose is een obligaat humaan pathogeen en dus heeft aangepast aan weefsel omgevingen. In deze publicatie tonen we aan methoden voor het kweken van M. tuberculosebiofilms in een fles en een 12-wells plaat formaat dat geschikt voor bacteriologische en genetische studies. We hebben de protocol voor verzwakte stam M. tuberculose, mc 2 7000, met een deletie in de twee loci, panCD en RD1, die essentieel zijn voor in vivo kweken van de bacterie 9. Deze soort kan veilig gebruikt worden in een BSL-2 insluiting voor het begrip van de fundamentele biologie van de tuberculose-pathogeen zo te voorkomen aan het vereiste van een dure BSL-3 faciliteit. De methode kan worden uitgebreid, met de nodige wijzigingen in de media, om biofilm van andere mycobacteriële kweekbare soorten groeien. In het algemeen zal een uniform protocol van het kweken van mycobacteriële biofilms te helpen de onderzoekers geïnteresseerd in het bestuderen van de basis-elastische eigenschappen van mycobacteriën. Daarnaast zal een duidelijke en beknopte wijze te groeien mycobacteriële biofilms ook helpen de klinische en farmaceutische investigators de werkzaamheid van een potentieel geneesmiddel.

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, het etiologische agens van menselijke tuberculose, heeft een buitengewoon vermogen om te overleven bij omgevingsstress, waaronder ...

Het algemene doel van deze procedure is om een methode aan te tonen voor het kweken van M. tuberculosis-biofilms op een lucht-mediuminterface en om de frequentie van drug-tolerante bacteriën in de biofilms te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de juiste media en inocula voor te bereiden. De tweede stap is het kweken van M. tuberculosis-biofilms in 12-wells platen.Vervolgens wordt een testantibioticum in de gewenste concentratie toegevoegd, waarna de frequentie van geneesmiddeltolerante persisters in M tuberculosis-biofilms kan worden bepaald. Uiteindelijk kan deze techniek worden ingezet om het basisproces van biofilmontwikkeling beter te begrijpen en de mechanismen van geneesmiddeltolerantie bij M tuberculosis te ontcijferen. Het belangrijkste voordeel van het in vitro kweken van biofilmculturen van M tuberculosis in detergentvrije media is dat de spontane groei van de basislijn van de complexe multicellulaire architectuur unieke eigenschappen van het organisme onthult die niet zichtbaar zijn in planktonische culturen.Hieronder vallen oppervlakkige hechting, intercellulaire interacties, synthese van een accessoire matrix en fysiologische adaptatie binnen de heterogene micro-omgeving van deze structuur. Belangrijker is dat deze informatie zeer relevant zal zijn voor het begrijpen van de basis van M tuberculosis-persistentie in bepaalde gespecialiseerde niches, zoals caviteiten, waar een exuberant growth van basi in een accessoire omgeving waarschijnlijk plaatsvindt in multicellular structures. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een kortere therapie van tuberculose, omdat het identificeren en targeten van factoren die geassocieerd zijn met biofilms de frequentie van drug-tolerante subpopulaties in biofilms zou kunnen verminderen.In dit protocol wordt een standaard samenstelling van Soans-medium gebruikt voor het kweken van M tuberculosis. Gebruik echter de juiste gespecialiseerde media bij het kweken van biofilms van andere mycobacteriële soorten. Bereid de primaire inocula van M tuberculosis voor in plastic flessen van 125 milliliter die 15 milliliters vloeibaar medium bevatten.Tussen 80 groei. De culturen onder standaardcondities tot hun OD 600 tussen 0,7 en 1,0 ligt, wat ongeveer een week duurt. Bij deze dichtheid kan de cultuur direct als inoculum worden gebruikt in een verdunning van 1 op 100. Voeg, zodra het inoculum is voorbereid, 600 µL toe aan 60 mL sawtons medium.Nadat het inoculum voorzichtig in het medium is gemengd, verdeelt u 4,5 milliliters van het mengsel over elke put van een 12-wellplaat, sluit u de plaat af en wikkelt u deze meerdere keren in Parafilm. Incubeer de plaat vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C.Na vijf weken ongestoorde groei kan men overgaan tot het testen van de drug-tolerante persisters. Na vijf weken rijping is het mediumvolume in vier putjes afgenomen tot ongeveer drie milliliter per putje. Injecteer het gewenste antibioticum net onder de biofilm in het medium.Vier andere putjes moeten alleen met het oplosmiddel worden geïnjecteerd en de laatste vier putjes moeten ongemoeid blijven. Dit zorgt voor statistische kracht en de juiste controles; schud de plaat voorzichtig zodat het antibioticum volledig in het medium is gediffundeerd. Dek de plaat nu af.Breng verse lagen paraform aan rond de plaat en incubeer de plaat gedurende één tot zeven dagen, afhankelijk van het experiment. Voeg aan het einde van de incubatie tween 80 toe aan elke put. Schud de gehele plaat voorzichtig om het detergent uniform te verspreiden.Incubeer de plaat vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na 15 minuten een pipet om de inhoud van elke well te mengen tot deze homogeen is. Draag de cultuur vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer de conische buis en resuspendeer. Suspendeer het pellet in vijf milliliter vers wasbuffer, centrifugeer en resuspendeer. Suspendeer de cellen nog drie keer in wasbuffer.Bewaar de cellen vervolgens gedurende de nacht in wasbuffer op een rocker in een koelruimte. Hoewel de lage temperatuur oorspronkelijk is ontwikkeld voor EMS magmatic om de groei tijdens dispersie te minimaliseren, wordt dit ook gebruikt voor M tuberculosis. Langzaam groeiende soorten kunnen hoogstwaarschijnlijk bij kamertemperatuur worden geschud zonder dat dit invloed heeft op de resultaten.Schudden bij kamertemperatuur kan noodzakelijk zijn indien er in een BSL-3 faciliteit wordt gewerkt. Bereid de volgende dag een spuit voor om te homogeniseren en over te dragen. Pas voor elke suspensie een micropipetpunt aan op een steriele spuit. Snijd het brede uiteinde van de punt op maat, sluit deze aan op de spuit en wikkel de verbinding in parafilm.Breng de gekoelde celсусpensie door de spuit die is voorzien van een tip en breng de inhoud over in een schone conische buis van 15 milliliter. Herhaal deze stap vijf tot zes keer, waarbij de buis voortdurend wordt vervangen, totdat de suspensie er zeer homogeen uitziet. Maak nu seriële verdunningen van elke suspensie en zaai elke verdunning uit op een agarplaat.Na het incuberen van de platen gedurende drie weken wordt de frequentie van persisters in de biofilmpopulatie bepaald door de colony-aantallen op de met antibiotica behandelde platen te vergelijken met die op de controleplaten. Bij kweek in een fles groeide M tuberculosis tijdens de eerste week op de bodem van de fles.Aan het einde van de tweede week was er vlekkerige groei van bacteriën op de interface tussen lucht en medium zichtbaar, wat aan het einde van de derde week nog duidelijker werd. Er werd ook hechting van de bacteriën aan de wand van de container waargenomen, en de groei van de cultuur vond hoofdzakelijk plaats op de interface tussen lucht en medium. De vloeistof onder de oppervlaktegroei was helder.Aan het einde van de vijfde week was de structuur volledig gerijpt. In een formaat van 12 putjes werd na vijf weken incubatie in elke put een robuuste biofilm waargenomen op de grensvlak tussen lucht en medium op platen die niet volledig waren omwikkeld. Er werd differentiële biofilmgroei waargenomen, evenals aanzienlijke verdamping van het medium.De bacteriële groei op deze platen werd gestopt. Het aantal levensvatbare bacilli in biofilms was zeer reproduceerbaar en varieerde afhankelijk van de verschillende antibiotica. Bijvoorbeeld, bij rifampicine, een bactericide antibioticum, volgde op een snelle afname van de levensvatbaarheid gedurende de eerste drie tot vier dagen een persistente fase waarin een klein percentage van de populatie volledig resistent bleef tegen antibiotica, ongeacht de concentratie van het antibioticum of de blootstellingsduur.Dezelfde procedure kan worden gebruikt bij het screenen van mutanten om genen te identificeren die betrokken zijn bij de aanhechting van mycobacterium tuberculosis aan het biofilm-oppervlak, de groei van bacteriën op de interface en de rijping van Pecos. Vergeet niet dat werken met M tuberculosis extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van een biosafety level 3-containment, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Dit artikel beschrijft de procedure voor de vorming en visualisatie van een bacteriële biofilm gegroeid binnen een 8-well kamer...

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere...

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Dit protocol beschrijft de visualisatie van de ontwikkeling van biofilms na blootstelling aan gastfactoren met behulp van een glijkamermodel. Dit model maakt directe visualisatie van de ontwikkeling van biofilms mogelijk, evenals analyse van biofilmparameters met behulp van computersoftwareprogramma's.

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Dit protocol presenteert methodologie om biofilmgroei- en biomassametingen uit te voeren met behulp van zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met diepe put voor statische biofilmscreening met hoge doorvoer en 96-well gekoppelde deksels.

Generatie van grotere bacteriële biofilmbiomassa met behulp van PCR-Plate Deep Well Microplate-apparaten

Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het ontwikkelen van pellicle biofilm. De methode is schaalbaar naar verschillende kweekvolumes, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden toegepast voor verschillende experimentele doeleinden. Het ontwerp van de methode maakt een kwalitatieve of kwantitatieve beoordeling van het biofilmvormend potentieel van verschillende mycobacteriële soorten mogelijk.

Mycobacteriële biofilm kweken als model om antimicrobiële resistentie te bestuderen

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor PmbExM, een expansiemicroscopietechniek die speciaal is ontworpen voor Proteus mirabilis-biofilms . PmbExM maakt gebruik van een stapsgewijze enzymatische behandeling van biofilmmonsters om een isotrope, 4,3-voudige expansie te bereiken, waardoor superresolutieanalyse van de ruimtelijke organisatie van cellulaire en subcellulaire structuren binnen deze sessiele microbiële gemeenschappen mogelijk is.

Superresolutiebeeldvorming van Proteus mirabilis Biofilm door uitbreidingsmicroscopie

Leer een methode voor het kweken van Mycobacterium tuberculosis-biofilms op een lucht-media grensvlak en het bepalen van de frequentie van geneesmiddeltolerante persisters. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddeltolerantie.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Meer video's verkennen