Name: Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Leer een microplaatcoagulatietest om Factor V-activiteit te meten in humaan plasma tijdens fibrinestolselvorming. Deze snelle, kostenefficiënte methode biedt hoge doorvoer voor onderzoek naar stollingsstoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek werd ondersteund met professionele ontwikkeling en onderzoek Startup fondsen van de Universiteit van Ontario Institute of Technology (UOIT) naar Dr John A. Samis en een Canadese Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award voor Irina Levit. De auteurs erkennen Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) voor haar hulp bij de voorbereiding van de video. De auteurs erkennen Dr Michael E. Nesheim (Vakgroep Biochemie, Queen&#39;s University, Kingston, ON) voor zijn mentorschap, inzicht en nuttige discussies. De auteurs erkennen ook Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl hemostase en trombose Centrum, Academisch ziekenhuis Royal Liverpool, Liverpool, UK) voor het verstrekken van de DIC patiënt plasma&#39;s gebruikt in de studie.

1. Bereiding van FV-deficiënte Human Plasma <ol><li> Deze methode is een modificatie van de werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Bloom et al. 4. </li><li> Zorg voor volledig menselijk bloed uit een toestemmende gezonde volwassen vrijwilligers (man of vrouw, leeftijd 18 - 50 jaar) die niet is het nemen van medicatie. Draag latex handschoenen en een labjas gedurende de gehele procedure. </li><li> Bereid 100 ml van 3,2% (w / v) trinatriumcitraat in gedestilleerd water. Plaats 6,0 ml van deze oplossing in afzonderlijke 60 ml spuiten. Verwijder lucht door het indrukken van de plunjer voorzichtig naar de 6,0 ml markering op de spuit. </li><li> Gebruik een alcoholdoekje om het gebied van de cubitaal ader tussen biceps en onderarm schoon te maken. Sluit 20 gauge vlinder inrichting voor een 3 ml spuit. Steek vlinder naald in cubitaal ader en trek voorzichtig aan zuiger tot bloed worden gevuld met de 3 ml streepje. Gooi spuit met bloed. Deze stap wordt uitgevoerd om een ​​tissue factor model van het beschadigde endothelium aan de naald te verwijderenletsel site die het stollingsproces kan activeren en interfereren met de voorbereiding van FV-deficiënt plasma. </li><li> Sluit vlindernaald tot 60 ml spuit &#39;geladen&#39; met 6,0 ml trinatriumcitraat en teken voorzichtig op de zuiger tot het bloed bereikt de 60 ml markering op de spuit. (Final citraatconcentratie 10.9mm). </li><li> Verwijder de spuit uit vlindernaald en meng spuit terwijl een gehandschoende vinger of duim op de spuit stopcontact. </li><li> Blijven er bloed in 60 ml spuiten elk gevuld met 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat zoals hierboven beschreven. Men moet anticiperen terugwinning van ongeveer 50% van de citraatbloed volume plasma na centrifugeren en 50 ul FV-deficiënt plasma nodig per monster in de microplaat assay. Ons laboratorium routinematig verwerkt 300-420 ml citraatbloed tegelijk met 5-7 x 60 ml spuitjes met elk 6,0 ml 3,2% trinatriumcitraat / spuit. Dit is voldoende FV-deficiënt plasma ongeveer 3000 microplaatanalyses (Zie hieronder). </li><li> Verwijder de vlinder naald uit de arm vrijwilliger en druk op een steriel gaasje over site van de ader prikken voor 1,0 minuten. Cover site van ader punctie met een steriel verband. </li><li> Centrifugeer bij 3300 citraatbloed xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Recover bovenste gele plasma laag om een ​​plastic beker met een roerstaaf met behulp van een plastic transferpipet zorg ervoor dat u de onderste rode en witte bloedcellen laag verstoren. </li><li> Meet het volume van het plasma in ml en behouden 100 ul van plasma voor EDTA aanvulling op ijs voor toekomstige protrombinetijd stolsel tijd (PT) testen (zie hieronder). </li><li> Voeg langzaam vaste EDTA aan gecitreerd plasma met voorzichtig roeren bij kamertemperatuur 5 mM bereiken (eindconcentratie). Zodra de EDTA is opgelost, de pH op 7,0 door druppelsgewijze toevoeging van 1,0 M NaOH met voorzichtig roeren. </li><li> Dek bekerglas met Saran Wrap en incubeer gedurende 8-10 uur zonder roeren bij 37 ° C. </li><li> Elke 2 uur, herstellen 100 ulde EDTA-plasma behandeld op ijs en bepalen de PT bij de incubatie met EDTA en vergelijken met de PT van plasma vóór toevoeging EDTA (zie hierboven). </li><li> Voor de PT bepalingen, plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en steek deze in microplaatlezer. </li><li> Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. </li><li> De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips). </li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) totelke microplate goed voor elk monster worden getest. Met een pipet 50 pl normaal menselijk plasma samengevoegd referentie (NHP) of plasma voor toevoeging van EDTA of verschillende incubatietijden na toevoeging van EDTA tot microplate putjes scheiden. </li><li> Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 50 ul tromboplastine (Zie hieronder voor bereidingswijze) om alle microplaat putten met een plasma te worden getest. Incubeer in microplaat reader bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. </li><li> Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma te schudden gedurende 5 seconden, en de absorptie afgelezen bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten. </li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; 2.1mm final concentratie) om alle van de microplaat putten, wacht 15 sec, en druk op de &#39;Start&#39; icoon op de microplaat SoftMax Pro menu om de test te beginnen. </li><li> Bepaal de PT van de absorptie vs Time profielen SoftMax Pro de tijd om de helft van de maximale toename in absorptie bij 405 nm (het middelpunt van de sigmoïdale absorptie versus tijd curve geproduceerd na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. Zie bereiken, figuur 1). </li><li> Bereken de FV 1-traps activiteit van de Log Clot Time (sec) tegen log FV Activiteit (eenheden / ml), zoals hieronder geïllustreerd in figuur 2A. Voor kwantificatie doeleinden wordt 1unit van FV activiteit gedefinieerd als de activiteit die aanwezig is in 1.0 ml NHP voor opzettelijke activering van trombine toegevoegd (zie hieronder, Analyseren humaan plasma met FV 1-fase en twee-fase coagulatietest microplaat). </li><li> Bereid 4.0L 20 mM HEPES met 0,15 M NaCl in gedestilleerd water onder voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame dropwise toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Zorg voor een voldoende lengte van de dialyse buizen en goed naspoelen met gedestilleerd water. Bind een knoop in het ene uiteinde van de slang. Transfer EDTA behandelde plasma dialyse buis met een plastic overdracht pipet, verwijder de lucht, en leg een knoop in het andere uiteinde van de slang. </li><li> Voorzichtig hang de EDTA-behandelde plasma in de slang in de HBS met voorzichtig roeren. Bedek met Saran Wrap en dialyseer voor 14-16u onder zachtjes roeren bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig de EDTA-treated/dialyzed plasma in 3,0 ml porties tot 15,0 ml schroef bedekte buizen en behouden 100 ul voor PT-test van &#39;final&#39; FV-deficiënt plasma op ijs. Sla de FV-deficiënt plasma in bij -80 ° C tot gebruik. Onder de aangegeven omstandigheden de PTS stijging van 10-15 sec voordat EDTA aanvulling tot 90-100 sec 8-10 uur na toevoeging EDTA. De FV-deficiënt plasma bereid door deze methode bevat gewoonlijk minder dan 0,1% van de actieve FV in de startvers menselijk plasma. </li></ol> 2. Bereiding van Thromboplastin <ol><li> Dialyse is nodig om elke calcium uit het reagens om precies timing fibrine stolselvorming het tijdstip van calciumchloride Naast coagulatie gang kan. </li><li> Bereid 100 ml en 20 mM HEPES 4.0L en 0,15 M NaCl in gedestilleerd water in een kunststof beker met voorzichtig roeren. Breng de pH op 7,4 met langzame druppelsgewijze toevoeging van 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Voeg 6,0 ml van HBS, pH 7,4 aan elk flesje van tromboplastinereagens, vervang het deksel, en schud voorzichtig om op te lossen. Incubeer reagens in capped buisjes gedurende 15 min bij kamertemperatuur gedroogd materiaal op te lossen. Schud zachtjes om volledig op te lossen. </li><li> Snijd een voldoende lengte van de dialyse slangen, goed spoelen met gedestilleerd water, en af ​​te hechten het ene uiteinde van de slang met een knoop. Overdracht tromboplastine aan dialysebuis, verwijder de lucht, en af ​​te hechten andere uiteinde van de slang met een knoop. </li><li> Carefully hangen dialyseslang in 4.0L van HBS, pH 7,4 en voorzichtig bedekt met Saran Wrap roeren bij 4 ° C 14-16 uur. </li><li> Breng 3,0 ml van het gedialyseerde tromboplastine tot 15 ml schroef afgesloten buizen en bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 3. Voorbereiding van FV 1-traps Microplate coagulatietest Activiteit Standard Curves <ol><li> Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan plastic wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP op het ijs na voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een aparte bak wassen bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 200 ui elk 2-voudige seriële verdunningen van NHP van 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-voudig in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Vortex putje en incubeer op ijs. </li><li> Plaats verwijderbare 8 goed immunomodule strips in pLastic template houder en steek deze in microplaatlezer. </li><li> Orient immunomodule strips in microplaatlezer als: leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Ook alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk 8 goed immunomodule strip aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. </li><li> De FV microplaat assay kan meten fibrine stolselvorming in ten minste 12 verschillende monsters tegelijkertijd (6 samples per immunomodule strip over 2 immunomodule strips). </li><li> Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware. </li><li> Met een meerkanaalspipet maken gelijktijdige toevoeging van FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Gebruik een pipet 50 ul van de 10 seriële verdunningen van NHP hierboven wells microplate bereid scheiden.</li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. </li><li> Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder). </li><li> Met behulp van een multi-channel pipet, calciumchloride (50 ul van 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 3,5 mm) toe te voegen aan alle monster microplaat putten, wacht 15 sec, drukt u op de &#39;Start&#39; icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar het begin assay. </li><li> Thij stolsel tijden worden berekend als de tijd in seconden tot aan het midden tussen de minimale en maximale absorptie te bereiken bij 405 nm na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. </li><li> De beginsnelheid van stolselvorming worden berekend als het percentage toename in absorptie bij 405 nm (mUnits / min) dat de eerste 5 tijdstippen van stolselvorming omvatten in het lineaire deel van de absorptie tegen de tijd curve. </li><li> De mate van stolselvorming werd berekend als het verschil tussen de maximale en minimale absorptie bij 405 nm (Eenheden) bereikt tijdens de stolselvorming event. </li></ol> 4. Analyseren humaan plasma met de FV 1-traps en 2-traps Microplate coagulatietest <ol><li> Ontdooien FV-deficiënt plasma, NHP, plasma monster, en tromboplastine bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voorzichtig los te mengen FV-deficiënt plasma en tromboplastine, over te dragen aan kunststof ELISA wassen trays te scheiden, en incubeer op ijs. Bewaar de NHP en proef plasma op ijsNa voorzichtig mengen. Store calciumchloride (25 mM in gedestilleerd water) in een afzonderlijke ELISA wassen tray bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 200 ui elk van 40-voudige verdunningen van NHP en plasma monster in HBS, pH 7,4 met 1,5 ml microcentrifugebuizen. Vortex putje en incubeer op ijs. </li><li> Plaats het verwisselbare 8 goed immunomodule strips in plastic mal houder en in te voegen in microplaatlezer. </li><li> Alternatieve leeg, leeg, monster, leeg, lege, monster, lege en lege immunomodule strips van links naar rechts in de sjabloon houder lichtverstrooiing storingen te minimaliseren uit naburige monster-bevattende strips. Gebruik alleen putten 2 tot 7 van boven naar beneden in elk immunomodule strook aan het licht verstrooien interferentie te minimaliseren van de randen van kunststof mal houder. </li><li> Zet microplaatlezer en toegang SoftMax Pro microplate toepassingssoftware. </li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg FV-deficiënt plasma (50 pl) alle wells microplate monster. Met een single pipet, voeg 50 ul van 40-voudig verdunde NHP of monster plasma&#39;s boven bereid om microplate putten te scheiden. </li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg tromboplastine (50 pl) alle monsterholten. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 ° C gedurende 1 min en programma de microplaatlezer de plaat schud gedurende het 15-25 sec van 1 min incubatie. </li><li> Met behulp van de computer aangesloten op de microplaatlezer, toegang SoftMax Pro-software microplaat toepassing. Stel de lezer Absorptie, golflengte 405 nm, Kinetic modus, temperatuur tot 25 ° C en de microplaatlezer programma voor de eerste 5 sec schudden na toevoeging calciumchloride en meet de absorptie bij 405 nm om 5 sec gedurende 6 minuten daarna. De 5 sec schudden interval wordt niet opgenomen in de berekende stolsel tijden (zie hieronder). </li><li> Met een meerkanaalspipet, voeg calciumchloride (50 pi 25 mM in gedestilleerd water; eindconcentratie 6,25 mm) om alle wells microplate monster onmiddellijk press de &#39;Start&#39; icoon in de microplaat toepassing in SoftMax Pro van de computer naar de test te beginnen. </li><li> Aan het einde van de run, de tijd bepalen, initiële snelheid en omvang van stolselvorming voor 40-voudig verdunde monster NHP en plasma van de absorptie vs tijdprofielen in SoftMax Pro. </li><li> Rekening houdend met de 40-voudige verdunning, met de stollingstijd voor elk monster de FV activiteit te berekenen in eenheden / ml van de 1-traps FV activiteit standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A). Dit komt overeen met de FV-1 fase activiteiten of die zonder &#39;opzettelijke&#39; activering door trombine. </li><li> Aangezien FV geactiveerd met trombine de actieve cofactor, FVa 1, een tweede analyse na toevoeging en incubatie met trombine is cruciaal voor nauwkeurige meting van het FV 2-traps activiteit van een plasmamonster (met &#39;intentionele&#39; activering door trombine toegevoegd). </li><li> Voor de FV 2-fase test, bereiden 200-300 pi gezuiverd trombine 18 at 100 nM in HBS, pH 7,4 en geïncubeerd op ijs. Plan 10 pl verdund trombine gebruiken voor elke plasma monster wordt bepaald met de FV twee-fase test. </li><li> Verdun 120 pl van de bovenstaande NHP en plasma monster van 40-voudig tot 100 maal met 170 ul HBS, pH 7,4 die 2,8 mm calciumchloride. Voeg 10 ul trombine (10 nM eindconcentratie) aan elk monster. Vortex goed te mengen en bij 37 ° C geïncubeerd gedurende 1 min. </li><li> Verdun NHP en plasma monster tot 500-voudig door het toevoegen van 400 ul HBS, pH 7,4, vortex goed en assay 50 pi van elk plasmamonster in de FV 1-traps microplaat test zoals hierboven beschreven. </li><li> Bepaal het stolsel tijd voor NHP en elke plasma monster getest van de absorptie vs Time profielen in SoftMax Pro. Rekening houdend met de 500-voudige verdunning met de stollingstijd voor elk monster de FV 2-traps activiteit van het FV berekenen 1-traps standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A). </li><li> De totale FV activiteitenty kan dan worden berekend als FV 2-traps activiteit - FV 1-traps activiteit. </li></ol>

<ol><li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factor+V+activation+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li>
<li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li>
<li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+V%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li>
<li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li>
<li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li>
<li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li>
<li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li>
<li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li>
<li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li>
<li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li>
<li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li>
<li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li>
<li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+J%22%5BJournal%5D)">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li>
<li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul.+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li>
<li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+intravascular+coagulation%3A+Findings+in+346+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li>
<li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li>
<li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+prothrombinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Meths.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li>
<li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+TAFI%2C+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li>
<li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+intravascular+coagulation+%28DIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Sci%22%5BJournal%5D)">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li>
<li>Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C%3A+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li>
<li>Dahlbäck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De kinetische microplaat assay methode wordt de ontwikkeling van een nieuwe, snelle, goedkope en geschikte techniek voor het meten van FV stollingsactiviteit in monsters van menselijk plasma die (FV 1-fase test) of met opzet zijn geactiveerd met trombine toegevoegd (FV 2-fase test). De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer en materialen en reagentia nodig zijn commercieel verkrijgbaar of kunnen worden gemaakt in-huis. De test bewaakt de verandering in de lichtverstrooiing van plasma tijdens fibrine stolselvorming bij 405 nm. De microplaat test heeft het voordeel dat kleine volumes plasmamonster (ui) en vatbaar voor analyse van meerdere monsters tegelijk (tot 12). Deze assay eigenschappen zijn voordelig wanneer dure apparatuur en reagentia gebruikt (Automated analysatoren en Factor-deficiënt plasma) slechts kleine volumes monster beschikbaar (Patient plasma) of analyse van een groot aantal monsters (FV Tijdens zuivering from plasma). De FV microplate assay heeft als bijkomend voordeel dat het handig, snel, en vereist geen isolatie en zuivering van de gewenste samenstellende componenten. Vergeleken met handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays die zijn gemeld, de FV microplaat test heeft vergelijkbare bruikbare gebied van stolsel keer (25-75 sec) en overeenkomstige FV niveaus in het monster (0.5-,005 Units / ml), en gevoeligheid / detectiegrenzen (20 80pM). Vergeleken met handmatige tilt-tube FV assays die lijden aan een subjectieve visuele beoordeling van stolselvorming 3, 4, de FV microplaat assay maakt objectieve en kwantitatieve meting van de stollingstijd, beginsnelheid en omvang van fibrine stolselvorming. In vergelijking met geautomatiseerde FV assays die kampen met de eis van dure analysers en reagentia 5-7, de FV microplaat assay reagentia en materialen zijn goedkoop en alle benodigde materialen kunnen beslissed commercieel of worden gedaan in-house. Handmatige tilt-buis 3, 4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays algemeen alleen de tijd op stolselvorming, niet de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming die nauwkeurig alle spectrofotometrisch gemeten met de microplaat FV assay. Tenslotte handmatige tilt-buis 3,4 en geautomatiseerde 5-7 FV assays lijden alleen de mogelijkheid om de FV te meten in plasma monsters een voor een, dat de FV microplaat assay vatbaar is voor high-throughput en 12 monsters kan gelijktijdig getest. De microplaat assay werd aangetoond dat de FV in 9 DIC patiënt plasma was minder actief dan in NHP door een combinatie van een stolsel en lagere initiële snelheden van stolselvorming in de FV 1-fase test. De beginsnelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test in het plasma DIC patiënt niet veranderd NHP. De mate van stolselvorming in de DIC patient plasma&#39;s werden ook niet veranderd van NHP in de FV 1-traps en 2-traps assays. Verminderde FV 1-traps, 2-traps, en de totale activiteiten kunnen te wijten zijn aan een verhoogde consumptie FV 19 en / of inactivatie 6 in overeenstemming met andere studies in de pathogenese van deze verworven bloedziekte. Gezien de omvang van stolselvorming in de DIC plasma was hetzelfde als waargenomen met NHP, deze variabele was waarschijnlijk een gevolg van de fibrinogeenconcentratie in de FV-deficiënt plasma en niet gerelateerd aan de kenmerken van de patiënt plasma. De resultaten van de microplaat test aan dat meting van FV in de monsters van humaan plasma kan worden verkregen uit de tijd en initiële snelheid van stolselvorming de FV 1-fase test en de tijd van stolselvorming en totale activiteit van FV 2 - fase test. Het was niet mogelijk om kwantitatieve meting van FV activiteit te verkrijgen in een plasmamonster gebaseerd op de mate van stolselvorming in thij FV 1 - en 2-traps assays of de initiële snelheid van stolselvorming in de FV 2-fase test. Aangezien alle reacties bereikt ongeveer dezelfde mate van stolselvorming van 0,35 tot 0,45 eenheden tussen de initiële absorptie voor en de maximale absorptie na tromboplastine en calciumchloride Bovendien is het meten van de mate van stolselvorming geen kwantitatieve beoordeling van FV activiteit in een aangegeven plasma monster. De nieuwe assay microplaat vindt gebruik in onderzoek en klinische settings voor het meten van FV in de monsters van humaan plasma en fracties tijdens de zuivering uit humane en dierlijke plasma. De microplaat test kan worden gebruikt om de tijd, beginsnelheid, en mate van stolselvorming meten; parameters niet tegelijkertijd gecontroleerd handmatige tilt tube-assays en geautomatiseerde coagulatie analyzers. Deze informatie geeft meer van een volledige kwantitatieve beoordeling van de betrokkenheid van FV tijdens de stolselvorming evenementin menselijk plasma dan eerder gerapporteerd 3-7. Deze informatie is met name belangrijk in onderzoek en klinische laboratoria bij het meten significante veranderingen in FV in de monsters van plasma of gezuiverd FV of FVa. De FV microplaat test kan ook worden gebruikt om karakteriseren en te meten verbindingen die kunnen activeren of deactiveren FV en FVa, meet de FV activiteit in patiënten met risico op veneuze trombose als gevolg van de FV Leiden mutatie 20, 21 en de activiteit van toezicht FV tijdens de zuivering uit plasma. De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten in de extrinsieke, intrinsieke of gemeenschappelijke route met een geschikte factor-deficiënt plasma en initiëren reagentia voor fibrinevorming. De test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische laboratoria. Ultimately, zal deze informatie een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor mensen die last hebben met stollingsstoornissen, zoals DIC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties (optioneel) </td></tr><tr><td> Kinetische microplaatlezer </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> SoftMax PRO 4.3 LS software </td></tr><tr><td> Normaal gepoolde humane referentie plasma </td><td> Precisie Biologicals </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trinatriumcitraat </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-deficiënt plasma humane 4 </td><td></td><td></td><td> Gemaakt van verse humane plasma en opgeslagen in aliquots bij -70 ° C. </td></tr><tr><td> 3 en 60ml spuiten </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 en 136898 </td><td></td></tr><tr><td> Butterfly apparatuur </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 gauge </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Visser </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Tromboplastinetijd </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Gedialyseerd tegen HBS, pH 7,4 en opgeslagen in hoeveelheden bij -70 ° C. </td></tr><tr><td> Calciumchloride </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> Humaan trombine 15 </td><td></td><td></td><td> Uit menselijk plasma, bewaard bij -20 ° C in 50% (v / v) glycerol. </td></tr><tr><td> Dialysemembraan </td><td> Visser </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa moleculair gewicht cutoff; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Sjabloon houder en verwijderbare 8 goed strips. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 en 469957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISA wassen trays </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microfuge en 15 ml schroef afgesloten buizen. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 en 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Meerkanaalspipet </td><td> Visser </td><td> 2703630 </td><td> 8-kanaals model. </td></tr></tbody></table>

meting van factor v activiteit in humaan plasma met een microplate coagulatietest

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In reactie op letsel is bloedstolling geactiveerd en resulteert in het genereren van de stolling protease, trombine. Trombine splitst fibrinogeen in fibrine welke een bloedklonter die onoplosbaar bloeding stopt. Factor V (FV) in zijn geactiveerde vorm, FVa, een kritische co-factor voor de protease FXa en versneller van trombinevorming in fibrine stolselvorming als onderdeel van protrombinase 1, 2. Manual FV assays zijn beschreven 3, 4, maar ze zijn tijdrovend en subjectief. Geautomatiseerde FV assays gemeld 5-7, maar de analysator en reagentia duur en vaak enkel de stollingstijd, niet de snelheid en mate van fibrinevorming. De microplaat platform voorkeur voor het meten enzymgekatalyseerde events vanwege gemak, tijd, kosten, klein volume, continue monitoring en high-throughput 8, 9. Microplate assays zijn beschreven voor stolsellysis 10, bloedplaatjesaggregatie11 en stollingsfactoren 12, maar niet voor FV activiteit in menselijk plasma. Het doel van de werkwijze was een microplaat test die FV activiteit tijdens fibrinevorming in menselijk plasma te ontwikkelen. Deze nieuwe microtiterplaat schetst een eenvoudige, goedkope en snelle analyse van FV activiteit in humaan plasma. De assay gebruikt een kinetische microplaatlezer de absorptieverandering bij 405 nm te volgen tijdens fibrinevorming in humaan plasma (Figuur 1) 13. De assay meet nauwkeurig de tijd initiële snelheid en omvang van fibrine stolselvorming. Het vereist slechts pl hoeveelheden plasma, volledig in 6 min, high-throughput, gevoelig voor 24 80pM FV, en meet de hoeveelheid onbedoeld geactiveerd (1-traps activiteit) en trombine-geactiveerde FV (2-traps activiteit 1-traps activiteit) -) om een ​​volledige beoordeling van de totale functionele activiteit (2-traps activiteit te verkrijgen. Verspreid intravasCular coagulatie (DIC) is een verworven coagulopathie die het vaakst ontwikkelt van reeds bestaande infecties 14. DIC is geassocieerd met een slechte prognose en verhoogt mortaliteit boven de bestaande pathologie 15. De assay werd aangetoond dat 9 patiënten met DIC, de FV 1-traps, 2-traps, en totale activiteiten verminderd met gemiddeld 54%, 44% en 42% respectievelijk, vergeleken met normale gepoolde humane referentie-plasma (NHP). De FV microplaat assay gemakkelijk op de activiteit van een stollingsfactor meten. Deze test zal een beter begrip van FV biochemie door een nauwkeurige en volledige meting van de activiteit in onderzoek en klinische instellingen. Deze informatie zal een positieve invloed hebben gezondheidszorg omgevingen door middel van vroegere diagnose en de ontwikkeling van meer effectieve behandelingen voor stollingsstoornissen, zoals DIC.

Representatieve resultaten - Voorbereiding van FV 1-traps microplaat coagulatietest activiteit standaardcurven Een representatief voorbeeld van fibrine stolselvorming in de FV assay tijd die door de microplaatlezer wordt geïllustreerd in figuur 1. De FV-test meet nauwkeurig de tijd, initiële snelheid en de omvang van fibrine stolselvorming. Inspectie van de putten na test voltooien bevestigd dat stolselvorming is opgetreden. Alle reacties bereikt ongeveer dezelfde mate van stolselvorming met een algemene verandering in absorptie bij 405 nm van 0,35 tot 0,45 eenheden tussen de start voor absorptie en de maximale absorptie na tromboplastine en calciumchloride toevoeging. Representatieve voorbeelden van FV 1-traps activiteit standaardcurven van Log Clot Tijd (in seconden) vs Inloggen FV Activiteit (Eenheden / ml) en Inloggen initiële snelheid van stolselvorming (in mUnits / min) versus Inloggen FV Activiteit (Eenheden / ml ) voor seriële verdunningen van NHP wordt in <strong&gt; Figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. Montage van de log-log plot van Clot Tijd vs FV 1-activiteit bleek een sterke relatie tussen deze variabelen na lineaire regressie-analyse (Figuur 2A; R2 = 0.980). Montage van de log-log plot van de initiële snelheid van stolselvorming vs FV activiteit ook aangegeven een sterke relatie tussen deze variabelen na lineaire regressie-analyse (Figuur 2B; R2 = 0.983). De relatie van beide Log Clot Tijd en Aanmelden initiële snelheid van stolselvorming vs Inloggen FV activiteit bleef lineair voor NHP verdund tot 512-voudig. Sinds FV circuleert in NHP op ongeveer 12-40 nM 16, de microplaat test is gevoelig voor ca. 24-80pM FV in NHP. Aangezien de dissociatieconstante van de interactie van FVa-FXa-lipide in prothrombinase ongeveer 1 nM 17, FV microplaat test is volledig geschikt voor het meten van niveaus FV in de fysiologisch relevant nM bereik voor FVa functie in protrombinase. Met behulp van de FV microplaat assay, werd ook vastgesteld dat het normale bereik van FV activiteit in de FV 1-traps activiteit test van 15 gezonde controlepersonen plasma&#39;s (Man en Vrouw, Leeftijd 18-20yrs) was (gemiddelde ± standaarddeviatie; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dit komt goed overeen met de normale gezonde FV activiteit en bereik (0.66-1.14U/ml) gerapporteerd door Cutler et al.. de FV 1-traps activiteit bepaald met een geautomatiseerde analysator 7. De intra-assay variatie van de tijd, de omvang en initiële snelheid van stolselvorming in de FV 1-fase test in 6 wells op 8 verschillende dagen was 3,4%, 4,4% en 3,1% voor. De inter-assay variatie van de tijd, de omvang en initiële snelheid van stolselvorming in de FV 1-fase test in 6 putjes van 8 verschillende experimenten op 8 verschillende dagen was 7,1%, 7,8% en 9,2% respectievelijk. Dus de intra-en inter-assay variatie van deze drie meetrode variabelen op een laag en aanvaardbaar niveau voor robuuste uitvoering van de assay binnen en tussen microplaat test van meerdere monsters tegelijk (maximaal 12). Representatieve resultaten - Analyseren menselijk plasma monsters met de FV 1-traps en 2-traps microplaat coagulatietest De standaardcurve van Log stollingstijd tegen log FV activiteit (Figuur 2A) werd gebruikt om de activiteit FV NHP en 9 DIC patiënt plasma die niet met opzet werden geactiveerd met trombine toegevoegd (FV 1-traps activiteit) of opzettelijk geactiveerd met meten toegevoegd trombine (FV 2-traps activiteit) en de resultaten worden getoond in Tabel 1. Alle 9 DIC patiënt plasma&#39;s tentoongesteld FV 1-traps activiteiten en de initiële snelheden van stolselvorming die werden afgenomen met gemiddeld 54% en 18% respectievelijk, van NHP. De mate van stolselvorming in de FV 1-fase test in de DIC patiënten waren niet sterk verschilden van NHP, en namen gemiddeld toe, met 13% van NHP. <html> Activering van NHP met trombine gegenereerd ongeveer 8-voudige toename in FV 2-traps activiteit boven de FV 1-traps (tabel 1). Dit geeft aan dat de FV in NHP was vooral aanwezig in zijn niet-geactiveerde vorm en is het eens met de eerder gerapporteerde resultaten met behulp van handmatige tilt-buis FV assays 3, 4 en geautomatiseerde FV assays 5-7. De FV 2-traps en totale activiteit werden ook afgenomen in de DIC patiënten gemiddeld met 44% en 42%, respectievelijk, van NHP. De beginsnelheid en mate van stolselvorming in de FV twee-fase test de DIC patiënten niet significant verschillend van NHP en varieerde gemiddeld ca. 9% en 4%, respectievelijk, van die gezien met NHP. Deze resultaten geven aan dat in vergelijking met de FV in NHP, de FV in de DIC patiënt plasma resulteerde in langere tijd en verminderde snelheid van fibrine stolselvorming en dat de patiënt FV was gemiddeld slechts 56% activeerbaar met trombine ook. ENT &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Stolselvorming in normale gepoolde humane referentie plasma gemeten met kinetische microplaat FV 1-fase coagulatietest. Fibrine stolselvorming in NHP werd continu gevolgd bij 405 nm met een kinetische microplaatlezer. De plot is de microplaatlezer uitgang van een 6 min reactie van 32-voudig verdunde NHP, FV-deficiënt plasma, tromboplastine en calciumchloride in een microplaat goed. De verticale as vertegenwoordigt de verandering in absorptie bij 405 nm die ontstaat als gevolg van fibrinevorming in plasma. De tijd van fibrinevorming werd gedefinieerd als de tijd om de helft van de maximale toename in absorptie of het midden van curve (36,40 sec) bereiken. De initiële snelheid van stolselvorming werd gedefinieerd als de verandering van de absorptie bij 405 nm voor de eerste 5 tijdstippen van de lineaire toename van de absorptie van de curve (611,88 mUnits / min). De extent van stolselvorming werd gedefinieerd als het verschil tussen de maximale en minimale absorptie bij 405 nm (0,35 eenheden). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Standaard curves van tijd en initiële snelheid van stolselvorming tegen Factor V activiteit in normale samengevoegd menselijk plasma met het referentie FV 1-traps microplaat assay. NHP werd serieel verdund (0 - tot 512-voudig in HBS) en getest met de FV 1-traps microplaat test zoals beschreven in het protocol. Log-log plots van de tijd en initiële snelheid van stolselvorming tegen FV activiteit in de FV 1-traps microplaat test getoond na lineaire regressiemodel van de data in panelen A en B, respectievelijk. <table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> 1-fase test Activiteit (Eenheden / ml) </td><td> 1-fase test Omvang (Units) </td><td&gt; 1-fase test Initial Rate (mUnits / min) </td><td> 2-fase test Activiteit (Eenheden / ml) </td><td> 2-fase test Omvang (Units) </td><td> 2-fase test Initial Rate (mUnits / min) </td><td> Totale activiteit (Eenheden / ml) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1,02 </td><td> 0.363 </td><td> 744,96 </td><td> 7,93 </td><td> 0.433 </td><td> 375,84 </td><td> 6,91 </td></tr><tr><td> Patiënt 1 </td><td> 0,36 </td><td> 0.404 </td><td> 583,80 </td><td> 3,84 </td><td> 0.432 </td><td> 249,96 </td><td> 3,48 </td></tr><tr><td> Patiënt 2 </td><td> 0,67 </td><td> 0.416 </td><td> 704,04 </td><td> 5,28 </td><td> 0.469 </td><td> 323,16 </td><td> 4,61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Patiënt 3 </td><td> 0,31 </td><td> 0.435 </td><td> 562,08 </td><td> 3,92 </td><td> 0.453 </td><td> 294,96 </td><td> 3,61 </td></tr><tr><td> Patiënt 4 </td><td> 0,39 </td><td> 0.435 </td><td> 617,04 </td><td> 4,14 </td><td> 0.462 </td><td> 372,60 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Patiënt 5 </td><td> 0,73 </td><td> 0.401 </td><td> 641,40 </td><td> 5,91 </td><td> 0.433 </td><td> 354,24 </td><td> 5,18 </td></tr><tr><td> Patiënt 6 </td><td> 0,45 </td><td> 0.403 </td><td> 600,72 </td><td> 4,16 </td><td> 0.445 </td><td> 393,96 </td><td> 3,71 </td></tr><tr><td> Patiënt 7 </td><td> 0,49 </td><td> 0.395 </td><td> 575,40 </td><td> 4,89 </td><td> 0.449 </td><td> 357,48 </td><td> 4,40 </td></tr><tr><td> Patiënt 8 </td><td> 0,19 </td><td> 0.448 </td><td> 489,00 </td><td> 2,89 </td><td> 0.450 </td><td> 330,48 </td><td> 2,70 </td></tr><tr><td> Patiënt 9 </td><td> 0,64 </td><td> 0.423 </td><td> 699,48 </td><td> 5,11 </td><td> 0.455 </td><td> 417,24 </td><td> 4,47 </td></tr></tbody></table> Tabel 1 FV activiteit in NHP en in 9 patiënten dat gedissemineerde intravasculaire stolling (DIC). De FV 1-traps, 2-traps, en de totale activiteit in NHP en 9 DIC patiënt plasma werden bepaald uit de FV 1-traps microplaat test standaard tijd curve van stolselvorming tegen FV activiteit (Figuur 2A) en worden in eenheden / ml. De eerste prijs (Initiële verhoging van A405nm gedurende eerste vijf tijdstippen in mUnits / min) en mate (Maximum A405nm - Minimum A405 nm) van stolselvorming in de FV 1 - en 2-traps microplaat assay worden ook getoond.

Deze studie beschrijft een nieuwe microplaat test die FV stollingsactiviteit tijdens fibrine stolselvorming in menselijk plasma die niet eerder gerapporteerd. De methode gebruikt een kinetische microplaatlezer de verandering in absorptie bij 405 nm meet continu in fibrine stolselvorming in menselijk plasma.

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

Als reactie op een letsel wordt de bloedstolling geactiveerd, wat resulteert in de generatie van de stollingsprotease trombine. Trombine splitst fibrinogeen in fibrine ...

Het algemene doel van de volgende procedure was het ontwikkelen van een microplaatassay die de activiteit van het stollingsproteïne factor V meet tijdens de vorming van een fibrinestolsel in menselijk plasma. Als reactie op een letsel wordt het bloedstollingsproces geactiveerd, wat resulteert in een reeks conversiereacties van zymogeen naar protease die uiteindelijk leiden tot de generatie van het stollingsenzym trombine; trombine splitst oplosbaar fibrinogeen in fibrinemonomeren, die vervolgens aggregeren om een onoplosbaar fibrinestolsel te vormen. Normaal gesproken blijft bloed in een gezonde of ongedeukte staat een vrijvloeiende vloeistof, en is de hoeveelheid gevormd fibrine gelijk aan de hoeveelheid afgebroken of gedegradeerd fibrine.Echter, in bepaalde ziektegevallen leidt overmatige stolling tot hartaandoeningen en beroertes, terwijl onvoldoende stolling leidt tot bloedingsneigingen, die vaak worden gezien bij hemofilieën. Factor V is een eiwit in het plasma dat in zijn geactiveerde vorm, factor Va, een cruciale versneller is van thrombinegeneratie tijdens de vorming van fibrine-stolsels als onderdeel van het prothrombine-enzymcomplex; prothrombine bestaat uit vier componenten: factor Xa, de protease, factor Va, de cofactor, lipiden, het oppervlak en calcium. De aanwezigheid van factor Va verhoogt de katalytische efficiëntie of kcat van factor Xa ten opzichte van het substraat prothrombine met ongeveer 3000 keer, waardoor de thrombinegeneratie en de vorming van fibrine-stolsels aanzienlijk worden versterkt.Het microplaatplatform geniet de voorkeur voor het meten van enzymgecatalyseerde processen vanwege het gemak, de tijdswinst, de kleine monstervolumes, continue monitoring en de hoge doorvoer. De vorming van een fibrinestolsel kan worden gemonitord met een microplaatlezer door de toename van de lichtabsorptie van plasma te meten wanneer dit verandert van een heldergeel uiterlijk zonder fibrinestolsel en minimale lichtabsorptie naar een ondoorzichtige, troebele verschijning met een fibrinestolsel en maximale lichtabsorptie. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige tilt-tube assays of assays met geautomatiseerde analysatoren, zijn dat de methode snel en goedkoop is, lage vereisten stelt aan het monstervolume en een hoge doorvoer heeft.De assay meet de activiteit van onbedoeld geactiveerde en door trombine geactiveerde factor vijf om een volledige kwantitatieve beoordeling van de totale functionele activiteit te verkrijgen. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Derek Tilley, een masterstudent in het laboratorium. Om de factor vijf-activiteit in een plasmamonster te meten, is het noodzakelijk om factor vijf één-staps activiteit-standaardcurven op te stellen voor de tijd tot vorming van het fibrine-stollingssel in paneel A en de initiële snelheid van fibrine-stollingsvorming in paneel B, gebruikmakend van normaal menselijk plasma of NHP als standaard, dat per definitie één eenheid factor vijf-activiteit per mL bevat. Ontdooi het factor vijf-deficiënte plasma, het normaal menselijk plasma, de onbekende monsterplasma's en de tromboplastine bij 37 °C gedurende 10 minuten.Meng het factor V-deficiënte plasma voorzichtig en breng het over naar afzonderlijke plastic wasbakken en incubeer op ijs. Bewaar het normale menselijke plasma en de onbekende monsterplasma's op ijs na voorzichtig mengen. Bewaar de 25 millimolaire calciumchloride in gedestilleerd water in een afzonderlijke wasbak bij kamertemperatuur voor de standaardcurven van de factor V één-staps activiteit.Bereid 200 µL van elke tweevoudige seriële verdunning van normaal menselijk plasma van 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 en 512 voud in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ml microcentrifugebuisjes; vortex goed en incubeer op ijs. Bereid voor de onbekende plasmamonsters 200 µL van each 40-voudige verdunningen van normaal menselijk plasma en onbekende monsterplasma's in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Plaats vijf microwell-strips in de sjabloonhouder van de microplaatlezer.Zet de microplaatlezer aan en open de Softmax Pro microplaat-applicatiesoftware. Voeg met een meerkanaalpipet gelijktijdig 50 µL factor vijf-deficiënt plasma toe aan alle putjes van de monster-microplaat. Voeg met een enkele pipet 50 µL van de voorbereide 10 seriële verdunningen van normaal menselijk plasma, de 40-voudige verdunningen van normaal menselijk plasma en de onbekende monsterplasma's toe aan afzonderlijke putjes van de microplaat. Voeg met een meerkanaalpipet 50 µL tromboplastine toe aan alle monsterputjes. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 °C gedurende één minuut, waarbij gedurende 15 tot 25 seconden van deze incubatietijd wordt geschud.Gebruik de computer die is gekoppeld aan de MICROPLATE-lezer om de Softmax Pro Microplate-applicatiesoftware te openen. Stel de Microplate-lezer in op een absorptiegolflengte van 405 nanometer, kineticmodus en een temperatuur van 25 graden Celsius. Programmeer de Microplate-lezer zodat deze de eerste vijf seconden na toevoeging van calciumchloride schudt en meet de absorptie bij 405 nanometer elke vijf seconden gedurende zes minuten. Daarna wordt het schudinterval van vijf seconden niet meegenomen in de berekende stollingstijden. Voeg met twee meerkanaals pipetten gelijktijdig 50 microliters calciumchloride toe aan de twee microplate-strips met monsters.Wacht 15 seconden en druk onmiddellijk via de computer op het start-icoon in Softmax Pro om de assay te beginnen. Voor elk geanalyseerd plasmaproefDe mate van stollingsvorming wordt gedefinieerd als het verschil tussen de maximale en minimale absorbantie die wordt bereikt tijdens het stollingsproces aan het einde van de run. Gebruik de ABSORBANTIE-tijdsprofielen in Softmax Pro om de tijd, de initiële snelheid en de mate van stollingsvorming voor de seriële verdunning van normaal menselijk plasma te bepalen. Om de standaardcurven voor de eenstapsactiviteit van factor V op te stellen, worden de stollingstijden voor het 40 keer verdunde normaal menselijk plasma en de onbekende monsterplasma's gebruikt om de factor V-activiteit in units per ml te interpoleren vanuit de standaardcurve voor de eenstapsactiviteit van factor V.Dit vertegenwoordigt de activiteit van factor vijf in één stadium, ofwel zonder opzettelijke activatie door trombine. Dit is een representatief voorbeeld van fibrinestolling in de factor vijf-assay over een bepaalde tijd, gegenereerd door de microplate-reader. Het profiel representeert de vorming van een fibrinestolsel met gebruik van 32 maal verdund normaal menselijk plasma in één enkele microplate.De verticale as geeft de verandering in absorptie bij 405 nanometer aan die optrad als gevolg van de vorming van een fibrinestolsel. De tijd tot stolselvorming werd berekend als het middenpunt van de absorptie-tijdcurve, namelijk 36,4 seconden. De initiële snelheid van de stolselvorming werd berekend op 611,88 milli-eenheden per minuut.De mate van wolkenvorming werd berekend op 0,35 eenheden. De factor vijf-assay meet nauwkeurig de initiële snelheid en de mate van wolkenvorming. Inspectie van de wells na voltooiing van de assay bevestigde dat er stolselvorming had plaatsgevonden.Alle reacties bereikten ongeveer dezelfde mate van stolling, met een algemene verandering in absorbantie bij 405 nanometer van tussen 0,35 en 0,45 eenheden tussen de startabsorbantie voorafgaand aan en de maximale absorbantie na tromboplastine en calciumchloride. Representatieve voorbeelden van de factor V één-staps activiteit, de standaardcurve van stollingstijd in seconden versus factor V activiteit in units per ml en de initiële snelheid van stolling in milli-units per minuut versus factor V activiteit in units per ml voor normaal menselijk plasma worden respectievelijk getoond in paneel A en paneel B.Aangezien factor vijf normaal gesproken door trombine wordt geactiveerd, is een tweede assay na toevoeging en incubatie met trombine cruciaal om de factor vijf tweestapsactiviteit van een plasmaproef nauwkeurig te meten, met opzettelijke activering door toegevoegde trombine voor de factor vijf tweestapsassay. Bereid 200 tot 300 µL gezuiverde trombine voor met een uiteindelijke concentratie van 100 nM in HBS pH 7.4 en incubeer dit op ijs; verdun 120 µL van het bovenstaande normale menselijke plasma en monsterplasma's 40- tot 100-voudig met 170 µL HBS pH 7.4 bevattend 2.8 mM.Calciumchloride. Voeg 10 µL trombine toe aan elk monster om een uiteindelijke concentratie van 10 nM te bereiken. Vortex elk putje om te mengen en incubeer één minuut bij 37 °C. Verdun het normale menselijke plasma en de monsterplasma's 500-voudig door toevoeging van 400 µL HBS pH 7,4.Bepaal de stollingstijd voor normale menselijke plasma in elk van de onbekende plasma-assaymonsters aan de hand van de absorptie-versus-tijdprofielen in SoftMax Pro. Gebruik, rekening houdend met de 500-voudige verdunning, de stollingstijd van elk monster om de tweefasenactiviteit van factor V te berekenen aan de hand van de éénfasenstandaardcurve van factor V van stollingstijd versus activiteit. Dit vertegenwoordigt de tweefasenactiviteit van factor V of de activiteit met opzettelijke activatie door trombine.De totale factor V-activiteit kan vervolgens worden berekend als de factor V twee-stapsactiviteit minus de factor V één-stapsactiviteit. De standaardcurve van de logaritme van de stollingstijd tegenover de logaritme van de factor V-activiteit werd gebruikt om de factor V-activiteit te meten in normaal menselijk plasma en in plasma van negen patiënten met gedissemineerde intravasale stolling of DIC. Alle negen DIC-patiënten vertoonden factor V één-stapsactiviteiten en initiële stollingstijden die gemiddeld met 54% en 18% waren afgenomen. De factor V twee-stapsactiviteit en de totale activiteit waren bij de DIC-patiënten gemiddeld met 44% en 42% afgenomen in vergelijking met het normale menselijke plasma.De factor vijf en de DIC-patiënten resulteerden in een verlengde tijd en een vertraagde snelheid van vezelstolselvorming. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u deze methode in uw laboratorium kunt implementeren. De methode kan eenvoudig worden aangepast om de activiteit van elke stollingsfactor in plasma te meten, waardoor deze geschikt is voor een breed scala aan onderzoeks- en klinische toepassingen.Uiteindelijk zal deze informatie over factor V een positieve impact hebben op de gezondheidszorg door een vroegere diagnose en behandeling van trombotische stoornissen of bloedingsstoornissen, zoals DIC.

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Dit protocol onderzoekt het gebruik van extracellulair vesikel (EV)-rijk plasma als indicator van het stollingsvermogen van EV. EV-rijk plasma wordt verkregen door een proces van differentiële centrifugatie en daaropvolgende recalcificatie.

Bepaling van de procoagulerende activiteit van extracellulaire blaasjes (EV) met behulp van EV-geactiveerde stollingstijd (EV-ACT)

Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.

Extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kwantificeren van het percentage Tissue Factor (TF)-positieve bloedplaatjes met behulp van flowcytometrie van vol bloed, waarbij het eiwit wordt beoordeeld: (1) intracellulair in rusttoestand, en (2) op het celoppervlak, zowel in rusttoestand als in geactiveerde toestand. Er wordt ook begeleiding gegeven voor het evalueren van TF-positieve bloedplaatjes in bloedplaatjesrijk plasma.

Stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes

We presenteren een benchtop-protocol om trombose te induceren in ventriculaire hulpmiddelen (VAD) binnen een recirculerend testplatform. Deze methode dient om trombogene hotspots in het bloedstroompad te identificeren en kan helpen de tromboresistentie te verbeteren voorafgaand aan preklinische tests in diermodellen.

In vitro Trombosetest voor ventriculaire hulpmiddelen

Dit werk beschrijft een microfluissue-assay die schuifspanning gebruikt om de vorming van tromben in het bloed te triggeren en karakteriseert de trombus aan de hand van meerdere dimensies van uitlezen. De test kan de protrombische neiging van bloedmonsters meten en is daardoor nuttig voor ziektediagnose, geneesmiddelenontdekking, evenals basismechanistische studies gerelateerd aan trombose.

Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

Dit protocol beschrijft de Nijmegen Hemostasis Assay, die gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie mogelijk maakt om een geïntegreerde beoordeling van stolling en fibrinolyse te bieden. De assay heeft als doel de karakterisering van het hemostatische evenwicht in onderzoek en klinische omgevingen te verbeteren, buiten het bereik van conventionele hemostatische tests.

De Nijmegen Hemostasis-assay: gelijktijdige fluorogene meting van trombine- en plasminegeneratie in één put

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Leer een microplaatcoagulatietest om Factor V-activiteit te meten in humaan plasma tijdens fibrinestolselvorming. Deze snelle, kostenefficiënte methode biedt hoge doorvoer voor onderzoek naar stollingsstoornissen.

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

Meer video's verkennen