Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

Het algemene doel van de volgende procedure was het ontwikkelen van een microplaatassay die de activiteit van het stollingsproteïne factor V meet tijdens de vorming van een fibrinestolsel in menselijk plasma. Als reactie op een letsel wordt het bloedstollingsproces geactiveerd, wat resulteert in een reeks conversiereacties van zymogeen naar protease die uiteindelijk leiden tot de generatie van het stollingsenzym trombine; trombine splitst oplosbaar fibrinogeen in fibrinemonomeren, die vervolgens aggregeren om een onoplosbaar fibrinestolsel te vormen. Normaal gesproken blijft bloed in een gezonde of ongedeukte staat een vrijvloeiende vloeistof, en is de hoeveelheid gevormd fibrine gelijk aan de hoeveelheid afgebroken of gedegradeerd fibrine.

Echter, in bepaalde ziektegevallen leidt overmatige stolling tot hartaandoeningen en beroertes, terwijl onvoldoende stolling leidt tot bloedingsneigingen, die vaak worden gezien bij hemofilieën. Factor V is een eiwit in het plasma dat in zijn geactiveerde vorm, factor Va, een cruciale versneller is van thrombinegeneratie tijdens de vorming van fibrine-stolsels als onderdeel van het prothrombine-enzymcomplex; prothrombine bestaat uit vier componenten: factor Xa, de protease, factor Va, de cofactor, lipiden, het oppervlak en calcium. De aanwezigheid van factor Va verhoogt de katalytische efficiëntie of kcat van factor Xa ten opzichte van het substraat prothrombine met ongeveer 3000 keer, waardoor de thrombinegeneratie en de vorming van fibrine-stolsels aanzienlijk worden versterkt.

Het microplaatplatform geniet de voorkeur voor het meten van enzymgecatalyseerde processen vanwege het gemak, de tijdswinst, de kleine monstervolumes, continue monitoring en de hoge doorvoer. De vorming van een fibrinestolsel kan worden gemonitord met een microplaatlezer door de toename van de lichtabsorptie van plasma te meten wanneer dit verandert van een heldergeel uiterlijk zonder fibrinestolsel en minimale lichtabsorptie naar een ondoorzichtige, troebele verschijning met een fibrinestolsel en maximale lichtabsorptie. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige tilt-tube assays of assays met geautomatiseerde analysatoren, zijn dat de methode snel en goedkoop is, lage vereisten stelt aan het monstervolume en een hoge doorvoer heeft.

De assay meet de activiteit van onbedoeld geactiveerde en door trombine geactiveerde factor vijf om een volledige kwantitatieve beoordeling van de totale functionele activiteit te verkrijgen. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Derek Tilley, een masterstudent in het laboratorium. Om de factor vijf-activiteit in een plasmamonster te meten, is het noodzakelijk om factor vijf één-staps activiteit-standaardcurven op te stellen voor de tijd tot vorming van het fibrine-stollingssel in paneel A en de initiële snelheid van fibrine-stollingsvorming in paneel B, gebruikmakend van normaal menselijk plasma of NHP als standaard, dat per definitie één eenheid factor vijf-activiteit per mL bevat. Ontdooi het factor vijf-deficiënte plasma, het normaal menselijk plasma, de onbekende monsterplasma's en de tromboplastine bij 37 °C gedurende 10 minuten.

Meng het factor V-deficiënte plasma voorzichtig en breng het over naar afzonderlijke plastic wasbakken en incubeer op ijs. Bewaar het normale menselijke plasma en de onbekende monsterplasma's op ijs na voorzichtig mengen. Bewaar de 25 millimolaire calciumchloride in gedestilleerd water in een afzonderlijke wasbak bij kamertemperatuur voor de standaardcurven van de factor V één-staps activiteit.

Bereid 200 µL van elke tweevoudige seriële verdunning van normaal menselijk plasma van 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 en 512 voud in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ml microcentrifugebuisjes; vortex goed en incubeer op ijs. Bereid voor de onbekende plasmamonsters 200 µL van each 40-voudige verdunningen van normaal menselijk plasma en onbekende monsterplasma's in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Plaats vijf microwell-strips in de sjabloonhouder van de microplaatlezer.

Zet de microplaatlezer aan en open de Softmax Pro microplaat-applicatiesoftware. Voeg met een meerkanaalpipet gelijktijdig 50 µL factor vijf-deficiënt plasma toe aan alle putjes van de monster-microplaat. Voeg met een enkele pipet 50 µL van de voorbereide 10 seriële verdunningen van normaal menselijk plasma, de 40-voudige verdunningen van normaal menselijk plasma en de onbekende monsterplasma's toe aan afzonderlijke putjes van de microplaat. Voeg met een meerkanaalpipet 50 µL tromboplastine toe aan alle monsterputjes. Incubeer in de microplaatlezer bij 25 °C gedurende één minuut, waarbij gedurende 15 tot 25 seconden van deze incubatietijd wordt geschud.

Gebruik de computer die is gekoppeld aan de MICROPLATE-lezer om de Softmax Pro Microplate-applicatiesoftware te openen. Stel de Microplate-lezer in op een absorptiegolflengte van 405 nanometer, kineticmodus en een temperatuur van 25 graden Celsius. Programmeer de Microplate-lezer zodat deze de eerste vijf seconden na toevoeging van calciumchloride schudt en meet de absorptie bij 405 nanometer elke vijf seconden gedurende zes minuten. Daarna wordt het schudinterval van vijf seconden niet meegenomen in de berekende stollingstijden. Voeg met twee meerkanaals pipetten gelijktijdig 50 microliters calciumchloride toe aan de twee microplate-strips met monsters.

Wacht 15 seconden en druk onmiddellijk via de computer op het start-icoon in Softmax Pro om de assay te beginnen. Voor elk geanalyseerd plasmaproef

De mate van stollingsvorming wordt gedefinieerd als het verschil tussen de maximale en minimale absorbantie die wordt bereikt tijdens het stollingsproces aan het einde van de run. Gebruik de ABSORBANTIE-tijdsprofielen in Softmax Pro om de tijd, de initiële snelheid en de mate van stollingsvorming voor de seriële verdunning van normaal menselijk plasma te bepalen. Om de standaardcurven voor de eenstapsactiviteit van factor V op te stellen, worden de stollingstijden voor het 40 keer verdunde normaal menselijk plasma en de onbekende monsterplasma's gebruikt om de factor V-activiteit in units per ml te interpoleren vanuit de standaardcurve voor de eenstapsactiviteit van factor V.

Dit vertegenwoordigt de activiteit van factor vijf in één stadium, ofwel zonder opzettelijke activatie door trombine. Dit is een representatief voorbeeld van fibrinestolling in de factor vijf-assay over een bepaalde tijd, gegenereerd door de microplate-reader. Het profiel representeert de vorming van een fibrinestolsel met gebruik van 32 maal verdund normaal menselijk plasma in één enkele microplate.

De verticale as geeft de verandering in absorptie bij 405 nanometer aan die optrad als gevolg van de vorming van een fibrinestolsel. De tijd tot stolselvorming werd berekend als het middenpunt van de absorptie-tijdcurve, namelijk 36,4 seconden. De initiële snelheid van de stolselvorming werd berekend op 611,88 milli-eenheden per minuut.

De mate van wolkenvorming werd berekend op 0,35 eenheden. De factor vijf-assay meet nauwkeurig de initiële snelheid en de mate van wolkenvorming. Inspectie van de wells na voltooiing van de assay bevestigde dat er stolselvorming had plaatsgevonden.

Alle reacties bereikten ongeveer dezelfde mate van stolling, met een algemene verandering in absorbantie bij 405 nanometer van tussen 0,35 en 0,45 eenheden tussen de startabsorbantie voorafgaand aan en de maximale absorbantie na tromboplastine en calciumchloride. Representatieve voorbeelden van de factor V één-staps activiteit, de standaardcurve van stollingstijd in seconden versus factor V activiteit in units per ml en de initiële snelheid van stolling in milli-units per minuut versus factor V activiteit in units per ml voor normaal menselijk plasma worden respectievelijk getoond in paneel A en paneel B.

Aangezien factor vijf normaal gesproken door trombine wordt geactiveerd, is een tweede assay na toevoeging en incubatie met trombine cruciaal om de factor vijf tweestapsactiviteit van een plasmaproef nauwkeurig te meten, met opzettelijke activering door toegevoegde trombine voor de factor vijf tweestapsassay. Bereid 200 tot 300 µL gezuiverde trombine voor met een uiteindelijke concentratie van 100 nM in HBS pH 7.4 en incubeer dit op ijs; verdun 120 µL van het bovenstaande normale menselijke plasma en monsterplasma's 40- tot 100-voudig met 170 µL HBS pH 7.4 bevattend 2.8 mM.

Calciumchloride. Voeg 10 µL trombine toe aan elk monster om een uiteindelijke concentratie van 10 nM te bereiken. Vortex elk putje om te mengen en incubeer één minuut bij 37 °C. Verdun het normale menselijke plasma en de monsterplasma's 500-voudig door toevoeging van 400 µL HBS pH 7,4.

Bepaal de stollingstijd voor normale menselijke plasma in elk van de onbekende plasma-assaymonsters aan de hand van de absorptie-versus-tijdprofielen in SoftMax Pro. Gebruik, rekening houdend met de 500-voudige verdunning, de stollingstijd van elk monster om de tweefasenactiviteit van factor V te berekenen aan de hand van de éénfasenstandaardcurve van factor V van stollingstijd versus activiteit. Dit vertegenwoordigt de tweefasenactiviteit van factor V of de activiteit met opzettelijke activatie door trombine.

De totale factor V-activiteit kan vervolgens worden berekend als de factor V twee-stapsactiviteit minus de factor V één-stapsactiviteit. De standaardcurve van de logaritme van de stollingstijd tegenover de logaritme van de factor V-activiteit werd gebruikt om de factor V-activiteit te meten in normaal menselijk plasma en in plasma van negen patiënten met gedissemineerde intravasale stolling of DIC. Alle negen DIC-patiënten vertoonden factor V één-stapsactiviteiten en initiële stollingstijden die gemiddeld met 54% en 18% waren afgenomen. De factor V twee-stapsactiviteit en de totale activiteit waren bij de DIC-patiënten gemiddeld met 44% en 42% afgenomen in vergelijking met het normale menselijke plasma.

De factor vijf en de DIC-patiënten resulteerden in een verlengde tijd en een vertraagde snelheid van vezelstolselvorming. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u deze methode in uw laboratorium kunt implementeren. De methode kan eenvoudig worden aangepast om de activiteit van elke stollingsfactor in plasma te meten, waardoor deze geschikt is voor een breed scala aan onderzoeks- en klinische toepassingen.

Uiteindelijk zal deze informatie over factor V een positieve impact hebben op de gezondheidszorg door een vroegere diagnose en behandeling van trombotische stoornissen of bloedingsstoornissen, zoals DIC.