Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest
September 9th, 2012
Deze studie beschrijft een nieuwe microplaat test die FV stollingsactiviteit tijdens fibrine stolselvorming in menselijk plasma die niet eerder gerapporteerd. De methode gebruikt een kinetische microplaatlezer de verandering in absorptie bij 405 nm meet continu in fibrine stolselvorming in menselijk plasma.
Het algemene doel van de volgende procedure was om een microplaattest te ontwikkelen die de activiteit van een stollingsproteïne factor V meet tijdens de vorming van een fibrinekluitje in menselijk plasma. Als reactie op letsel wordt het bloedstollingsproces geactiveerd en resulteert dit in een reeks Xymogen naar protease conversiereacties die uiteindelijk leiden tot de generatie van het stollingsenzym trombine, trombine klieft oplosbaar fibrinogeen naar fibrine monomeren, die vervolgens associëren om een onoplosbaar fibrinekluitje te vormen. Normaal gesproken blijft het bloed als een vrij stromende vloeistof tijdens de gezonde of onbeschadigde toestand, en de hoeveelheid fibrine die wordt gevormd is gelijk aan de hoeveelheid fibrine die wordt afgebroken of gedegradeerd.
Echter, in bepaalde ziektesituaties leidt te veel stollen tot hartaandoeningen en beroerte, terwijl te weinig stollen leidt tot bloeitendende, die vaak worden gezien bij de hemofilieën. Factor V is een proteïne in plasma dat in zijn geactiveerde vorm factor vijf A een kritische versneller is van trombinegeneratie tijdens fibrinekluitjevorming als onderdeel van het protrombeenzymcomplex, protrombeen bestaat uit vier componenten factor 10 A, de protease factor vijf A, de co-factor lipide, het oppervlak en calcium. De meline factor vijf A verhoogt de katalytische efficiëntie of kcat van factor 10 A naar zijn substraat protrombeen met ongeveer 3000 keer, waardoor de trombinegeneratie en fibrinekluitjevorming aanzienlijk wordt verbeterd.
De microplaatplatform wordt geprefereerd voor het meten van enzymgekatalyseerde gebeurtenissen vanwege gemak, tijdskosten, kleine monstervolumes, continue monitoring en hoge doorvoer. Het gebeuren van fibrinekluitjevorming kan worden gemonitord met een microplaatlezer door het meten van de toename in lichtabsorptie van plasma terwijl het verandert van een heldere gele uiterlijk met geen fibrinekluitje aanwezig en minimale lichtabsorptie naar een ondoorzichtig troebel uiterlijk met een fibrinekluitje en maximale lichtabsorptie. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals handmatige schuifbuistests of tests met geautomatiseerde analyzers is dat de methode snel, goedkoop is, kleine monstervolumevereisten heeft en een hoge doorvoer heeft.
De test meet de activiteit van onbedoeld geactiveerde en trombine-geactiveerde factor vijf om een volledige kwantitatieve beoordeling van zijn totale functionele activiteit te verkrijgen. Het demonstreren van de techniek zal Derek Tilley zijn, een masterstudent in het laboratorium. Om de factor vijf-activiteit in een plasmamonster te meten, is het noodzakelijk om factor vijf een stadium-activiteit te construeren, standaardcurves van de tijd van fibrinekluitjevorming in paneel A en de initiële snelheid van fibrinekluitjevorming in paneel B met behulp van normaal menselijk plasma of NHP als standaard die per definitie een eenheid van factor vijf-activiteit per ML bevat, ontdooi de Factor vijf-deficiënte plasma, normaal menselijk plasma en monsterplasma onbekend en tromboplastine bij 37 graden gedurende 10 minuten.
Meng voorzichtig het factor vijf-deficiënte plasma en tromboplastie over in afzonderlijke plastic wasbakjes en incubeer op ijs. Bewaar het normale menselijke plasma en monsterplasma onbekend op ijs na voorzichtig te hebben gemengd. Bewaar de Calciumchloride 25 millimolair in gedistilleerd water in een aparte wasbak bij kamertemperatuur voor de factor vijf een stadium-activiteit standaardcurves.
Bereid 200 microliter van elke tweevoudige seriële verdunning van normaal menselijk plasma van 0 2 4 8 16 32 64, 1 28, 2 56 en 512 keer in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ml microcentrifugebuisjes, goed door elkaar roeren en incuberen op ijs. Voor de plasmamonster onbekend, bereid 200 microliter van elke 40 keer verdunning van normaal menselijk plasma en onbekend monsterplasma in HBS pH 7.4 met behulp van 1,5 ML microcentrifugebuisjes. Plaats vijf microwell strips in de sjabloonhouder van de microplaatlezer.
Zet de Microplaatlezer aan en open Softmax Pro microplaatapplicatiesoftware met behulp van een multi-kanaals pipetteerder. Voeg gelijktijdig 50 microliter van factor vijf-deficiënt plasma toe aan alle monstermicroplaatbuisjes met behulp van een enkele pipetteerder, voeg 50 microliter van de voorbereide 10 seriële verdunning van normaal menselijk plasma en de 40 keer verdunning van normaal menselijk plasma en monsterplasma onbekend toe aan afzonderlijke MICROPLATE buisjes met behulp van een multi-kanaals pipetteerder, voeg 50 microliter tromboplastie toe aan alle monsterbuisjes. Incubeer in de Microplaatlezer bij 25 graden Celsius gedurende één minuut met schudden gedurende de 15 tot 25 seconden van de één minuut incubatie.
Gebruik de computer die is aangesloten op de MICROPLATE lezer om toegang te krijgen tot Softmax Pro Microplate applicatiesoftware. Stel de Microplaatlezer in op absorptiegolflengte tot 405 nanometermodus naar kinetiek temperatuur tot 25 graden Celsius en programmeer de Microplaatlezer om de eerste vijf seconden na calciumchloridetoevoeging te schudden en absorptie bij 405 nanometer elke vijf seconden gedurende zes minuten te meten. Daarna is het vijf seconden schudinterval niet opgenomen in de berekende kluitjetijd met behulp van twee multi-kanaals pipetteerders tegelijkertijd 50 microliter calciumchloride toe te voegen aan de twee microplaatstrips met monsters.
Wacht 15 seconden en druk onmiddellijk op het startpictogram in Softmax Pro vanaf de computer om de test te beginnen. Voor elk geanalyseerde plasmamonster wordt de kluitjevormingstijd bepaald en gedefinieerd als de tijd in seconden om de half maximale toename in absorbentie te bereiken. De initiële snelheid van kluitjevorming wordt gedefinieerd als de snelheid van toename in absorbentie over de eerste vijf tijdstippen van de lineaire portie van de toename in absorbentie versus tijd.
De mate van kluitjevorming wordt gedefinieerd als het verschil tussen de maximale en minimale absorbentie die is bereikt tijdens het gebeuren van kluitjevorming aan het einde van de run. Gebruik de ABSORPTIE versus tijdprofielen in Softmax Pro om de tijd, initiële snelheid en mate van kluitjevorming te bepalen voor de serië
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe microplaattest ontworpen om factor V-stollingsactiviteit tijdens fibrine-stolselvorming in menselijk plasma te meten. Deze methode gebruikt een kinetische microplaatlezer om continu absorptiewijzigingen bij 405 nm te monitoren, wat inzichten geeft in het stollingproces.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Stollingsbiologie
- Hemostase
- Assayontwikkeling
Achtergrond
- Factor V speelt een cruciale rol in de stollingskascade, met name bij trombinegeneratie.
- Onevenwichtigheden in stollen kunnen leiden tot aandoeningen zoals hartziekten en hemofilie.
- Traditionele methoden voor het meten van stollingactiviteit kunnen tijdrovend zijn en vereisen grotere monstervolumes.
- De microplaattest biedt een hoogdoorvoeralternatief voor het beoordelen van stollingactiviteit.
Doel van de studie
- Om een snelle en efficiënte assay te ontwikkelen voor het meten van factor V-activiteit tijdens fibrine-stolselvorming.
- Om een kwantitatief beoordeling te geven van de functionele activiteit van factor V in menselijk plasma.
- Om de efficiëntie van de nieuwe methode te vergelijken met bestaande stollingtests.
Gebruikte methoden
- Bereiding van seriële verdunningen van normaal menselijk plasma voor standaardcurves.
- Gebruik van een microplaatlezer om absorptiewijzigingen tijdens stolselvorming te monitoren.
- Berekening van stolselvormingstijd, initiële snelheid en mate van stolselvorming.
- Vergelijking van resultaten met traditionele testmethoden.
Belangrijkste resultaten
- De microplaattest toonde een duidelijke correlatie tussen absorptiewijzigingen en stolselvorming.
- Factor V-activiteit kon nauwkeurig worden gekwantificeerd met behulp van de ontwikkelde standaardcurves.
- De methode bleek sneller te zijn en vereiste kleinere monstervolumes in vergelijking met traditionele tests.
- De resultaten gaven aan dat de test geschikt is voor hoogdoorvoerscherming van stollingactiviteit.
Conclusies
- De nieuwe microplaattest is een effectief hulpmiddel voor het meten van factor V-activiteit in menselijk plasma.
- Deze methode verbetert het begrip van stollingdynamiek in gezondheid en ziekte.
- Toekomstige toepassingen kunnen klinische diagnostiek en onderzoek naar stollingsaandoeningen omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microplate assay enables quantitative, high-throughput measurement of factor V activity in human plasma, supporting target validation in coagulation pathway research. By capturing time, rate, and extent of fibrin clot formation, it provides predictive confidence for mechanistic de-risking in thrombotic and bleeding disorder models. The assay’s sensitivity to low picomolar factor V levels and adaptability to other coagulation factors enhance its utility in early discovery and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures functional factor V activity to interrogate thrombin generation pathways and validate coagulation targets.
- Operational Value: Requires only microliter plasma volumes and completes in 6 minutes, enabling rapid hypothesis testing.
- Strategic Value: Distinguishes between basal and thrombin-activated factor V, improving target confidence in prothrombinase complex modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative absorbance-based readouts at 405 nm for time, initial rate, and extent of clot formation.
- Operational Value: Compatible with kinetic microplate readers, supporting automation and continuous monitoring.
- Strategic Value: Enables high-throughput screening of plasma samples for factor V deficiency or dysfunction in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated reduced factor V activity in disseminated intravascular coagulation (DIC) patient plasma, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Adaptable to measure any coagulation factor, increasing assay reuse across preclinical programs.
- Strategic Value: Provides total functional activity (two-stage minus one-stage) to improve predictive validity in thrombotic disorder studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, particularly for coagulation pathway modulators and antifibrotic or antifibrinolytic candidates.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of factor V’s role in thrombin generation and fibrin clot formation.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of plasma-based coagulation activity in 96-well format.
- Analytics: Delivers time (seconds), initial rate (milliunits/min), and extent (absorbance units) of clot formation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker development in coagulopathies like DIC, where factor V consumption correlates with disease severity.
- Enterprise Reuse: Platform design allows transfer to other coagulation factors, reducing redevelopment costs across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying both basal and thrombin-activated factor V contributions to total activity.
- Operational Value: Eliminates need for expensive automated coagulometers; uses standard microplate readers and low-cost reagents.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in coagulation target programs through early functional activity profiling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on factor V-dependent thrombin generation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in coagulation biochemistry and absorbance-based kinetic assays.
- Dependent on access to a temperature-controlled microplate reader with kinetic absorbance measurement at 405 nm.
- Necessitates standardized reagent preparation (factor V-deficient plasma, thromboplastin, calcium chloride, thrombin) and sample dilution protocols.
- Must account for pre-analytical variables in plasma sample handling (e.g., storage, freeze-thaw cycles) to avoid artifactual factor V activation.
- Limited to research use; not validated for clinical diagnostics or GMP manufacturing without additional regulatory qualification.
