Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen
April 19th, 2012
Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele cellen te isoleren voor transcriptoomanalyse op basis van microarrays. Dit wordt bereikt door eerst de retina uit het omliggende weefsel te dissekeren en deze vervolgens in afzonderlijke cellen te dissociëren. De tweede stap is om afzonderlijke cellen te oogsten en deze in PCR-buisjes met lysisbuffer te deponeren.
Vervolgens worden de cellen gelyseerd en wordt het CDNA geamplificeerd met behulp van reverse transcriptie, gevolgd door polymerasekettingreactie. Uiteindelijk wordt hybridisatie van het enkele cel CDNA op een A iMatrix-microarray gebruikt om de mRNA's die in een enkele cel worden tot expressie gebracht, te onthullen. Het grote voordeel van het profileren van de genexpressie in enkele cellen in vergelijking met het gebruik van gehele weefselbenaderingen is dat enkele celisolatie u toegang geeft tot zeer kleine populaties cellen die het gehele weefsel zouden omvatten.
Deze cellen kunnen alles zijn, van verschillende soorten neuronen tot kleine populaties stamcellen. Wat de enkelceltechniek ons toelaat om voor deze cellen te doen, is om zowel celtypen, specifieke markers voor deze kleine populaties cellen, als genennetwerken die in deze uiterst zeldzame subsetten van cellen tot expressie worden gebracht, te identificeren. Bovendien stelt de enkelcelprofileringstechniek ons in staat om de genennetwerken te identificeren die tijdelijk worden tot expressie gebracht tijdens zeer dynamische ontwikkelingsovergangen in zeer kleine subsetten van cellen.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsgenetica, zoals wanneer voorlopercellen beginnen genennetwerken tot expressie te brengen die geassocieerd zijn met differentiatie en hoe die voorlopercellen van elkaar verschillen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar cellulaire therapieën voor neurodegeneratieve ziekten zoals glaucoom, omdat we door de belangrijkste netwerken in de ontwikkeling van individuele cellen te verduidelijken, een stap dichterbij zijn bij het genereren van die cellen voor gebruik in cellulaire vervangende therapie. Begin deze procedure door de muisretina in een schaal gevuld met PBS te plaatsen.
Vervolgens verwijdert u het glasvocht en de lens. Verwijder vervolgens alle retinale pigmentepitheel. Incubeer de retina in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Daarna, tik voorzichtig op het buisje om eventuele bezonken cellen los te maken. Tri rateer het dan voorzichtig 10 tot 20 keer met een P 1000 pipetteerder. Als er grote weefselklonters aanhouden, incubeer het nog eens 10 minuten bij 37 graden Celsius en tri rateer het 10 tot 20 keer opnieuw.
Vervolgens voegt u vijf microliter DNA toe, één bij 10 eenheden per microliter aan de retina, en incubeer het gedurende vijf minuten. Tri rateer het vervolgens opnieuw voorzichtig met de P 1000 pipetteerder bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 keer. Centrifugeer het gedurende drie minuten bij 3000 RPM.
Vervolgens verwijdert u het supernatant en laat u 100 tot 200 microliter vloeistof aan de bodem. Tik op het buisje om het pellet los te maken. Vervolgens voegt u één milliliter HBSS toe en resuspendeert u het pellet met voorzichtig tation.
Centrifugeer het gedurende drie minuten bij 3000 RPM. Wanneer het klaar is, verwijdert u voorzichtig het supernatant. Resus, pend het in 450 microliter PBS met 0,1% BSA. In de volgende stap bereidt u twee zes centimeter schalen voor met vijf milliliter PBS gesupplementeerd met 0,1% BSA.
Beplaat vervolgens de gedissocieerde cellen op een schaal. Laat de cellen minimaal vijf minuten bezinken. Plaats vervolgens de schaal met gedissocieerde cellen onder een geïnverteerde microscoop.
Gebruik een fijne pipetteertip met een aspiratiebuis om een enkele cel te verzamelen. Plaats vervolgens de micropipet dicht bij de cel en deze zal gemakkelijk de micropipet binnengaan via capillaire actie. Vervolgens wordt de cel op een tweede schaal uitgespuwd en zorg ervoor dat slechts één cel wordt geoogst voor genexpressieprofilering.
Dit gebeurt door ofwel overtollige cellen te verwijderen of de cel van belang naar een andere locatie te verplaatsen met een nieuwe micropipet. Wanneer een individuele cel volledig is geïsoleerd van de aangrenzende cellen, gebruikt u een nieuwe micropipet om de cel van belang aan te zuigen. Vervolgens wordt deze direct in een PCR-buisje van 0,2 milliliter geplaatst dat 4,5 microliter cellysisbuffer bevat.
Spin het monster kort in een microcentrifuge om de cel in lysisbuffer te onderdompelen. Doe dit spinnen na elke vijfde cel en vervolgens opnieuw aan het einde van de verzameling. Vergeet niet om de buis gedurende de duur van de enkele celisolatie op ijs te houden en de enkele cellen binnen een twee uur raam na de dissociatie te verzamelen voor optimale resultaten in deze procedure, spin het monster kort in een microcentrifuge om ervoor te zorgen dat de enkele cel is ondergedompeld in de cellysisbuffer.
Om cellysis te bevorderen, incubeer het monster gedurende 90 seconden bij 70 graden Celsius in een thermocycler. Plaats vervolgens onmiddellijk de buis gedurende twee minuten terug op ijs. Om de reverse transcriptie uit te voeren, voegt u 0,33 microliter toe.
Superscript drie bij 200 eenheden per microliter 0,05 microliter remmer bij 40 eenheden per microliter en 0,07 microliter. T vier gen 32 eiwit naar de buis. Incubeer het reactiemengsel gedurende 50 minuten bij 50 graden Celsius in een thermocycler. Na 50 minuten, inactiveer het enzym gedurende nog eens 15 minuten bij 70 graden Celsius.
Wanneer dat klaar is, plaatst u de buis terug op ijs. Om de vrije primer te verwijderen, voegt u 0,1 microliter 10 x exonucleasebuffer, 0,8 microliter, D H2O en 0,1 microliter toe. Exonuclease, één bij 20 eenheden per microliter aan de buis. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een thermocycler.
Na 30 minuten inactiveert u het enzym door het reactiemengsel gedurende 25 minuten bij 80 graden Celsius
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van afzonderlijke retinale cellen en het versterken van hun cDNA's voor transcriptoomanalyse. De techniek stelt onderzoekers in staat om cellulaire heterogeniteit te onderzoeken en markergenen voor zeldzame celpopulaties te identificeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Single-cell transcriptomics biedt inzicht in cellulaire diversiteit.
- Het begrijpen van genexpressie in individuele cellen is cruciaal voor ontwikkelingsgenetica.
- Deze methode kan voorbijgaande gennetwerken tijdens ontwikkeling onthullen.
- Het heeft implicaties voor cellulaire therapieën bij neurodegeneratieve ziekten.
Doel van het onderzoek
- Om afzonderlijke retinale cellen te isoleren voor gedetailleerde genexpressieprofilering.
- Om specifieke markers te identificeren voor kleine populaties cellen.
- Om gennetwerken te verduidelijken die betrokken zijn bij celdifferentiatie.
Gebruikte methoden
- Dissectie van het netvlies en dissociatie in afzonderlijke cellen.
- Cellyse en cDNA-amplificatie via reverse transcriptie en PCR.
- Hybridisatie op microarrays om mRNA-expressie te analyseren.
- Isolatie van individuele cellen met behulp van een fijne puntpijp.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van afzonderlijke retinale cellen voor transcriptoomanalyse.
- Identificatie van genexpressieprofielen in zeldzame celpopulaties.
- Inzichten in ontwikkelingsovergangen in specifieke celtypen.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten.
Conclusies
- De methode verbetert het begrip van cellulaire heterogeniteit.
- Het biedt een raamwerk voor het bestuderen van genexpressie in kleine celpopulaties.
- Toekomstig onderzoek zou deze techniek kunnen gebruiken voor therapeutische vooruitgang.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of retinal neurons enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and identify rare cell populations critical for CNS target validation. This approach enhances predictive confidence in early discovery by revealing gene networks and markers that are masked in bulk tissue analyses. The method supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying developmental transitions and cell fate determinants relevant to neurodegenerative disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables identification of cell-type specific markers in rare neuronal subsets for functional target validation.
- Reveals gene expression programs active during transient developmental transitions, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates molecular classification of neuronal cell types, improving predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell gene expression profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Supports assay reproducibility by enabling quantitative measurement of mRNA expression in individual cells.
- Allows for the detection of contamination and specificity through gene-specific PCR validation of isolated cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by elucidating gene networks implicated in neurodegenerative disease models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by mapping developmental gene expression trajectories.
- Supports identification of candidate genes for cellular therapy development in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell profiling method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging hypothesis-driven target validation with translational biomarker identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving heterogeneity and clarifying gene networks in rare cell types.
- Screening: Delivers quantitative, cell-specific gene expression data for assay standardization and reproducibility.
- Analytics: Provides microarray and PCR-based readouts to compare gene expression across individual cells and conditions.
- Translational Research: Enables mapping of developmental gene expression relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for profiling diverse tissues and cell types across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and transcriptomic analysis for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying cell fate determinants and gene networks in rare populations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and candidate genes for neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell isolation, microarray analysis, and quantitative PCR.
- Demands access to specialized instrumentation for cell handling and transcriptomic profiling.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable to various tissues but may require optimization for different cell types or developmental stages.
- Potential limitations include technical variability in cell capture and amplification efficiency.
