Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van individuele cellen voor transcriptoomanalyse op basis van microarrays. Dit wordt bereikt door eerst het netvlies uit het omliggende weefsel te dissekeren en dit vervolgens te dissociëren tot individuele cellen. De tweede stap bestaat uit het oogsten van de individuele cellen en het overbrengen hiervan naar PCR-buisjes met lysisbuffer.

Vervolgens worden de cellen gelyseerd en wordt het cDNA geamplificeerd via reverse transcriptie, gevolgd door de polymerasekettingreactie. Uiteindelijk wordt hybridisatie van het enkelcel-cDNA op een A iMatrix-microarray gebruikt om de mRNA's die in een enkele cel tot expressie komen, in kaart te brengen. Het belangrijkste voordeel van het profileren van de genexpressie in enkelvoudige cellen ten opzichte van benaderingen met volledig weefsel is dat isolatie van enkelvoudige cellen toegang biedt tot zeer kleine celpopulaties die deel uitmaken van het gehele weefsel.

Deze cellen kunnen variëren van verschillende typen neuronen tot kleine populaties stamcellen. Met de single-cell-techniek kunnen we voor deze cellen zowel de celtypen als specifieke markers voor deze kleine celpopulaties identificeren, en gennetwerken vaststellen die tot expressie komen in deze uiterst zeldzame subsets van cellen. Daarnaast stelt de single-cell-profileringstechniek ons in staat om de gennetwerken te identificeren die tijdelijk tot expressie komen tijdens zeer dynamische ontwikkelingsfasen in zeer kleine subsets van cellen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de ontwikkelingsgenetica, zoals wanneer progenitorcellen gennetwerken gaan tot expressie brengen die geassocieerd zijn met differentiatie en hoe deze progenitorcellen van elkaar verschillen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot cellulaire therapieën voor neurodegeneratieve aandoeningen zoals glaucoom, omdat we door het verduidelijken van de belangrijkste netwerken in de ontwikkeling van individuele cellen een stap dichter bij het kunnen genereren van deze cellen voor gebruik in cellulaire vervangingstherapie staan. Begin deze procedure door de muisretina in een schaal gevuld met PBS te plaatsen.

Verwijder vervolgens het glasachtig lichaam en de lens. Verwijder daarna het volledige retinaal pigmentepitheel. Incubeer de retina in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter bij 37 °C gedurende 10 minuten.

Tik vervolgens voorzichtig tegen de buis om eventuele bezonken cellen los te maken. Tritureer het mengsel daarna voorzichtig 10 tot 20 keer met een P 1000 pipet. Als er nog steeds grote weefselklonten aanwezig zijn, incubeer het mengsel dan nog 10 minuten bij 37 °C en tritureer het opnieuw 10 tot 20 keer.

Voeg vervolgens vijf µL DNA toe, één van 10 units per µL, aan de retina en incubeer dit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng het daarna nogmaals voorzichtig met de P 1000 pipet door 10 tot 20 keer op en neer te pipetteren. Centrifugeer het geheel gedurende drie minuten bij 3000 RPM.

Verwijder vervolgens het supernatant en laat 100 tot 200 µL vloeistof op de bodem achter. Tik tegen de buis om het pellet los te maken. Voeg daarna één mL HBSS toe en resuspendeer het pellet door voorzichtig te roten.

Centrifugeer dit gedurende drie minuten bij 3000 RPM. Verwijder na afloop voorzichtig het supernatant. Resuspendeer het vervolgens in 450 µL PBS met 0,1% BSA. Bereid in de volgende stap twee schaaltjes van zes centimeter voor met vijf milliliter PBS aangevuld met 0,1% BSA.

Zaai vervolgens de gedissocieerde cellen uit op één schaal. Laat de cellen ten minste vijf minuten bezinken. Plaats de schaal met gedissocieerde cellen daarna onder een omgekeerde microscoop.

Gebruik een fijnpuntige pipet met een aspiratiebuis om een enkele cel te oogsten. Plaats vervolgens de micropipet dicht bij de cel, waarna deze door capillaire werking gemakkelijk in de micropipet zal worden opgenomen. Expelleer de cel vervolgens op een tweede schaaltje en zorg ervoor dat er slechts één cel wordt geoogst voor genexpressieprofielanalyse.

Dit gebeurt door ofwel overbodige cellen te verwijderen of door de cel van belang met een nieuwe micropipet naar een andere locatie te verplaatsen. Wanneer een individuele cel volledig is geïsoleerd van de naburige cellen, gebruik dan een nieuwe micropipet om de cel van belang op te zuigen. Expelleer deze vervolgens direct in een 0,2 milliliter PCR-buisje met 4,5 microliters cellysebuffer.

Centrifuge het monster kort in een microcentrifuge om de cel in de lysisbuffer te onderdompelen. Voer deze centrifugatie uit na elke vijfde cel en nogmaals aan het einde van de collectie. Vergeet niet om de buis gedurende de volledige isolatie van de enkele cellen op ijs te bewaren en verzamel de enkele cellen binnen een tijdspanne van twee uur na dissociatie voor optimale resultaten bij deze procedure; centrifugeer het monster kort in een microcentrifuge om ervoor te zorgen dat de enkele cel volledig is ondergedompeld in de lysisbuffer voor cellen.

Om de cellyse te bevorderen, wordt het monster 90 seconden bij 70 °C geïncubeerd in een thermocycler. Plaats de buis vervolgens onmiddellijk gedurende twee minuten terug op ijs. Voeg voor het uitvoeren van de reverse transcriptie 0,33 µL toe.

Superscript three bij 200 units per µL, 0,05 µL inhibitor bij 40 units per µL en 0,07 µL T four gene 32 protein aan de buis toevoegen. Incubeer het reactiemengsel gedurende 50 minuten bij 50 °C in een thermocycler; inactiveer na 50 minuten het enzym bij 70 °C gedurende nog eens 15 minuten.

Wanneer dit is voltooid, plaatst u de buis terug op ijs. Om de vrije primer te verwijderen, voegt u 0,1 µL 10x exonucleasebuffer, 0,8 µL DH₂O en 0,1 µL exonuclease (1 unit per µL) toe aan de buis en incubeert u deze 30 minuten bij 37 °C in een thermocycler.

Inactiveer na 30 minuten het enzym door het reactiemengsel 25 minuten lang te incuberen bij 80 °C. Plaats de buis aan het einde terug op ijs. Voeg vervolgens zes µL van het tailing-reactiemengsel toe aan het monster.

Incubeer het in de thermocycler bij 37 °C gedurende 20 minuten, bij 70 °C gedurende 10 minuten, en bewaar het vervolgens bij 4 °C. Voeg daarna 10 µL van het tailed monster toe aan het PCR-reactiemengsel. Voer de synthese van de tweede streng en de PCR-amplificatie uit om het cDNA te labelen.

Om een robuuste hybridisatie op iMatrix microarrays te verkrijgen, moet het CD NA eerst worden gefragmenteerd door 10 tot 20 µL van het single cell CD NA toe te voegen aan 8 µL 1x 1 for all buffer. Voeg vervolgens 1 µL van dit verdunde DNA toe aan een reactieoplossing van 80 µL. Voeg daarna 20 µL 5x TDT buffer, 2,5 µL biotine, 6 dDATP en 1 µL verdunde TDT toe.

Voeg vervolgens 20 µL 5x TDT-buffer, 2,5 µL biotine, 6 µL ddATP en 1 µL TDT toe. Incubeer het mengsel gedurende 90 minuten bij 37 °C. Daarna gedurende vijf minuten bij 65 °C.

Bewaar het vervolgens bij -20 °C of hybridiseer het onmiddellijk op een a iMatrix-microarray. Hier is een representatief voorbeeld van single-cell cDNA-smears en genspecifieke PCR's; banen A-F-G-N-H bevatten robuuste cDNA-smears, terwijl banen B, C, D en E aanzienlijk minder robuust zijn. cDNA's werden geïsoleerd uit fluorescente retinale ganglioncellen en vervolgens getest met behulp van PCR-primers specifiek voor de retinale ganglioncelmarkers BRN3B en PAC6, en genspecifieke PCR voor de fotoreceptormarker.

CRX werd gebruikt om het niveau van contaminatie in de individuele cel te bepalen. cDNA's en subgroepen van retinale ganglioncellen werden geïdentificeerd door te screenen op de aanwezigheid van het gen tachykinine 1. De microarray-resultaten voor geselecteerde genen die tot expressie komen in 22 verschillende individuele cellen worden weergegeven in de vorm van een heatmap.

De intensiteiten van de microarray-signalen zijn geschaald om overeen te komen met de intensiteit van de rode kleur, terwijl zwart de afwezigheid van een signaal op de microarray aangeeft. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals QPCR, worden gebruikt om het genexpressiepatroon dat in de microarray is waargenomen te bevestigen. Resultaten van de C-hybridisatie kunnen ook worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over de locaties van cellen die specifieke genen tot expressie brengen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u retina's kunt dissociëren, individuele cellen kunt isoleren en cDNA kunt genereren uit deze individuele cellen voor hybridisatie op een microarray.