Name: Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Leer single-cell transcriptoomanalyse van netvliescellen met microarray-hybridisatie. Deze methode onthult celheterogeniteit en identificeert markers voor zeldzame celpopulaties in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Cell Dissociatie <ol><li> Een stroomdiagram waarin het protocol wordt getoond is fig. 1. Voor de catalogusnummers van de specifieke reagentia gebruikt in dit protocol wordt verwezen naar tabel 1. Ontleden het netvlies in een PBS bad. Bij de dissectie is het best om het glasvocht en de lens te verwijderen omdat ze te houden met het netvlies kan belemmeren de dissociatie. Het is niet altijd een belangrijke vereiste voor alle retinale pigment (RPE) te verwijderen en in sommige gevallen kan het niet volledig te verwijderen. Voor enkele cel profilering experimenten fotoreceptoren moet de RPE worden verwijderd. Als de RPE te verwijderen kan leiden tot verontreiniging van de staaf cel profielen met RPE uitgedrukte genen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verbinding tussen de fotoreceptoren en RPE. Voor de dissociatie worden totale volwassen muizen netvlies geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 min in een 1,5 ml microcentrifugebuisje met 20il geactiveerde papaïne, 20 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en 360 ul Balanced Salt Solution Hank&#39;s (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES. Filter-tip pipetpunten worden gebruikt voor alle stappen in het protocol naar mogelijke besmetting te minimaliseren. De papaïne concentratie en de incubatietijd is afhankelijk van de leeftijd en de aard van het weefsel. Bijvoorbeeld dissociëren ontwikkeling netvlies geïsoleerd op postnatale dag 0 (P0) incuberen van de retina in 10 pi geactiveerde papaïne, 10 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en 380 ul Balanced Salt Hank&#39;s oplossing (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES gedurende 10 min. bij 37 ° C. Netvlies van verschillende soorten vereisen ook enigszins andere omstandigheden. Chicken netvliezen zijn dunner dan de muis netvliezen bij de meeste stadia van ontwikkeling. Met 10 pi geactiveerde papaïne, 10 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en Balanced Salt 380 pi Hank&#39;s oplossing (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES gedurende 5 min bij 37 ° C voldoende om t dissociëreneze netvliezen. </li><li> Tik voorzichtig tegen de buis aan een geregeld cellen los te maken, dan voorzichtig 10-20 keer fijnstampen met een P1000 pipet. Incubeer gedurende nog eens 10 min bij 37 ° C als er grote klonten van het weefsel daarna blijven bestaan ​​en opnieuw te vermalen 10-20 keer. </li><li> Voeg 5 ul DNase I (10 U / pl) en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vermaal voorzichtig met een pipet P1000. Het exacte aantal malen moet empirisch worden bepaald, maar in het algemeen ligt tussen 10-20. </li><li> Centrifugeer in een tafelblad centrifuge bij 3000 rpm gedurende 3 min Verwijder het supernatant, waarbij 100 tot 200 ul van vloeistof op de bodem en tik de buis aan de pellet verwijderen. Voeg 1 ml HBSS en resuspendeer de pellet met zachte tritureren. Door op de buis is van cruciaal belang hier zo eenvoudig resuspenderen de pellet met lyseren veel van de retinale cellen. Dit geldt vooral met volwassen muizen netvliezen. </li><li> Centrifuge bij 3000 rpm gedurende 3 min Verwijder de supernatant en hersuspenderen in 450 pi PBS bevattenING 0,1% BSA. Het is belangrijk om zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk opheffen de aanwezigheid van mRNA van gelyseerde cellen en een product uit dissociatie die kan remmen toekomst te minimaliseren. </li></ol> 2. Oogsten enkele cellen <ol><li> Bereid twee 6 cm schalen 5 ml PBS aangevuld met 0,1% BSA. Plaat het gedissocieerde cellen op een schaal en laat de cellen te regelen ten minste 5 minuten. De gebruikte celdichtheid sterk afhankelijk van de aard van de interne cellen worden geprofileerd. Bijvoorbeeld voor zeldzame cellen gelabeld met een fluorescerende merker dergelijke GFP worden hele gescheiden netvlies uitgeplaat op een 6 cm schotel. Voor cellen die enigszins overvloediger zijn minder cellen eerst bedekt om het gemakkelijker een (of dicht bij een) cel oogsten met de eerste micropipet. </li><li> Plaats de plaat van gescheiden cellen op een omgekeerde microscoop. We gebruiken de IMT-2-model van Olympus. Met behulp van micropipetten die zijn gevestigd op een fine tip (inwendige diameter 0,5 mm, 1,04 mm buitendiameter) (Figuur 2) en samen met een aspiratorinstelling buis oogsten een cel. De cellen gemakkelijk op de micropipet wanneer het in de nabijheid daarvan op de schotel. Het is cruciaal dat de aspirator buis niet te lang of te kort voor de afstand tot het podium in verband met de omgekeerde microscoop (De aspirator buizen gebruiken we met onze omgekeerde microscoop zijn 38,1 cm lang). Indien de buis te lang is, kunnen cellen niet efficiënt worden uitgezet micropipet de verzamelbuis. De belangrijkste reden dat we gebruik maken van de oudere IMT-2-model omgekeerde microscoop is dat we hebben gevonden heeft het de ideale afstand tot het podium voor onze aspirator montage buizen. Na het invoeren van de micropipet, wordt de cel (of cellen) uitgezet op een tweede plaat (wassen plaat) om ervoor te zorgen dat een en slechts een cel wordt geoogst voor de gen expressie profilering. Op de tweede plaat is vaak nodig om een ​​vreemde cellen te verwijderen met een nieuwe micropipetof verplaats de cel van belang zijn voor een andere locatie om ervoor te zorgen dat slechts een enkele cel van de micropipet binnenkomt. </li><li> Wanneer een individu cel volledig is geïsoleerd van naburige cellen, gebruik een nieuwe micropipet naar de cel van belang te zuigen als in paragraaf 2.2 en vervolgens direct te verdrijven hem in een 0,2 ml PCR-buis met 4,5 pl cellysis buffer. De cel wordt uitgedreven aan de zijkant van de buis, dat evenwel niet afbreken de punt van de micropipet in de buis. De monsters kunnen in het kort worden gesponnen in een tafelmodel microcentrifuge naar de cel in lysisbuffer onder te dompelen. Deze draaiende gebeurt meestal na elke vijfde cel en vervolgens weer aan het einde van collection.Tubes met individuele cellen in lysisbuffer worden op ijs gehouden voor de duur van een enkele cel geïsoleerd. Voor optimale resultaten worden enkele cellen verzameld binnen een twee uur durende venster post-dissociatie. Na deze tijd is verstreken, is het het beste om door te gaan naar de reverse transcriptie stap aangezien extra tijd is waarneembareed de kans RNA verslechteren. </li></ol> 3. Reverse transcriptie <ol><li> In het kort draaien de monsters in een benchtop minicentrifuge om ervoor te zorgen alle afzonderlijke cellen worden ondergedompeld in de cel lysis buffer. Om cellysis bevorderen incuberen het monster bij 70 ° C gedurende 90 sec. een thermocycler. Onmiddellijk zetten de buizen weer op het ijs. </li><li> Laat de buizen op ijs gedurende 2 minuten. Voor alle reagentia die toevoegingen, gebruik filter-tip pipet tips om besmetting te voorkomen. De omgekeerde transcriptie uitvoeren toe 0,33 pl Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl RNase-inhibitor (40 U / pl), en 0,07 pi T4 gen 32 eiwit. Incubeer het reactiemengsel gedurende 50 min bij 50 ° C in een thermocycler. Inactiveren het enzym bij 70 ° C gedurende 15 min en plaats op ijs. </li><li> Om de gratis primer te verwijderen, toe te voegen 0,1 pl exonuclease Buffer (10x), 0,8 ul dH 2 0 (moleculaire biologie graad), en 0,1 pl exonuclease I (20 U / pl). Incuberen bij 37 ° C gedurende 30 min ineen thermocycler. Inactiveren het enzym door het incuberen van de reactie bij 80 ° C gedurende 25 min. en plaatsen van de buizen op ijs. </li></ol> 4. Tailing en Single-Cell PCR <ol><li> Voeg 6 ul van het reactiemengsel en staart gebruiken thermocycler het monster incuberen bij 37 ° C gedurende 20 min, 70 ° C gedurende 10 min, en houden bij 4 ° C </li><li> Voeg 10 ul van de staart monster aan de PCR-reactiemengsel en het uitvoeren van de tweede streng synthese en PCR amplificatie met behulp van de volgende voorwaarden: <ol><li> 95 ° C gedurende 2 min </li><li> 37 ° C gedurende 5 min </li><li> 72 ° C gedurende 16 min </li><li> 93 ° C gedurende 40 sec </li><li> 67 ° C gedurende 1 min. </li><li> 72 ° C gedurende 6 min, toegevoegd 6 sec per cyclus </li><li> Ga naar 4 34 keer stap </li><li> 72 ° C gedurende 10 min </li><li> Houd bij 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Etikettering voor Affymetrix Chips <ol><li> Label 10-20 ug van cDNA (de concentratie van het geamplificeerde cDNA resultaatING uit een enkele cel is meestal op ~ 1 ug / ul) om een ​​robuuste hybridisatie op Affymetrix microarrays te verkrijgen. Eerst fragment het cDNA door toevoeging 10-20 ul van de eencellige cDNA 8 pi 1 x One-Phor-All-buffer en 1 pi van verdunde (1:10 in 1X One-Phor-All buffer) DNasel in 80 pi reactie. Incubeer in een thermocycler voor 13 min bij 37 ° C. Inactiveren de DNase I gedurende 15 min bij 100 ° C plaats en op ijs. </li><li> Voeg 20 pi 5X TdT buffer, 2,5 pi biotine N6-ddATP (Enzo Biosciences), en 1 pi TdT (verdund 1:08 in TdT buffer). </li><li> Incubeer 90 min bij 37 ° C, daarna 5 min bij 65 ° C. Bewaar bij -20 ° C of hybridiseren onmiddellijk naar een Affymetrix microarray. De hybridisatie wordt uitgevoerd met standaard Affymetrix-protocollen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Om de kwaliteit van de cDNA, 10 pi van de cDNA monster beoordelen werd geladen op een 1% agarose gel. Het cDNA wordt voornamelijk beoordeeld door de orde van grootte (500-2000 bp)en intensiteit van de cDNA uitstrijkje (figuur 1 en figuur 3a). In de gel in figuur 1, om de baan toont een cDNA uitstrijk van retinacellen geïsoleerd E16.5. De banen zien tussen de daaruit voortvloeiende vegen wanneer alleen de media wordt verslikken in de naald en gestort in het PCR-buis. Deze banen zijn nooit helemaal verstoken van een zwakke uitstrijkje, maar ze vertonen geen resultaten bij het gen-specifieke PCR-primers worden gebruikt om genen van hen te versterken. Daarnaast kan de intensiteit van de cDNA uitstrijkje enigszins variëren (vergelijk figuur 1 en figuur 3a). In figuur 3a banen a, f, g en h bevatten robuuste cDNA uitstrijkjes terwijl doorgangen b, c, d en e aanmerkelijk minder robuust. Gene-specifieke PCR wordt gebruikt als tweede scherm van de kwaliteit van de cDNA uit een enkele cel. De cDNA&#39;s in figuur 3 werden geïsoleerd uit fluorescerende retinale ganglioncellen en ze waren tested met behulp van PCR-primers voor de retinale ganglion cel markers Brn3b en PAX6. Voor deze test werd 1 pi van de cDNA onderworpen aan PCR 30 cycli. Real-time kwantitatieve PCR zou voorkeur assay, maar het kan kostbaar en niet noodzakelijk is voor de beoordeling van de cDNA alleen kwaliteit. Alle 8 van de individuele cellen positief getest op Brn3b en 6 uit 8 voor PAX6 (figuur 3b). Zelfs de cDNA uitstrijkjes die minder robuust geproduceerd banden voor Brn3b en PAX6. Ondanks deze PCR-resultaten, is het onze ervaring dat cDNA uitstrijkjes zoals die in lanen b, c, d en e niet robuust hybridisaties rendement op Affymetrix arrays en zijn over het algemeen vermeden. Gene specifieke PCR voor de fotogeleider marker Crx werd gebruikt om de mate van verontreiniging in de cel cDNA (figuur 3b) te bepalen. Een fotoreceptor marker is gekozen omdat deze cellen vormen de meerderheid van het netvlies (~ 70%) en daarom zou een cellysis die zich het meest waarschijnlijk te betrekken staaf photoreceptors. Er werd slechts een zwakke hoeveelheid Crx in deze cDNA preparaten ook na 30 cycli van PCR. Tenslotte kan deze PCR scherm worden beginnen te bepalen welke subsets van een bepaald celtype de cDNA&#39;s werden afgeleid van voor deze te onderwerpen aan een volledig microarray profilering. Dit kan helpen om de cellen die zijn geprofileerd, want dit is de duurste stap in het proces te prioriteren. Zo hebben wij vastgesteld subsets van retinale ganglioncellen door screening aan de aanwezigheid van het gen Tachykinin1 (figuur 3b). Van de kleine PCR-gebaseerde scherm, zijn vooral enkele cellen gekozen en hun cDNA&#39;s gehybridiseerd aan een microarray Affymetrix. De microarray gegevens worden vergeleken en patronen kunnen worden ontdekt met behulp van standaard clustering algoritmen. Heatmaps, zoals in figuur 4, worden gegenereerd grafisch vertegenwoordigen data. Er zijn twee belangrijke conclusies met betrekking tot de enkele cel profilering gegevens in figuur4. Eerst worden genen uitgedrukt in specifieke celtypen vrijwel uitsluitend in deze celtypen na cel protocol wordt uitgevoerd. In de meeste gevallen waar markergenen een celtype ook in een tweede celtype, zoals de waarneming dat de bipolaire cellen sommige &quot;rod&quot; genen tot expressie op een lager niveau, dat expressie in de tweede cel type gemakkelijk bevestigd door een in situ hybridisatie of antilichaam kleuring. Ten tweede, binnen de meer diverse amacrine en ganglion cel profielen, heterogeniteit van genexpressie is meteen duidelijk. Pou4f1 wordt alleen uitgedrukt in ongeveer 1/4 van de zich ontwikkelende ganglion cellen, terwijl Nr4a2 en Scube2 zijn twee voorbeelden van heterogeen uitgedrukte genen in verschillende amacrine cellen. In feite is de genen die in de heatmap zijn slechts een kleine greep als een paar honderd genen geïdentificeerd en bevestigd als markers van de ontwikkeling van ganglion cellen of als markers van verschillende populaties van amacrine cellen 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figuur 1. Flowchart van de enkele cel profilering methode. Eerste netvliezen zijn geïsoleerd en gescheiden in afzonderlijke cellen met behulp van papaïne. Ten tweede worden enkele cellen geoogst met een getrokken glazen naald en gestort op PCR-buisjes. De cellen worden gelyseerd en de cDNA geamplificeerd met reverse transcriptie gevolgd door PCR. Het resulterende cDNA kwaliteit wordt beoordeeld op een agarose gel zoals weergegeven is. Na de DNA-ladder in de eerste baan, de lanen tonen cDNA uitstrijkjes van enkelvoudige cellen (aangegeven door de rode haakjes) afgewisseld met amplificatieproducten van media-controles. Uitstrijkjes van deze kwaliteit (rood tussen haakjes) worden gehybridiseerd met Affymetrix microarrays. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figuur 2. Foto&#39;s van de naalden en aspirator binnenband. Single cellen geïsoleerd door de capillaire werking van eengetrokken glas micropipet (inwendige diameter 0,5 mm, 1,04 mm buitendiameter) en overgedragen door de druk van blazen in aspirator. Het is belangrijk dat de aspirator buis is lang genoeg om gemakkelijk te manipuleren en kort genoeg om een ​​betrouwbare ontladen individuele cellen. Een close-up van de capillaire buis getrokken in een naald is te zien in B. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatief voorbeeld van een cel cDNA vlekken en gen specifieke PCR. Om de kwaliteit van deze cel cDNA na versterking te bepalen, werden 10 pi van elke cel voorbeeld uit een 1% agarose gel samen met een negatieve controle (A). Een uitstrijkje moeten verschijnen tussen de 500-2000 bp. Extra PCR screening specifieke genen te identificeren / het type cel werd geïsoleerd en de hoeveelheid verontreiniging in het monster (B) te bevestigen. Primers specifiek voor de retinale ganglion cel markers Brn3ben PAX6 werden getest om de identiteit van deze cellen (rij 1 en 2) te bevestigen. Om de hoeveelheid fotoreceptor vervuiling te beoordelen bij de voorbereiding, werden primers specifiek voor de fotoreceptor marker Crx gebruikt (Row 3). Subsets van ganglion cellen kan ook worden bepaald door screening markers zoals Tachykinin1 (Row 4). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figuur 4. Enkele cel expressie van marker-genen. De microarray resultaten voor geselecteerde genen die tot expressie in 22 verschillende individuele cellen worden weergegeven in een heatmap formaat. De intensiteiten van de microarray signalen geschaald te corresponderen met de intensiteit van de rode kleur. Zwart geeft de afwezigheid van het signaal op de microarray. De retinale ganglion cel aangegeven (RGC) precursoren geïsoleerd uit embryonale tijdstippen, terwijl de andere cellen werden geïsoleerd uit volwassen netvlies.

<ol><li>Tietjen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+of+neuronal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.</a> Neuron. 38, 161-175 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+of+developing+retinal+ganglion+and+amacrine+cells+revealed+through+single+cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+preferentially+in+the+developing+peripheral+margin+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup.</a> Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).</li>
<li>Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+diversification+of+retinal+amacrine+interneurons+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li>
<li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li>
<li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159(2006).</li>
<li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+retinal+progenitor+cells+display+extensive+heterogeneity+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e1588(2008).</li>
<li>Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+problem+of+neuronal+cell+types%3A+a+physiological+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach.</a> Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).</li>
<li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity%3A+too+many+cell+types+for+comfort%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity: too many cell types for comfort.</a> Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).</li>
<li>Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination in the vertebrate retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).</li>
<li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+markers+of+bipolar+cells+in+the+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina.</a> J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).</li>
<li>Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+noise+controls+lineage+choice+in+mammalian+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells.</a> Nature. 453, 544-547 (2008).</li>
<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+the+myth+of+the+average+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and the myth of the average cell.</a> Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confronting+complexity%3A+strategies+for+understanding+the+microcircuitry+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of mouse retinal development.</a> PLoS Biol. 2, e247(2004).</li>
<li>Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+gene+expression+program+of+mammalian+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).</li>
<li>Chowers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+preferentially+expressed+in+the+retina+using+a+custom+human+retina+cDNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).</li>
<li>Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-hit+model+of+cell+death+in+inherited+neuronal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations.</a> Nature. 406, 195-199 (2000).</li>
<li>McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus%3A+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li>
<li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li>
<li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18(2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een steeds groeiend aantal studies zijn onthullend robuuste cel-tot-cel variatie in populaties die werden geloofd om meer homogeen zijn met betrekking tot hun genexpressie 6,8. In ten minste een geval, dit genexpressie &quot;ruis&quot; blijkt een belangrijke biologische functie 13 spelen. Genexpressie verschillen tussen individuele cellen worden verduisterd met behulp van traditionele gehele weefsel methoden. Deze experimenten genereren de expressie profiel van een &quot;gemiddelde&quot; cel, die m...

single-cell profilering van het ontwikkelen en jong netvlies neuronen

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Zeer gespecialiseerde, maar zeer kleine populaties van cellen spelen een belangrijke rol in vele weefsels. De identificatie van cel-type specifieke markers en gen-expressie-programma&#39;s voor uiterst zeldzame cel subsets is een uitdaging met behulp van standaard hele weefsel benaderingen. Gene expression profiling van individuele cellen zorgt voor een ongekende toegang tot de celtypen die slechts een klein percentage van de totale weefsel 1-7 omvatten. Bovendien kan deze methode worden de genexpressie&#39;s die tijdelijk worden uitgedrukt in een klein aantal cellen gedurende dynamische ontwikkeling overgangen 8 onderzoeken. Dit nummer van cellulaire diversiteit ontstaat herhaaldelijk in het centrale zenuwstelsel (CZS), waar de neuronale verbindingen kunnen ontstaan ​​tussen zeer divers cellen 9. Het exacte aantal verschillende celtypen is niet precies bekend, maar het is geschat dat er sprake kan zijn maar liefst 1000 verschillende soorten in de cortex itself 10. De functie (s) van complexe neurale circuits kan beroepen op een aantal van de zeldzame neuronale types en de genen die ze uit te drukken. Door het identificeren van nieuwe markers en te helpen bij moleculair classificeren verschillende neuronen, de single-cell benadering is met name nuttig bij de analyse van celtypes in het zenuwstelsel. Het kan ook helpen om de mechanismen van neurale ontwikkeling toe te lichten door het identificeren van differentieel tot expressie genen en wegen tijdens de vroege stadia van de neuronale voorlopercellen ontwikkeling. Als een eenvoudige, gemakkelijk te bereiken weefsel met veel neuronale diversiteit, de gewervelde netvlies is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de processen van ontwikkeling van de cellen, neuronale differentiatie en neuronale diversificatie. Echter, zoals in andere delen van het centrale zenuwstelsel, dit cellulair diversiteit kan een probleem vormen voor het bepalen van de genetische pathways die retinale voorouders rijden naar een specifieke lot van de cel vast te stellen, zeker gezien het feit dat staaf fotoreceptoren deel uitmaken van de mazal zijn van afwijkende de totale netvlies celpopulatie 11. Hier rapporteren een methode voor de identificatie van de transcripten uitgedrukt in een retinacellen (figuur 1). De single-cell profiling techniek maakt het mogelijk voor de beoordeling van het bedrag van heterogeniteit aanwezig in verschillende cellulaire populaties van het netvlies 2,4,5,12. Daarnaast is deze methode blijkt een groot aantal nieuwe kandidaat-genen die rol (len) kunnen spelen in het lot van de cel besluitvormingsprocessen die zich voordoen in subsets van het netvlies progenitorcellen 8. Met een aantal eenvoudige aanpassingen aan het protocol, kan deze techniek worden gebruikt voor veel verschillende weefsels en celtypes.

Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Zeer gespecialiseerde, maar uiterst kleine celpopulaties spelen belangrijke rollen in veel weefsels. De identificatie van celtype-specifieke markers en ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van individuele cellen voor transcriptoomanalyse op basis van microarrays. Dit wordt bereikt door eerst het netvlies uit het omliggende weefsel te dissekeren en dit vervolgens te dissociëren tot individuele cellen. De tweede stap bestaat uit het oogsten van de individuele cellen en het overbrengen hiervan naar PCR-buisjes met lysisbuffer.Vervolgens worden de cellen gelyseerd en wordt het cDNA geamplificeerd via reverse transcriptie, gevolgd door de polymerasekettingreactie. Uiteindelijk wordt hybridisatie van het enkelcel-cDNA op een A iMatrix-microarray gebruikt om de mRNA's die in een enkele cel tot expressie komen, in kaart te brengen. Het belangrijkste voordeel van het profileren van de genexpressie in enkelvoudige cellen ten opzichte van benaderingen met volledig weefsel is dat isolatie van enkelvoudige cellen toegang biedt tot zeer kleine celpopulaties die deel uitmaken van het gehele weefsel.Deze cellen kunnen variëren van verschillende typen neuronen tot kleine populaties stamcellen. Met de single-cell-techniek kunnen we voor deze cellen zowel de celtypen als specifieke markers voor deze kleine celpopulaties identificeren

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (2017) The video demonstrates the process of preparing, imaging, and tracking adult neural stem cells in real time to study cellular behaviors, including division and differentiation.

 Live Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Neural Lineage in Adult Neural Stem Cells

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde en uitgebreide voorbereidingsprocedure voor retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het is geschikt voor toepassingen waarbij synapsen in volwassen retinale organoïden worden geanalyseerd.

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Leer single-cell transcriptoomanalyse van netvliescellen met microarray-hybridisatie. Deze methode onthult celheterogeniteit en identificeert markers voor zeldzame celpopulaties in ontwikkelingsbiologie.

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Meer video's verkennen