Name: Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer lokale en globale methoden voor thermische nociceptie bij Drosophila-larven met warmteproeven en gedragsanalyse. Deze technieken helpen onderzoekers sensorische verwerking en pijnresponsen kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Christian Landry voor warmte-probe-ontwerp, Daniel Babcock voor de ontwikkeling van de larven warmte probe assay, Sean Sweeney voor de suggestie de hitteplaat proef, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly voorraden en Galko lab leden voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH R01 NS069828 om MJG en een NIH MARC U-STAR-trainingsprogramma Grant (T34GM079088 aan de Universiteit van Houston Downtown Academy Scholars) van minderheden toegang tot onderzoek loopbaan (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De hier beschreven assays kunnen worden gebruikt om kwalitatief en kwantitatief larven van verschillende genotypen van gevoeligheid voor thermische schadelijke stimuli. Een belangrijk kenmerk van de warmte-probe test is dat de prikkel wordt gegeven slechts op een enkele plaats. Dit leidt vermoedelijk om het afvuren van slechts een klein deel van klasse IV-neuronen degenen die in het segment contact met de sonde en misschien die van direct aangrenzende segmenten 11. Door de lokale stimulatie, de warmte probe assay bootst de gemeenschappelijke zintuiglijke ervaring van het opsporen van een schadelijke prikkel die gelokaliseerd is aan een bepaald lichaamsdeel, zoals een kant het contacteren van een hete kachel. Een nadeel van de warmte probe assay is dat een gebruiker tot gebruiker variabiliteit die waarschijnlijk te wijten aan drie factoren is: i) de druk waarmee de gebruiker de sonde geldt voor de larven, ii) de exacte locatie van de probe de larven opzichte van de onderliggende nociceptieve neuronen, en iii) de exacte angle waarbij de probe contact met het oppervlak van de larven. We eerder gemeld een kwantitatieve strategie classificeren larven in niet-responders, langzaam responders en snelle responders op hun verwijdering latentie een bepaalde temperatuur 1. Hier doen we verslag van larvale gevoeligheid voor nog hogere temperaturen. Interessant is, vinden wij dat er een plafond larvale thermische nociceptieve de reacties en dat dit plafond ligt tussen 52 en 54 ° C. Dit kan erop wijzen dat de larven niet een transient receptor potential (TRP) kanalen die in staat van gating bij temperaturen hoger dan 52 ° C bezitten Een andere mogelijkheid is het wel aan dat de neuronen en spieren gebruikt om te starten of het uitvoeren van de motorische respons beschadigd raken voordat ze zelfs kunnen functioneren in aversieve terugtrekking. Wij geven aan een andere analyse van de amplitude van de terugtrekking response-met behulp van het aantal rollen als indicator van het &quot;robuustheid&quot; van de reactie. Naïef, eenzou verwachten dat deze parameters zal toenemen bij toenemende temperatuur en tijd stimulatie. Verrassenderwijs we dat dit niet het geval is. Larven gestimuleerd langer bij een temperatuur aan de onderkant van de schadelijke bereik (42 ° C) tonen meer rollen en tijd voortschrijdende dan larven gehybridiseerd bij hogere temperaturen (48-52 ° C). Dit suggereert dat in de schadelijke temperatuur venster het vooral de blootstellingsduur dat de amplitude van de reactie bepaald. Aangezien larven blootgesteld aan zeer schadelijke temperatuur (48-52 ° C) gemiddeld reageren zeer snel, maar vertonen geen zoveel rolletjes larven blootgesteld aan een minder schadelijke temperatuur gedurende een langere tijd. De analyse van de respons amplitude die hier voegt een andere kwantitatieve dimensie waarlangs verschillende genotypen of het milieu manipulaties kunnen worden vergeleken. Een belangrijk kenmerk van de hitteplaat test is dat het een wereldwijde blootstelling aan de schadelijke gaatwarmte. Als zodanig is het meer verwant aan het dier zit in een cv-ketel is dan het aanraken van een hete kachel. Hoewel het niet duidelijk wanneer een larve kan een wereldwijd schadelijke stimulus in het wild te ervaren, in het lab de gedragsmatige reacties op dit wereldwijde blootstelling zijn complexer dan die waargenomen bij lokale stimulatie. Een sterk punt van de warmte plaat-test, ook opgemerkt door anderen 3, is dat het weinig user-to-user variabiliteit heeft sinds het aanraken van de larve is geen onderdeel van het protocol. De enige grote verschil lijkt te zijn bij het bepalen van wanneer elk gedrag begint en dit kan worden geminimaliseerd met herhaalde bekijken / vertrouwdheid. Een interessante verschil assays de temperaturen waarbij de aversieve gedrag beginnen. Deze zijn veel lager in de hitteplaat test dan met de hitte sonde. De eerste gedrag vertoonde bij larven contact met de warmte probe (kop en staart raise) kan een correleren van de kop thrash waargenomen ~ 27 ° C in de warmte plate assay. Het is mogelijk dat deze reactie &quot;ongemak&quot; meer dan &quot;pijn&quot; weerspiegelt. We hebben niet zagen een correlaat van zweepslagen, beslaglegging, en verlamming zelfs bij hoge (tot 48 ° C) temperaturen in de hitte probe assay en het kan zijn dat een kritische massa van sensorische neuron afvuren van meer dan een regio van het lichaam is nodig om deze gedrag. Interessant is dat de inbeslagneming en de verlamming gedrag waargenomen bij een temperatuur (~ 34 - 37 ° C) onder de onderkant van de nociceptieve drempel waargenomen met de warmte sonde te geven dat de wereldwijde stimulatie kan betekenen opsomming van de neuronale reacties die onvoldoende zijn om het gedrag te activeren met de lokale toepassing van de warmte probe. Dat deze temperaturen feite ervaren als schadelijk voor larven wordt ondersteund door de waarneming dat de larven verlamming gedrag beginnen en vervolgens liet men terug op fly voedsel niet in de meeste gevallen overleven (figuur 5C). Verdere ondersteuning van de stelling dat de warmte platen test is het uitlezen van nociceptieve reacties is het feit dat het blokkeren van synaptische transmissie in bekende nociceptieve sensorische neuronen van de latentie van de meeste van de waargenomen gedrag (Figuur 6) verhoogt. De observatie dat geen toename wachttijd voor de hogere temperatuur opkloppen gedrag suggereert dat andere sensorische neuronen die niet tot expressie md-Gal4 nodig zijn voor dit probleem. Kortom, assays omvatten belichten van een individu larve op een schadelijke thermische stimulus van bepaalde temperatuur - de tip van een metalen sonde in de lokale assay en onderdompeling in een druppel snel verwarmen water in de globale assay. Gedragsreacties van Drosophila larven van verschillende genetische achtergrond en / of blootstelling aan verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld plus of min weefselschade) kan worden bestudeerd en gekwantificeerd met behulp van deze assays. Uiteindelijk zullen de resultaten van deze testen helpen ons betere genetische netwerken beheersen noc te begrijpeniception in Drosophila en andere verwante soorten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Thermische Probe </td><td> Pro-Dev Techniek </td><td> Op maat gebouwd op aanvraag </td><td> Contact informatie kan worden verstrekt op aanvraag </td></tr><tr><td> Droge Bad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 massief blok verwarming en 1 verwarming blok met 16mm putten </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12V/400mA Kleurencamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Een daarmee gelijk te camera zal doen. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Onderdeel nummer voor MZ6 zoom lichaam (optiekhouder) is 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unit </td><td> Schott North America, Inc </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dubbele zwanenhals 23 inch Fiber Optic Light Guide </td><td> Schott North America, Inc </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Thermal Control Unit </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Details kunnen worden geleverd op aanvraag </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscoop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Een daarmee gelijk te microscoopzal doen. </td></tr><tr><td> Pincet </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm mesh </td><td> Genesee Wetenschappelijk </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Penseel </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Jars </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml beker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm polystyreen Petri Dish </td><td> Valk </td><td> 351008 </td><td> We hebben niet getest alternatieve gerechten. </td></tr><tr><td> Glas microscoopglaasje </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Thermokoppel </td><td> Omega Engineering, Inc </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Piece of vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugebuis </td><td> Denville WetenschappelijkInc </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

lokale en globale methoden voor de beoordeling thermische nociceptie in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In dit artikel tonen we aan testen van thermische nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Een test bestaat ruimtelijk beperkte (lokale) stimulering van thermische nociceptoren 1,2, terwijl de tweede gaat om een groothandel (mondiale) activering van de meeste of al deze neuronen 3. Samen vormen deze technieken laten toe visualisatie en kwantificering van de gedrags-functies van Drosophila nociceptieve sensorische neuronen. De Drosophila larve is een gevestigd model systeem om thermische nociceptie, een zintuiglijke reactie op de mogelijk schadelijke temperaturen die evolutionair geconserveerd is tussen soorten 1,2 bestuderen. De voordelen van Drosophila dergelijke studies de relatieve eenvoud van het zenuwstelsel en de complexiteit van de genetische technieken die gebruikt kunnen worden om de moleculaire basis van de onderliggende biologie 4-6 in Drosophila ontleden, zoals in alle metazoa de response om schadelijke thermische stimuli gaat over het algemeen een &quot;nocifensive&quot; aversieve terugtrekking aan de gepresenteerde stimulus 7. Dergelijke stimuli worden gedetecteerd door middel van vrije zenuwuiteinden of nociceptoren en de amplitude van de organismale respons hangt af van het aantal nociceptoren ontvangst van de schadelijke stimulus 8. In Drosophila, is de klasse IV dendritische arborization sensorische neuronen schadelijke thermische en mechanische stimuli 9 detecteren naast de recent ontdekte rol fotoreceptoren 10. Deze neuronen, die zijn zeer goed bestudeerd op het ontwikkelingsniveau, arborize over de barrière epidermale blad en het leggen van contacten met bijna alle epidermale cellen 11,12. De single axon van elke klasse IV neuron projecten in het ventrale zenuw snoer van het centrale zenuwstelsel 11, waar ze kunnen aansluiten op tweede-orde neuronen dat project aan de hersenen. Onder basislijn omstandigheden, nociceptieve sensorische neurons gaat niet af tot er een relatief hoge drempel is bereikt. De hier beschreven analyses kan de onderzoeker van de uitgangswaarde gedragsreacties of, waarschijnlijk, de sensibilisatie dat na weefselschade ontstaat. Kwantificeren Elke test veroorzaakt verschillende maar verwante motorische gedragsreacties aan schadelijke thermische prikkels en maakt de onderzoeker te visualiseren en de verschillende aspecten van thermische nociceptie kwantificeren in Drosophila larven. De methoden kunnen worden toegepast larven gewenste genotypes of larven verhoogde onder verschillende omstandigheden mogelijk invloed nociceptie. Aangezien de thermische nociceptie wordt geconserveerd tussen verschillende diersoorten, zal de bevindingen zijn opgedaan met genetische dissectie in Drosophila waarschijnlijk ons begrip van thermische nociceptie in andere soorten, waaronder de gewervelde dieren.

In dit artikel tonen we aan testen van thermische nociceptie studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Een test bestaat ruimtelijk beperkte (lokale) stimulering van thermische nociceptoren<sup&gt; 1,2</sup&gt; Terwijl de tweede gaat om een ​​groothandel (mondiale) activering van de meeste of al deze neuronen<sup&gt; 3</sup&gt;. Samen vormen deze technieken laten toe visualisatie en kwantificering van de gedrags-functies van<em&gt; Drosophila</em&gt; Nociceptieve sensorische neuronen.

Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In dit artikel demonstreren we assays om thermische nociceptie in Drosophila-larven te bestuderen. Eén assay omvat ruimtelijk beperkte (lokale) stimulatie van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de thermische nociceptie bij drosophila-larven te analyseren. Dit wordt bereikt door drosophila-larven te oogsten om ze vervolgens bloot te stellen aan schadelijke thermische stimuli; als optionele tweede stap kunnen de larven worden bestraald met UV-licht, wat weefselschade en thermische nociceptieve sensibilisatie veroorzaakt. Vervolgens kunnen de larven lokaal worden geprikkeld met een hitteprobe of globaal met een warmteplaat om nociceptieve reacties op te wekken die kwantitatief gemeten kunnen worden.De hitteprobe laat zien dat larven een bovengrens hebben aan de nociceptieve respons op hitte, en dat er een verrassende relatie bestaat tussen de inputtemperatuur en de amplitude van de opgewekte respons. De hitteplaat-assay laat zien dat larven een stereotype sequentie van nociceptief gedrag vertonen die afhankelijk is van de temperatuur van het omringende water en de activiteit van de nociceptieve sensorische neuronen. De hier beschreven methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de thermische nociceptie, zoals de vraag of dieren verschillend reageren op schadelijke thermische stimuli die respectievelijk lokaal of globaal worden gepresenteerd.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met de heat probe assay moeite hebben, omdat het beheersen van de assay oefening vereist om variatie in de druk, de locatie en de hoek van de aangebrachte probe te minimaliseren. Een visuele demonstratie van de heat plate assay is cruciaal, aangezien de gedragingen die worden opgewekt bij stijgende temperatuur het best begrepen kunnen worden door ze te zien. Om voldoende nakomelingenlarven van een gedefinieerd genotype van belang te verkrijgen, kweekt u de gewenste stam direct of stelt u kruisingen op in flessen met vliegenvoedsel met gebruik van 20 tot 30 maagdelijke vrouwtjes en 15 tot 20 mannetjes; oogst vijf dagen na de eiafzetting en reinig vroege derde-instar larven door het zachte vliegenvoedsel eruit te scheppen en te zeven met zacht stromend water door een gaas met een poriegrootte van 630 micron; breng de vroege derde-instar larven over naar een klein, vochtig bedje voedsel om uithongering en uitdroging te voorkomen.Nadat een anesthesiekamer is geconstrueerd, wordt met een pincet of een penseel voorzichtig 10 larven in het vroege derde stadium langs de binnenkant van het deksel geplaatst en wordt dit gesloten. In een zuurkast wordt de anesthesiekamer in een koppelpot geplaatst die een bekerglas van 10 milliliter bevat met een wattenstaafje gedrenkt in 1,5 milliliter diethylether. Draai de dop van de koppelpot vast om de larven gedurende twee tot 2,5 minuten bloot te stellen aan etherdampen.Verwijder na de anesthesie de anesthesiekamer uit de Coplan-pot en wacht enkele seconden in de zuurkast zodat eventuele resterende etherdampen kunnen verdwijnen. Gebruik een spuitfles met water om de larven voorzichtig uit de anesthesiekamer in een kleine Petrischaal te spoelen. Dep de geanestheseerde larven droog en bevestig ze vervolgens voorzichtig met de rugzijde naar boven op een strook dubbelzijdige plakband die is bevestigd op een glazen microscoopglaasje van drie bij één inch.Plaats het objectglas op het onderste oppervlak van een UV-bestralingskamer en stel de larven zes seconden lang bloot aan UV-licht met een intensiteit van 20 millijoules per centimeter squared. Dompel het objectglas na bestraling onder in water om de larven voorzichtig van de dubbelzijdige plakband te laten drijven. Gebruik een pincet of een schilderspenseel om de bestraalde larven voorzichtig in een 15 by 45 millimeter te plaatsen.Eén glazen kweekbuisje van één dram met één milliliter vliegenvoedsel om de larven acht tot 24 uur te laten herstellen bij 25 °C of de gewenste kweektemperatuur voordat ze opnieuw worden gehuisvest. Stel voor thermische nociceptie-assays eerst de temperatuur van de thermische probe in op het gewenste referentiepunt. Gebruik een penseel of een pincet om een individuele larve voorzichtig over te brengen naar een plat platform, waarbij moet worden gewaarborgd dat de larve bedekt is met een dunne waterfilm.Om variaties in druk te minimaliseren en de juiste locatie en hoek van de hitteprobe te waarborgen, is oefening essentieel. Druk de punt van de probe voorzichtig tegen de larven aan bij segment A4, waarbij lichte druk wordt uitgeoefend met de punt in een hoek van ongeveer 45 graden tussen de probe en het oppervlak van de larven. De druk moet een lichte inkeping op het oppervlak van de larven veroorzaken en is doorgaans voldoende om locomotie te voorkomen.Stimuleer de larven verder totdat er een terugtrekrespons optreedt of totdat de 22e cutoff is bereikt. Reagerende larven vertonen doorgaans eerst een preliminair gedrag waarbij de kop en staart worden opgetild, gevolgd door het terugtrekgedrag van minstens 360 graden rollen. Zodra het terugtrekgedrag is ingezet, verbreek dan het contact met de probe en noteer de latentie of de tijd die nodig is voor de terugtrekking.Indien er binnen 20 seconden geen terugtrekgedrag wordt waargenomen, wordt de larve beschouwd als een non-responder. Positioneer de glasvezellichtgeleiders om te garanderen dat er sprake is van adequate hoogcontrastverlichting. Om de larven te kunnen bekijken, plaatst u het verwarmingsblok met de vlakke zijde naar boven in de warmteplaat en plaatst u vervolgens de warmteplaat op de microscoopvoet.Zet de warmteplaat op de hoge stand en wacht ongeveer 15 minuten tot de temperatuur is gestabiliseerd op 95 °C. Meet 80 µL gedestilleerd water en plaats de waterdruppel met een micropipet in het midden van een polystyreen Petri-schaal van 60 bij 15 mm. Gebruik een pincet om voorzichtig een schone larve in het midden van het derde instar-stadium in de waterdruppel te plaatsen, waarbij zo min mogelijk extra water wordt geïntroduceerd.Plaats de Petrischaal voorzichtig op het vaste verwarmingsblok op de warmteplaat. Pas snel de positie van de schaal aan, zodat de volledige larve en de waterdruppel in beeld zijn. Start de timer.Op dit moment wordt de Petrischaal op het vaste verwarmingsblok van de warmteplaat geplaatst en wordt het tijdstip van het begin van elk gedrag genoteerd. Vijf. Stereotype locomotieve gedragingen worden waargenomen wanneer de larve, ondergedompeld in water, naar de warmteplaat wordt overgebracht. Normaal gedrag in afwezigheid van hitte omvat parasol-locomotie, vergezeld van zoekende hoofdbewegingen.Vervolgens kan het 'head thrash'-gedrag optreden, waarbij de larve haar kop snel in een voorwaartse of zijwaartse beweging beweegt. Deze beweging lijkt op hun normale voortbeweging in water, maar vindt schokkeriger en met aanhoudend rollen plaats. Het gedrag treedt op wanneer de larven zijdelings ten minste een volledige 360 graden rollen.Dit kan een variabel aantal keren voorkomen en omvat soms onvolledige rollen. Tel voor de score van het gedrag alleen volledige rollen van 360 graden. Dit gedrag vertoont de meeste gelijkenis met de scène waarin de hitteprobe lokaal wordt toegepast tijdens het zweepgedrag.De larve vertoont snelle samentrekkings- en ontspanningsbewegingen langs de anterieur-posterieure as, waardoor de kop heel kortstondig dicht bij de staart komt. Zwepende bewegingen worden vaak in snelle opeenvolging of gelijktijdig met rollen waargenomen. Tot slot vertoont de larve epileptisch-achtig gedrag, vaak gevolgd door verlamming. Tijdens dit gedrag strekt de larve zich uit langs de anterieur-posterieure as en vertoont deze een hoogfrequente trilling van het hele lichaam.Schudgedrag zonder buigingsverlamming treedt op wanneer de larven stoppen met bewegen. Bij sommige larven is dit permanent, terwijl anderen vervolgens een laagfrequente pulserende beweging vertonen. In deze grafiek van het percentage responders per categorie is er een plafond voor de thermische nociceptieve respons van de larven. In de heat probe assay zijn 100% van de larven snelle responders tot een probe-temperatuur van 52 °C.Echter, bij 54 °C en hoger reageert 90% of meer van de larven niet, zelfs niet na 20 seconden contact. Hoewel deze larven na de 22e afsnijwaarde blijven bewegen, kunnen het aantal rollen of de tijd besteed aan aversie-terugtrekgedrag ook worden gemeten en uitgezet. Verrassend genoeg lijkt er een omgekeerd verband te bestaan tussen de temperatuur van de probe en de robuustheid van de respons, aangezien lagere temperaturen een hoger aantal rollen lijken op te wekken.Bij overdracht van de in water ondergedompelde larve naar de warmteplaat worden vijf stereotiepe locomotieve gedragingen waargenomen. De gemiddelde latentietijden waarin deze gedragingen worden waargenomen, worden hier getoond, evenals de gemiddelde temperaturen van de waterdruppel gemeten voor elke latentie onder de hier gepresenteerde optimale assay-condities; het percentage larven dat elk afzonderlijk gedrag vertoonde varieerde van 77 tot 100%, hoewel het rollende en zwiepende gedrag af en toe werden overgeslagen, overlapten of in omgekeerde volgorde voorkwamen. Het percentage larven dat overleefde na de aanvang van het verlammingsgedrag in de warmteplaat-assay wordt hier getoond. Larven werden verhit tot verlamming en vervolgens overgeplaatst naar standaard kweekcondities om te herstellen.De schijnbehandelde larven kregen een gelijkwaardige behandeling, behalve de blootstelling aan hitte, en de vorming van PPE in levensvatbare volwassenen werd kwantitatief bepaald op dag zeven tot 13. Hier stimuleert MD G four de expressie van UAS-gereguleerde transgenen in alle vier de klassen van multidendritische perifere sensorische neuronen. UAS or one delta C tot expressie brengt een gemodificeerde versie van het drosophila open-rectifier kaliumkanaal dat vereist is voor synaptische transmissie, en UAS orrc one delta NC tot expressie brengt een verder gemodificeerde versie van hetzelfde kanaal die de synaptische transmissie niet verstoort.Let op dat alleen larven die zowel de MD GALF four driver als het UAS ORC one delta C transgen dragen, verhoogde latentietijden vertonen voor vier van de vijf waargenomen gedragingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel lokale als globale responsen van GEs offal larven op schadelijke thermische stimuli kunnen worden gemeten. Deze procedures kunnen worden gecombineerd met andere methoden, zoals genetische analyse, om de genen te identificeren die vereist zijn voor thermische nociceptie. Bij het uitvoeren van de heat probe assay is het belangrijk om variatie in druk, locatie en contacthoek van de probe te minimaliseren.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier wordt beschreven snel betrouwbare en eenvoudige procedure om de laagste temperatuur waarbij ratten of muizen tonen nocifensive gedrag...

Snelle bepaling van de thermische Nociceptieve drempel in diabetische ratten

Drosophila-larven hebben speciale sensorische neuronen - nociceptoren - waarvan de reactie op potentieel schadelijke thermische stimuli aversief - of zogenaamd "nocifensief" - gedrag bij het dier veroorzaakt. Deze video beschrijft een methode om thermische nociceptie te beoordelen door larvaal gedrag op te nemen als reactie op lokale toepassing van een warmtesonde op de cuticula. Deze methode wordt daarom de lokale hittesondetest genoemd.

Lokale hittesondetest: een methode om nociceptie van hoge temperaturen bij Drosophila-larven te beoordelen

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.

Nieuwe test voor Cold Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Hier presenteren we een protocol om automatisch te bepalen door de motorische prestaties van Drosophila op het veranderen van temperatuur met behulp van een programmeerbare temperatuurgevoelig arena die snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert.

Een automatische methode om te bepalen van de prestaties van Drosophila in antwoord op temperatuurveranderingen in ruimte en tijd

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.

Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

De beoordeling en behandeling van pijn bij baby's is moeilijk, omdat baby's niet kunnen mondeling verslag uit over hun ervaring. In deze video beschrijven we kwantitatieve elektrofysiologische methoden en technieken die gebruikt kunnen worden om de respons op schadelijke gebeurtenissen van het kind zenuwstelsel te meten.

Elektrofysiologische metingen en analyse van Nociceptie in Human Zuigelingen

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Een methode om immunostain en chordotonal organen te visualiseren in de larven en poppen...

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Leer lokale en globale methoden voor thermische nociceptie bij Drosophila-larven met warmteproeven en gedragsanalyse. Deze technieken helpen onderzoekers sensorische verwerking en pijnresponsen kwantificeren.

Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in

Meer video's verkennen