Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in Drosophila Larven

Het algemene doel van het volgende experiment is het analyseren van thermische nociceptie bij drosophila-larven. Dit wordt bereikt door drosophila-larven te oogsten om ze vervolgens bloot te stellen aan schadelijke thermische stimuli; als optionele tweede stap kunnen de larven worden blootgesteld aan UV-bestraling, wat weefselschade en thermische nociceptieve sensitisatie veroorzaakt. Vervolgens kunnen de larven lokaal worden geprikkeld met een hitteprobe of globaal met een warmteplaat om nociceptieve reacties op te wekken die kwantitatief kunnen worden gemeten.

De hitteprobe laat zien dat larven een plafond hebben voor de nociceptieve respons op hitte, en een verrassend verband tussen de ingestelde temperatuur en de amplitude van de opgewekte respons. De assay met de hitteplaat laat zien dat larven een stereotiepe reeks nociceptieve gedragingen vertonen die afhankelijk zijn van de temperatuur van het omringende water en de activiteit van de nociceptieve sensorische neuronen. De hier beschreven methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van thermische nociceptie, zoals de vraag of dieren verschillend reageren op schadelijke thermische stimuli die respectievelijk lokaal of globaal worden gepresenteerd.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan de heat probe assay problemen ervaren, omdat het beheersen van de assay oefening vereist om variatie in de druk, de locatie en de hoek van de aangebrachte probe te minimaliseren. Een visuele demonstratie van de heat plate assay is cruciaal, aangezien gedragingen die worden opgewekt bij een stijgende temperatuur het best begrepen kunnen worden door ze te zien. Om voldoende nakomelingen-larven van een specifiek genotype van interesse te verkrijgen, kweek de gewenste stam direct of stel kruisingen op in flesjes met vliegenvoedsel met gebruik van 20 tot 30 maagdelijke vrouwtjes en 15 tot 20 mannetjes. Oogst vijf dagen na de eiafzetting en reinig vroege derde-instar larven door het zachte vliegenvoedsel eruit te scheppen en te zeven met zacht stromend water door een gaas met een poriegrootte van 630 micron. Breng de vroege derde-instar larven over naar een klein, vochtig stukje voedsel om uithongering en uitdroging te voorkomen.

Nadat de narcotisatiekamer is geconstrueerd, gebruikt u een pincet of een schilderspenseel om voorzichtig 10 larven in het vroege derde stadium langs de binnenkant van het deksel te plaatsen en dit te sluiten. Plaats de narcotisatiekamer, terwijl u in een zuurkast werkt, in een koppelpot die een bekerglas van 10 milliliter bevat met daarin een wattenbol gedrenkt in 1,5 milliliter dathylether. Draai de dop van de koppelpot vast om de larven gedurende twee tot 2,5 minuten bloot te stellen aan etherdampen.

Verwijder na de anesthesie de anesthesiekamer uit de Coplan-pot en wacht enkele seconden in de zuurkast zodat eventuele resterende etherdampen kunnen verdwijnen. Gebruik een plantenspuit om de larven voorzichtig uit de anesthesiekamer in een kleine Petrischaal te spoelen. Dep de geneaseerde larven droog en bevestig ze vervolgens voorzichtig met de rugzijde naar boven op een stripje dubbelzijdige plakband dat is vastgezet op een glazen microscoopglas van drie bij één inch.

Plaats het objectglas op het onderste oppervlak van een UV-bestralingskamer en stel de larven zes seconden lang bloot aan UV-licht met een intensiteit van 20 millijoules per centimeter squared. Dompel het objectglas na bestraling in water om de larven voorzichtig van de dubbelzijdige plakband te laten lossen. Gebruik een pincet of een penseel om de bestraalde larven voorzichtig in een 15 by 45 millimeter te plaatsen.

Eén glazen kweekbuisje van één dram met één milliliter vliegvoedsel om de larven acht tot 24 uur te laten herstellen bij 25 °C of de gewenste kweektemperatuur voordat ze opnieuw worden gehuisvest. Stel voor thermische nociceptie-assays eerst de temperatuur van de thermische probe in op het gewenste referentiepunt. Gebruik een penseel of een pincet om een individuele larve voorzichtig over te brengen naar een plat platform, waarbij u er zeker van bent dat de larve bedekt is door een dunne waterfilm.

Om de variatie in druk te minimaliseren en de juiste locatie en hoek van de hitteprobe te waarborgen, is oefening essentieel. Druk de punt van de probe voorzichtig tegen de larven aan bij segment A4, waarbij lichte druk wordt uitgeoefend met de punt in een hoek van ongeveer 45 graden tussen de probe en het oppervlak van de larven. De druk moet een lichte inkeping op het oppervlak van de larven veroorzaken en is gewoonlijk voldoende om locomotie te voorkomen.

Blijf de larven stimuleren totdat er een terugtrekreflex optreedt of totdat de 22ste uiterste tijdslimiet is bereikt. Reagerende larven vertonen gewoonlijk eerst een preliminair gedrag waarbij ze de kop en staart optillen, gevolgd door het terugtrekgedrag van minimaal 360 graden rollen. Zodra het terugtrekgedrag is ingezet, wordt het contact met de sonde verbroken en wordt de latentietijd of de benodigde tijd tot terugtrekking geregistreerd.

Als er binnen 20 seconden geen terugtrekreactie wordt waargenomen, wordt de larve als niet-reagerend beschouwd. Positioneer de glasvezellichtgeleiders om ervoor te zorgen dat er voldoende contrastrijke verlichting is. Om de larven te kunnen bekijken, plaatst u het verwarmingsblok met de vlakke zijde naar boven in de warmteplaat en plaatst u vervolgens de warmteplaat op de voet van de microscoop.

Zet de warmteplaat op de hoge stand en wacht ongeveer 15 minuten tot de temperatuur gestabiliseerd is op 95 °C. Meet 80 µL gedestilleerd water en breng de waterdruppel met een micropipet aan in het midden van een polystyreen petrischaal van 60 bij 15 mm. Gebruik een pincet om voorzichtig een schone larve in het midden van het derde instar-stadium in de waterdruppel te plaatsen, waarbij zo min mogelijk extra water wordt toegevoegd.

Plaats de petrischaal voorzichtig op het vaste verwarmingsblok op de warmteplaat. Pas snel de positie van de schaal aan zodat de volledige larve en de waterdruppel in beeld zijn. Start de timer.

Op dit moment wordt de Petrischaal op het vaste verwarmingsblok van de warmteplaat geplaatst en wordt het beginstijdstip van elk gedrag vastgelegd. Vijf. Stereotype locomotieve gedragingen worden waargenomen zodra de larve, ondergedompeld in water, naar de warmteplaat wordt overgebracht. Normaal gedrag in afwezigheid van hitte omvat parasol-locomotie, vergezeld door zoekende hoofdbewegingen.

Vervolgens kan hoofdschudgedrag optreden, waarbij de larve de kop snel in een voorwaartse of zijwaartse beweging beweegt. Deze beweging lijkt op hun normale voortbeweging in water, maar verloopt schokkeriger en met aanhoudend rollen. Dit gedrag treedt op wanneer de larve zijwaarts ten minste een volledige 360 graden draait.

Dit kan een variabel aantal keren voorkomen en omvat soms onvolledige rollen. Voor de scoring van het gedrag worden alleen volledige rollen van 360 graden geteld. Dit gedrag vertoont de meeste gelijkenis met de scène met lokale toepassing van de hitteprobe tijdens whip-gedrag.

De larve vertoont snelle contractie- en ontspanningsbewegingen langs de anteroposterieure as waardoor de kop zeer kortstondig dicht bij de staart komt. Zweepend wordt vaak in snelle opeenvolging of gelijktijdig met rollen waargenomen. Ten slotte zal de larve epileptisch gedrag vertonen, vaak gevolgd door verlamming. Tijdens dit epileptische gedrag strekt de larve zich uit langs de anteroposterieure as en vertoont deze een hoge frequentie van hele lichaamsbewegingen.

Schudgedrag zonder buigingsverlamming treedt op wanneer de larven stoppen met bewegen. Bij sommige larven is dit permanent, terwijl anderen vervolgens een pulserende beweging met een lage frequentie vertonen. In deze grafiek van het percentage responders per categorie is een plafond te zien voor de thermische nociceptieve respons van de larven. In de heat probe assay zijn 100% van de larven snelle responders tot een sondetemperatuur van 52 °C.

Echter, bij 54 °C en hoger reageert 90% of meer van de larven niet, zelfs niet na 20 seconden contact. Hoewel deze larven na de 22e afkapwaarde blijven bewegen, kunnen het aantal rollen of de tijd die wordt besteed aan vermijdingsgedrag eveneens worden gemeten en uitgezet. Verrassend genoeg lijkt er een omgekeerd verband te bestaan tussen de temperatuur van de probe en de robuustheid van de respons, aangezien lagere temperaturen blijkbaar een hoger aantal rollen uitlokken.

Vijf gestandaardiseerde locomotieve gedragingen worden waargenomen wanneer de in water ondergedompelde larve naar de warmteplaat wordt overgebracht. De gemiddelde latentietijden waarop deze gedragingen worden waargenomen worden hier getoond, evenals de gemiddelde temperaturen van de waterdruppel die voor elke latentie zijn gemeten onder de hier gepresenteerde optimale assay-condities; het percentage larven dat elk specifiek gedrag vertoonde varieerde van 77 tot 100%, hoewel het rollen en zwepen af en toe worden overgeslagen, overlappen of in omgekeerde volgorde voorkomen. Het percentage larven dat overleefde na het begin van het verlammingsgedrag in de warmteplaat-assay wordt hier getoond. Larven werden verhit tot verlamming en vervolgens teruggeplaatst in standaard kweekcondities om te herstellen.

De schijnbehandelde larven kregen een equivalente behandeling, behalve de blootstelling aan hitte, en de vorming van PPE in levensvatbare volwassenen werd kwantitatief bepaald op dag zeven tot 13. Hier stimuleert MD G four de expressie van UAS-gereguleerde transgenen in alle vier de klassen van multidendritische perifere sensorische neuronen. UAS or one delta C drukt een gemodificeerde versie uit van het drosophila-open rectifier kaliumkanaal dat vereist is voor synaptische transmissie en UAS orrc one delta NC drukt een verder gemodificeerde versie van hetzelfde kanaal uit die de synaptische transmissie niet hindert.

Let op dat alleen larven die zowel de MD GALF four-driver als het UAS ORC one delta C-transgen dragen, verhoogde latentietijden vertonen voor vier van de vijf geobserveerde gedragingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zowel lokale als globale responsen van GEs offal-larven op schadelijke thermische stimuli kunt meten. Deze procedures kunnen worden gecombineerd met andere methoden, zoals genetische analyse, om de genen te identificeren die vereist zijn voor thermische nociceptie. Bij het uitvoeren van de heat probe-assay is het belangrijk om variatie in druk, locatie en contacthoek van de probe te minimaliseren.