Name: Visualisatie van proprioceptoren in Drosophila Larven en poppen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer immunokleuring en confocale microscopie om proprioceptieve chordotonaalorganen te visualiseren in Drosophila-larven en -poppen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar sensorische ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de Developmental Studies Hybridoma Bank danken aan de Universiteit van Iowa voor het sturen van antilichamen. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​(nr. 29/08) van The Israel Science Foundation. AS wordt ook ondersteund door een onderzoeksbeurs van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Voordat u begint <ol><li> Groei van de gewenste vlieg culturen. De injectieflacons uncrowded (ongeveer 30 vliegen per 50 ml flacon). Laat de vliegen eitjes leggen voor slechts een dag in elke flacon. Dit zal de larven voldoende voedselvoorziening en hen in staat stellen om maximale grootte bereiken voordat kruipen uit het voedsel. Bewaar de injectieflacons in de juiste temperatuur tot derde instar larven beginnen te dwalen op de flacon muur. </li><li> Bereid een nieuwe voorraad fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en PBT (0,1% Tween in PBS). Houd 10 ml PBS op ijs. </li><li> Bereid 1-5 ml vers fixatief (4% Formaldehyde in PBT) en houdt het op ijs. We maken gebruik van gebotteld 37-38% formaldehyde als een stamoplossing. </li></ol> 1. Dissectie en fixatie van de derde Instar Larven <ol><li> Kies een zwervende derde instar larve van de flacon muur en plaats deze in een 50 ul druppel ijskoud PBS op een Sylgard dissectie plaat (gemaakt van Sylgard 184 siliconen elastomeer kit, Dow Corning Corporation in eenweefselkweek schotel). </li><li> Houd de larve-, rug-kant naar boven, bij de monding haken, met fijn pincet (Dumont # 5 tang), en plak een insect pin (minutien, 0,1 mm, roestvrij staal) door middel van de hersenen van de larve&#39;s. </li><li> Pak het achterste eind van de larve met de tang, trek en strek de larve zachtjes de lengte. Plak een ander insect pin tussen de twee achterste siphonen. </li><li> Met behulp van de lente een schaar knippen twee horizontale insnijdingen in het lichaam muur (loodrecht op de anterior-posterior as), dicht bij de voorste en achterste pinnen. </li><li> Met behulp van het voorjaar een schaar knip de larvale lichaam muur langs de dorsale middellijn van de voorste tot de achterste incisie. </li><li> Verwijder de interne organen (darmen, speekselklieren, buisjes van Malpighi enz.) en de luchtpijp met behulp van fijne pincet. Was voorzichtig een of twee keer met PBS. </li><li> Pak de twee lichaamswand kleppen met een pincet, rekken ze uit en ze op de plaat met behulp van twee insecten de spelden voor elke kant pin. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 50 ul fixeeroplossing (4% formaldehyde in PBT). Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het fixeermiddel. Was tweemaal met PBS. Trek het insect pinnen. Met behulp van de lente een schaar knip de larvale kop en staart het verlaten van een rechthoekige filet. Breng de vaste weefsel tot een gekoelde Eppendorf buis met PBS. </li><li> Als een voldoende aantal larven vastgesteld kan direct verder antilichaam kleuring. Als onmiddellijke kleuring niet gewenst is, moet de vaste larven worden gewassen 3 keer 5 minuten met 95% ethanol en opgeslagen in 95% ethanol bij -20 ° C. </li></ol> 2. Dissectie en Fixatie van Poppen Deel I <ol><li> Woon aan de flesjes als voor larven fixatie, tot derde instar larven beginnen te pupariate. Onderzoek de flacons elk uur en Mark larven die pupariated. Laat de gemarkeerde poppen tot 30-40 uur te ontwikkelen bij 24 ° C, of ​​24 tot 27 uur bij 29 ° C. </li><li> Met behulp van fijne tang halen 20-30 poppen van ee juiste leeftijd en doe ze in een donkere porselein multi-goed ontleden schotel. Zorg ervoor dat u de weefsels van belang kunnen beschadigen. </li><li> Pak de poppen uit de pop geval. Begin met het afpellen van het operculum en gaan door tot de pop is gratis. Zet de pop in een goed gevuld met PBT. Ga door het extraheren van alle poppen. Stappen 2.4-2.6 worden uitgevoerd in kleine groepen van vijf poppen tegelijk. </li><li> Plaats vijf poppen op een vlakke ondergrond tussen de putten van het ontleden schotel. Een microdissectie te snijden het uiteinde van de kop en de achterste uiteinde van de buik (alternatief is het mogelijk om twee paar tang gebruiken gaten scheuren aan beide uiteinden van de poppen). </li><li> Houd de pop op zijn plaats met behulp van fijne pincet en gebruik een 1 ml spuit om de reiniging van de interne organen van de pop, door het injecteren van PBT door de voorste opening. </li><li> Was de ontleed pop kort door dompelen in een goed gevuld met PBS en verplaats het in de koude fixeermiddel in een Eppendorf buis op ijs bewaard. </li><li> Incubeer nacht (ON) bij 4 ° C. </li></ol> Part II <ol start="8"><li> Gooi de fixatief en was de poppen drie keer, 5 minuten, met PBT. Houd de gewassen poppen op het ijs. </li><li> Vul twee putjes van de schotel met het ontleden van PBT. Een polyetheen pasteurpipet overdracht verschillende poppen een van de putten. </li><li> Verplaats een pop op een moment in de tweede put. Met behulp van twee paar scherpe pincet met perfect uitgelijnd tips, haal het transparante pop cuticula van de vleugel: zet de pop op de bodem van de put met behulp van een pincet, en voorzichtig scheuren de cuticula met behulp van het tweede paar pincetten. Zodra de cuticula is gescheurd, afschilferen van de vleugel. Zorg ervoor dat aan de vleugel los te koppelen van de pop. Na het afpellen van de cuticula van de vleugel mes, blijven het schillen van de cuticula van de vleugel scharnier (waar de vleugel chos zich bevinden). </li><li> Na het afpellen van de vleugel cuticula, kan men proberen afpellen van het been cuticula op een vergelijkbare manier.Veel benen zijn waarschijnlijk verloren in het proces, maar ondanks de lage opbrengst, deze stap wordt ten zeerste aanbevolen, aangezien dit een aanzienlijke verbetering van de kleuring van het been chos. De chos van de haltere en de buik kunnen worden gevisualiseerd zonder verdere afpellen van de cuticula. </li><li> Plaats het geschilde &#39;pop in een Eppendorf buis gevuld met methanol en houdt bij kamertemperatuur. Ga verder afpellen van de cuticula van alle poppen en voeg ze toe aan dezelfde buis. Ten minste 10 mooi geschild poppen moeten worden verzameld voor elke kleuring. </li><li> Verwijder de methanol en was drie keer, 5 minuten, met 95% ethanol. Vaste poppen kan worden gehouden voor langere tijd in 95% ethanol bij -20 ° C. </li></ol> 3. Immunokleuring van larven en poppen <ol><li> Was de vaste weefsel PBT driemaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Larven kunnen worden gewassen met zacht schudden op een roterende plaat. Poppen worden gewassen zonder schudden. </li><li> Vervang de PBT met blokkerende buffer (PBT + 5% nEen normaal geit serum) en incubeer ON bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het blokkeren buffer en geïncubeerd met primaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C. </li><li> Was viermaal uit met PBT zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> Verwijder het PBT en incubeer met secundaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C. </li><li> Was twee keer met PBT en een keer met PBS, zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> Vervang de PBS met montage-medium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken) en incuberen bij 4 ° C ON. </li></ol> 4. Montage van Larven <ol><li> Larven zijn gemonteerd op een microscoop dia in een daling van de montage-media met hun nagelriem naar beneden en lichaamswand spieren naar boven. Doe een klein druppeltje montage medium op een schoon dekglas en gebruik deze om de voorbereiding te dekken. Gebruik geen druk uit op de gemonteerde larven. </li></ol> 5. Montage van Poppen <ol><li> Bereid twee objectglaasjesmet een druppel montagemedium, een voor dissectie en de tweede voor montage. </li><li> Leg een aantal poppen op een van de dia&#39;s. </li><li> Met behulp van de lente een schaar te verwijderen het hoofd en het achterste deel van de buik. </li><li> Scheid de dorsale helft van de thorax van ventrale half door snijden van de vleugels en de poten. </li><li> Plaats ontleed lichaamsdelen van de pop de tweede microscoopglaasje een druppel montage oplossing. Controleer de vleugels en de benen gespannen en proberen superpositie van weefsels zoveel mogelijk te beperken. </li><li> Breng een druppel van de montage medium op een dekglas en plaats deze op het monster. Oefen geen druk uit op de gemonteerde monster. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld van immuno-gekleurde chos van Larve larve figuur 1. Dit voorbeeld toont een mooi gespannen buik-segment, waarin zeven van de acht chos zijn duidelijk zichtbaar. Neuronen zijn labeLED met MAb22C10 (1:20, verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank aan de Universiteit van Iowa), de cap, ligament, pet-gehechtheid en ligament bevestiging cellen zijn voorzien van anti-αTub85E (1:10, Klein et al.,. 2010). Secundaire antilichamen voor fluorescentiekleuring waren Cy3 of Cy5-geconjugeerd anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Monsters werden bekeken met behulp van confocale microscopie (LSM 510, Zeiss). Een cluster vleugel chos de ventrale radiale ader van 35 uur oude pop is weergegeven in figuur 2. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Figuur 1 (A) Schematische weergave van de zes celtypen die een Ch orgaan vormen. Kap aangebracht (CA), cap (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) en ligament bevestiging (LA ). De LCh5 orgel, waarin vijf chos geclusterd, is uitgestrekt over de groep van de laterale dwarse spieren (LT1-4). De laterale lengterichting spier (LL1) ventrale longitudinale spieren (VL1-4) en laterale schuine spier (LO1) worden eveneens getoond. Tendon cellen worden geïllustreerd als bruine bollen (Genomen uit Klein et al.., 2010). (B) Een abdominale segment van een derde instar larve bekeken op een 10x vergroting. Zeven van de acht chos in elk abdominaalsegment zijn evident: vijf laterale organen die samen de pentascolopidial orgaan (LCh5) een laterale orgaan (LCh1) en een twee ventrale chos (VChB). De neuronen (N) van de chos zijn voorzien van de neuronale marker MAb 22C10 (rood). Het ligament (L), cap (C) en bevestiging cellen (LA, CA) zijn voorzien van anti-αTub-85E (blauw). De dop en ligament cellen bovendien voorzien van een CHO-specifieke GFP reporter herbergen van een reguleringselement van de dei locus (Nachman et al.., Ongepubliceerde gegevens). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Figuur 2. </sTrong&gt; De vleugel chordotonal organen aan de ventrale radiale ader worden bekeken op een 40x vergroting. De neuronen (N) zijn gemarkeerd met de neuronale marker 22C10 (Rood, B). Het ligament (L) en deksel (C) cellen samen gelabeld anti-αTub85E antilichamen (blauw, C) en CHO-specifieke GFP reporter transgene (Nachman et al.., Ongepubliceerde gegevens).

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het protocol wordt beschreven in deze video biedt een manier om proprioceptieve chos visualiseren tijdens het larvale en popstadium fasen. Studies over de structuur en de ontwikkeling van proprioceptieve chos zijn tot nu toe beperkt vooral embryonale stadia en larven imaginaire schijven. Zo veel aspecten van de latere stadia van ontwikkeling, van zowel larvale en volwassen chos, blijven grotendeels onbekend. De beschreven protocol, in combinatie met gemeenschappelijke genetische tools in Drosophila, kan worden gebruikt om te identificeren en te bestuderen nieuwe genen en routes die een rol spelen in latere stadia van chos ontwikkeling. Dit protocol werd geoptimaliseerd voor de visualisatie van Cho, maar het kan worden aangepast voor de kleuring van andere weefsels, zoals pop vleugels 6.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum / gereedschap </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (of # 55) tang, biologie tip </td><td> FST </td><td> 11252-20 of 11252-10 (Of gelijkaardig tang) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz roestvrij staal insect pinnen, minutiens 0,1 mm </td><td> Roboz Chirurgische Instrument Co </td><td> RS-6,083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 siliconenelastomeer kit </td><td> DOW Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas micro schaar (recht, 7,5 cm, blad 3 mm) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Vannas Spring Schaar met identieke specificaties kunnen worden gekocht bij Roboz Surgical Instrument Co </td></tr><tr><td> Orbital Shaker - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako TL Mounting Medium </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS formulering </td><td colspan="2"> 2 gr / lit KCl, 2 gr / verlichte KH 2 PO 4, 80 gr / lit NaCl, 21,7 gr / verlicht Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> De kwaliteit van PBS is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0,1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; drosophila</em&gt; larven en poppen

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioceptie is de mogelijkheid om de beweging, of positie, van lichaamsdelen te voelen door te reageren op stimuli die zich in het lichaam. In fruitvliegen en andere insecten proprioceptie wordt verzorgd door gespecialiseerde zintuigen genoemd chordotonal organen (Chos) 2. Net als vele andere organen in Drosophila, chos ontwikkelen tweemaal tijdens de levenscyclus van de vlieg. Ten eerste, de larvale chos te ontwikkelen tijdens de embryogenese. Dan, de volwassen chos beginnen te ontwikkelen in het larvale denkbeeldige schijven en om onderscheid te maken tijdens de metamorfose voort te zetten. De ontwikkeling van de larvale chos tijdens de embryogenese is uitgebreid 10,11,13,15,16 bestudeerd. De kern van elk CHO is een zintuiglijke eenheid bestaande uit een neuron en een scolopale cel. De sensorische eenheid is gespannen tussen twee soorten accessoire cellen die hechten aan de cuticula via gespecialiseerde epidermale bijlage cellen 1,9,14. Als een vlieg larve beweegt, de relatieve verplaatsing van de epidermal bevestiging cellen leidt tot uitrekken van de zintuiglijke eenheid en de daaruit voortvloeiende opening van specifieke transient receptor potential vanilloid (TRPV) kanalen aan de buitenste segment van de dendriet 8,12. Het ontlokte signaal wordt vervolgens overgedragen aan het bewegingsapparaat centrale patroon generator circuit in het centrale zenuwstelsel. Meerdere chos zijn beschreven in de volwassen vlieg 7. Deze bevinden zich in de buurt van de gewrichten van de volwassen vlieg aanhangsels (poten, vleugels en halsters) en in de thorax en de buik. Daarnaast zijn enkele honderden chos samen de Johnston&#39;s orgel in de volwassen antenne die transduceren akoestische in mechanische energie 3,5,17,4. In tegenstelling tot de uitgebreide kennis over de ontwikkeling van chos in embryonale stadia, is zeer weinig bekend over de morfologie van deze organen tijdens de larvale stadia. Bovendien, met uitzondering van de femorale chos 18 en Johnston&#39;s orgel, onze kennis van zaken inge over de ontwikkeling en de structuur van chos in de volwassen vlieg is zeer fragmentarisch. Hier beschrijven we een methode voor het kleuren en visualiseren van chos in derde instar larven en poppen. Deze methode kan worden toegepast met het oog op betere genetische karakterisering van de morfologie en begrijpen de ontwikkeling van de verschillende chos in de vlieg.

Een methode om immunostain en chordotonal organen te visualiseren in de larven en poppen van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beschreven.

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioceptie is het vermogen om de beweging of positie van lichaamsdelen waar te nemen door te reageren op stimuli die binnen het lichaam ontstaan. Bij fruitvliegen en andere ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van proprioceptieve cortone-organen in larven en pupae van Drosophila. Dit wordt bereikt door eerst derde-instar larven of pupae op te kweken en te verzamelen, gevolgd door dissectie van de larven of pupae. Deze worden vervolgens gefixeerd voor immunokleuring.Vervolgens worden de gefixeerde larven of poppen immunogekleurd met de juiste antilichamen. De laatste stap is het monteren van de gekleurde monsters voor microscopie. Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om de cortone-organen te visualiseren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de postsymbiontische ontwikkeling en patroonvorming van prop-receptoren in oph. Hoewel deze procedure inzicht kan bieden in de ontwikkeling van prop-receptoren, kan deze ook worden toegepast op andere organen, zoals andere typen zintuigorganen en pezen. Verzamel eerst de benodigde instrumenten, oplossingen en een vial met wandering.Houd de PBS- en FIXATIE-oplossingen op ijs voor larven in het derde stadium van de stervorm. Pak een rondtrekkende larve in het derde stadium van de stervorm van de wand van het flacon en plaats deze in een druppel van 50 µL ijskoude PBS op een dissectieplaat van sigaarelastomeer in een kweekschaal. Houd de larven met een dissectiemicroscoop met fijne pincetten bij de mondhaken met de dorsale zijde naar boven en steek een insectennaald door de hersenen.Pak het posterieure uiteinde van de larven vast met de pincet. Trek voorzichtig en rek de larven zachtjes in de lengte uit. Steek met een veerschaar een andere insectennaald tussen de twee posterieure sferen.Maak twee horizontale incisies in de lichaamswand loodrecht op de anterieur-posterieure as, dicht bij de anterieure en posterieure pinnen. Snijd vervolgens de lichaamswand van de larve langs de dorsale middellijn open, van de anterieure naar de posterieure incisie. Verwijder de interne organen en de trachea met een fijne pincet.Was daarna voorzichtig één of twee keer met PBS. Pak de twee flappen van de lichaamswand vast met een pincet. Span deze uit en zet ze op de plaat vast met twee insectenspelden per zijde.Verwijder de PBS en voeg 50 µL fixeeroplossing toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van de fixeeroplossing en tweemaal wassen met PBS, worden de insectenpinnen met een veerschaar verwijderd.Snijd de kop en staart van de larve af zodat een rechthoekig filet overblijft. Breng het gefixeerde weefsel over naar een gekoelde eppendorfbuis met PBS. Zodra een voldoende aantal larven is gefixeerd, kan men direct doorgaan met de antilichaamkleuring.Als directe kleuring niet gewenst is, moeten de gefixeerde larven drie keer gedurende vijf minuten worden gewassen met 95%ethanol en vervolgens bewaard worden in de ethanol bij min 20 graden. Behandel de vials op dezelfde wijze als bij de fixatie van larven totdat de larven in het derde stadium beginnen te vervellen. Controleer de vials elk uur en markeer de larven die zijn verveld.Laat de gemarkeerde pupae 30 tot 40 uur lang ontwikkelen bij 24 °C, of 24 tot 27 uur bij 29 °C. Selecteer met een fijne pincet 20 tot 30 pupae van de juiste leeftijd en plaats deze in een donker porseleinen dissectieschaal met meerdere putjes. Wees voorzichtig om de relevante weefsels niet te beschadigen.Haal vervolgens de poppen uit hun poppenomhulsels. Begin met het verwijderen van het operculum en ga door tot de pop is bevrijd. Haal alle poppen eruit en plaats ze in een well gevuld met PBT.Plaats vijf pupae op een vlak oppervlak tussen de putjes van de dissectieschaal met behulp van een microdissectiemes. Snijd de kop en het achterste uiteinde van het abdomen af. Houd de pop op zijn plaats met een fijne pincet en gebruik een spuit van 1 mL om de interne organen van de pop uit te spoelen door PBT via de voorste opening in te spuiten.Was de gedissecteerde pop kort door deze in een well gevuld met PBS te dopen en verplaats deze vervolgens naar het koude fixatief in een eppendorfbuisje dat op ijs bewaard wordt. Incubeer de pop een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag.Verwijder het fixatief en was de puby drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met PBT. Bewaar de gewassen puby op ijs. Vul twee putjes van de dissectieschaal met PBT.Gebruik een polyethyleen plastic pipet. Breng verschillende pupae over naar een van de wells. Verplaats vervolgens één voor één de pupae naar de tweede well.Bevestig de pop aan de bodem van het putje met twee paren scherpe pincetten met perfect uitgelijnde punten en scheur vervolgens voorzichtig het exoskelet open. Het verwijderen van het vleugelcuticula is het moeilijkste aspect van deze procedure. We verliezen tijdens deze stap altijd een deel van de vleugels, wat de reden is dat we de procedure starten met een relatief groot aantal poppen.Zodra de cuticula is ingesneden, wordt deze van de vleugel gepeld. Wees voorzichtig om de vleugel niet los te maken van de pop. Nadat de cuticula van het vleugelblad is verwijderd, wordt de cuticula van het vleugelscharnier verder gepeld.Zodra de cuticula van de vleugel is afgepeld, kan men op soortgelijke wijze proberen de cuticula van de poot af te pellen. Veel poten zullen waarschijnlijk tijdens dit proces verloren gaan, maar ondanks de lage opbrengst wordt deze stap sterk aanbevolen, aangezien het de kleuring van de cortone-organen in de poot aanzienlijk verbetert. Plaats de pop in een eppendorfbuis gevuld met methanol en bewaar deze bij kamertemperatuur.Ga verder met het pellen van de cuticula van alle puy en voeg deze toe aan dezelfde buis, tot er in totaal ten minste 10 goed gepelde puy zijn. Verwijder voor elke kleuring de methanol en was drie keer gedurende vijf minuten met 95% ethanol. Gefixeerde puy kunnen gedurende langere tijd bewaard worden in 95% ethanol bij minus 20 graden voorafgaand aan de immunokleuring.Om de larven te monteren, plaatst u een druppel monteermiddel op een objectglas en positioneert u vervolgens de larven met de cuticula's naar beneden en de spieren van de lichaamswand naar boven. Plaats een kleine druppel monteermiddel op een schoon dekglas en gebruik dit om het preparaat af te dekken zonder druk uit te oefenen op de gemonteerde larven. Om de puby te monteren.Bereid eerst twee microscoopglaasjes voor met een druppel montage medium, één voor de dissectie en de tweede voor het monteren. Plaats meerdere poppen op een van de glaasjes en gebruik vervolgens de veerschaar om de kop en het achterste deel van het abdomen te verwijderen. Scheid vervolgens de dorsale helft van het thorax van de ventrale helft door tussen de vleugels en de poten door te snijden.Plaats de gedissecteerde lichaamsdelen van de pop in de druppel montagemedium. Zorg bij het tweede preparaat dat de vleugels en poten volledig zijn uitgestrekt en probeer overlapping van weefsels zoveel mogelijk te minimaliseren. Plaats tot slot een druppel montagemedium op een dekglas en leg dit over het monster zonder overmatige druk uit te oefenen.Deze confocale micrografie van immuunkleuring van de cortone-organen in larven in het derde stadium toont een mooi uitgestrekt abdominaal segment waarin zeven van de acht cortone-organen duidelijk zichtbaar zijn. De vijf laterale organen die samen het penasco-lipid-orgaan vormen, een enkel lateraal orgaan en één van de twee ventrale cortone-organen zijn zichtbaar. De neuronen van het cortone-orgaan zijn gelabeld met de neuronale marker, een monoklonaal antilichaam 22 C 10, en in rood weergegeven.De ligamentkap en de aanhechtingscellen zijn gelabeld met Antifa tubuline 85 E en worden in blauw weergegeven. De kap- en ligamentcellen zijn bovendien gelabeld met een cortitonaal orgaan. Specifieke GFP-reporter die een regulatoir element voor de Delilah-locus bevat.Hier zijn de chordotonalia van de vleugel bij de ventrale radiale ader afgebeeld in deze confocale micrographie van een pop van 35 uur oud. De neuronen zijn gemarkeerd met de neuronale marker 22 C 10 en worden in het rood getoond in paneel B. De ligament- en cap-cellen zijn co-gelabeld met Antifa tubuline 85 E-antilichamen, getoond in het blauw in paneel C, evenals een chordotonaal orgaan. Specifiek GFP-reportertransgen is getoond in het groen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe proprioceptieve cortone-organen in zowel het larven- als het poppenstadium in oph kunnen worden gevisualiseerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze is geoptimaliseerd voor het gebruik van de beschreven antilichamen. Andere antilichamen kunnen mogelijk licht afwijkende fixatie- en kleuringscondities vereisen.Wanneer deze procedure met verschillende antilichamen wordt gebruikt, moeten daarom de optimale condities voor de gebruikte antilichamen worden bepaald.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

In deze video, beschrijven we een methode voor het live-cell imaging van asymmetrisch te verdelen zintuig progenitor cellen en epidermale cellen in...

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier presenteren we een easy-to-use en veelzijdige methode om uit te voeren levende beeldvorming van ontwikkelings processen in algemene en spier-pees genuitdrukking met name in levende Drosophila poppen.

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren de axonale richt met een TL proteïne in volwassen benen van Drosophila door fixatie, montage, imaging en na imaging stappen.

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer immunokleuring en confocale microscopie om proprioceptieve chordotonaalorganen te visualiseren in Drosophila-larven en -poppen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar sensorische ontwikkeling.

Visualisatie van proprioceptoren in

Meer video's verkennen