Name: Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Leer een real-time screeningsmethode voor het identificeren van modulatoren van GIRK-kanalen met behulp van fluorescentiegevoelige kleurstoffen in ATT20-cellen. Deze techniek versnelt de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen voor neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de US Public Health Service Award NS-071530.

1. Voorbereiding van de Cellen <ol><li> Groei hypofyse AtT20 cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% paardenserum en handhaven culturen 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 5% CO2. </li><li> Handhaving van de cultuur door een subcultuur van de cellen om de 5 tot 7 dagen met een standaard behandeling met trypsine procedure. </li><li> Smeer de putjes zwart, duidelijke bottom 96-wells platen met 50 ul van poly-L-lysine. Laat de putten drogen gedurende 30 min in de incubator. </li><li> Plaat de cellen in de 96-well platen met 200 pi media dichtheid van 30.000 cellen per putje en slaan de cellen in de incubator gedurende 3-4 dagen. </li><li> Gebruik een streven installatie bestaande uit een gesloten 4 liter beker verbonden met een vacuum aan een uiteinde en 200 ul pipet op het andere uiteinde aan het kweekmedium langzaam zuigen van de celmonolaag. </li><li> Was de cellen met 200 pi normaalzoutoplossing bufferoplossing (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH). </li><li> Voeg 200 ul van een bufferoplossing met de membraanpotentiaal-gevoelige kleurstof (MPD) DiBAC 4 (3) of HLB 021-152 (5 pM) aan elk putje en incuberen van de cellen gedurende 40 min bij 37 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van testverbindingen en Cell behandeling <ol><li> Bereid een seriële verdunning van proefverbindingen (voorraad = 10 mM in DMSO) van een verbinding bibliotheek (in 96-well formaat) met een Versette (ThermoFisher) geautomatiseerde vloeistof handlingsysteem. </li><li> Verwijder de 96-wells plaat, die de AtT20 cellen, uit het incubator en laat de plaat op kamertemperatuur. Zuig de oude buffer en toegepast verse buffer oplossing met de MPD van de cellen. </li><li> De vloeistof behandeling toe te passen verschillende concentraties (10 nM tot 10 uM) van de proefverbindingen (2 tot 20 pi) en controle-oplossingen (0,1% DMSO) (in bufferoplossing containing van de MPD) van de 96-wells plaat met de cellen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 5 min met proefverbindingen voor de fluorescerende metingen. </li></ol> 3. Activering van GIRK kanalen, TL Metingen en Analyse <ol><li> Plaats de 96-wells plaat in een Biotek Synergy2 fluorescerende plaat lezer en het verkrijgen van de fluorescerende achtergrond signaal op excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk. </li><li> Breng de GPCR liganden (somatostatine = 200 nM of carbachol = 10 uM) of controle-oplossing (buffer alleen) (20 pi) aan de gootjes (totaal volume 220 pi =) aan de GIRK kanalen met de injector Synergy2 activeren. Verzamel gegevens wijst op 10 s intervallen van meer dan 300 s bemonstering periode bij excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk. </li><li> Haal het tijdsverloop en de piek amplitude van de tl-verandering met behulp van Biotek Gen5 software en de gegevens exporteren naar Excel voor verdere analyse. </li&gt; <li> Bereken de z&#39;-factor van de betrouwbaarheid van de bepaling bepalen. Platen voor z&#39;-factor bepaling bevatte 2 rijen van elk van positieve (GPCR-ligand) en negatieve (buffer alleen) controles. De z&#39;-factor is gedefinieerd als: Z &#39;= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ P - μ N |, waar μ P &amp; μ N zijn de middelen van de positieve en negatieve signalen, en a P &amp; σ N zijn de standaarddeviaties van de positieve en negatieve signalen, respectievelijk 6. Z&#39;-elementen in het bereik van 0,5 tot 1,0 te geven dat de kwaliteit van de test is uitstekend 6. Platen met z&#39;-factoren lager dan 0,5 zijn uitgesloten van de analyse. </li><li> Verbindingen die het fluorescentiesignaal moduleren worden getest in de aanwezigheid van Ba2 + en tertiapin-Q naar binnen gelijkrichter K + kanaal specificiteit te bevestigen. </li></ol> 4. Representative resultaten Een voorbeeld van de fluorescentiepiek gemeten met de GIRK kanaal assay in figuur 2. Toevoeging van de GPCR ligand somatostatine (200 nM) de AtT20 cellen veroorzaakten een snelle, tijdsafhankelijke afname van de HLB 021-152 fluorescentiesignaal (figuur 2). Daarentegen Bovendien controleoplossing tot een kleine momentane stijging van de fluorescentie met de tijd weer de uitgangssituatie (figuur 2). Vergelijking van piek fluorescerende waarden in 96-well platen geïnjecteerd met controle en somatostatine oplossingen een z&#39;-elementen in het bereik van 0,5 gaf 0,7. Voor verdere kwantificering werd controleplan afgetrokken somatostatine plaat en de resulterende somatostatine-gevoelige signaal geanalyseerd (Figuur 2). De test verschaft een werkwijze voor het identificeren van geneesmiddelen die snel GIRK kanalen moduleren. Bijvoorbeeld, geneesmiddelen die de GIRK cha remmennnel moet verminderen GPCR-ligand-gemedieerde afname van de fluorescentie door het voorkomen van K + efflux uit de cellen. Zoals getoond in figuur 3, de cellen behandeld met tertiapin-Q, een toxine die blokken GIRK kanalen 7 een remming van de somatostatine-gemedieerde fluorescerende verandering geproduceerd. Propafenon een anti-aritmische geneesmiddelen die blokken GIRK kanalen in het hart 8 ook de fluorescerende verandering (figuur 4) onderdrukt. De test kan ook nuttig voor het identificeren van de activatoren GIRK kanaal. De toepassing van ethanol (100 en 200 mM) een activator van het kanaal GIRK 2,3 veroorzaakt geen significante verandering in het fluorescentiesignaal vergeleken met (p&gt; 0,5) gebruikt. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Experimentele ontwerp van de GIRK kanaal fluorescentie. AtT20 cellen geïncubeerd in een buffer met een membraame potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstof (D). De kleurstofmoleculen gaan de cellen en worden fluorescerend bij binding aan intracellulaire proteïnes (boven). Binding van somatostatine (Som) zijn GPCR stimuleert G remmende eiwit (G i), waardoor de activatie van de GIRK kanaal (onder). De daaropvolgende uitstroom van K + uit de cellen leidt het membraan mogelijk om meer negatief de kleurstofmoleculen de cellen af te sluiten. Als gevolg hiervan fluorescentiesignaal afneemt (onder). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Vertegenwoordiger van HLB 021-152 fluorescerende signaal gemeten over de tijd in de AtT20 cellen tijdens toevoeging van somatostatine of controle oplossing. De verhouding van de fluorescentie-intensiteit (F / V O) werd berekend door het signaal in de aanwezigheid (F) van somatostatine (of controle-oplossing) van de basislijn gemeten signaal vóór (F O) addition van somatostatine (of controle oplossing). Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine of controle oplossing werd toegevoegd op tijdstip nul (↓). Toevoeging van de controle-oplossing veroorzaakt slechts een kleine toename van het fluorescentiesignaal. Dit resultaat van een temperatuursverandering door injectie van de oplossing. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Behandeling van de cellen met AtT20 tertiapin-Q (500 nM) remt de somatostatine-gemedieerde afname in het fluorescentiesignaal door binding en blokkeren GIRK kanalen. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 4-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> Figuur 4. Behandeling van de cellen met AtT20 propafenon (20 uM) remt eveneens de somatostatine-gemedieerde afnamehet fluorescentiesignaal. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓).

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
<li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li>
<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li>
<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Terwijl de membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen zijn gebruikt om medicijnen die ionkanalen moduleren 9,10 te identificeren, dit is het eerste verslag van hun aanvraag voor neuronale GIRK kanaal drug discovery. De GIRK kanaal fluorescentie hier gepresenteerde biedt een snelle, betrouwbare en real-time methode voor de screening van ligand-gated K + kanalen. De test kan worden aangepast voor gebruik met een groot aantal cellen inclusief geïmmortaliseerde cellijnen (HEK293, CHO, enz.)...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-wells platen </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette geautomatiseerde vloeibare handler </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 fluorescerende plaat reader </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 analyse software </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tabel specifieke reagentia en materialen.

een tl-screeningstest voor het vaststellen van modulators van girk kanalen

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K + (GIRK) kanalen functioneren als cellulaire mediatoren van een breed scala van hormonen en neurotransmitters en worden uitgedrukt in de hersenen, het hart, de skeletspieren en endocriene weefsel 1,2. GIRK kanalen worden geactiveerd na de binding van liganden (neurotransmitters, hormonen, drugs, enz.) om hun plasma-membraan-gebonden, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s). Deze binding veroorzaakt de stimulatie van G-eiwitten (G i G en o), dat vervolgens binden en activeren GIRK kanaal. Eenmaal geopend de GIRK kanaal maakt het mogelijk de beweging van K + uit de cel, waardoor de rust membraanpotentiaal om meer negatief. Bijgevolg GIRK kanaal activering in neuronen afneemt spontane vorming van actiepotentiaal en remt de afgifte van neurotransmittoren. In het hart, de activering van de GIRK kanaal remt pacemaker-activiteit waardoor het vertragen van de hartslag. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK kanalen vormen nieuwe targets voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen voor de behandeling neuropathische pijn, drugsverslaving, hartritmestoornissen en andere aandoeningen 3. Echter, de farmacologie van deze kanalen nog grotendeels onontgonnen. Hoewel een aantal geneesmiddelen, waaronder anti-aritmische middelen, antipsychotica en antidepressiva blokkeren de GIRK kanaal, deze remming is niet selectief en komt voor bij relatief hoge concentraties van de stof 3. We beschrijven hier een real-time screening test voor het identificeren van nieuwe modulatoren van GIRK kanalen. In deze assay worden neuronale AtT20 cellen tot expressie GIRK kanalen geladen membraan potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbituric zuur) trimethine-oxonol [DiBAC 4 (3)] of HLB 021-152 (figuur 1 ). De kleurstofmoleculen wordt sterk fluorescerend volgende opname in de cellen (Figuur 1). Behandelingvan de cellen met GPCR liganden stimuleert GIRK kanalen te openen. De resulterende K + efflux de cel veroorzaakt het membraan mogelijk om meer negatieve en het fluorescentiesignaal dalen (figuur 1). Zo kunnen medicijnen die K + efflux moduleren door het GIRK kanaal worden getest met behulp van een fluorescerende plaat lezer. In tegenstelling tot andere ionkanaal screeningstesten, zoals atomaire absorptiespectrometrie 4 of radiotracer analyse 5, de GIRK kanaal fluorescentie biedt een snelle, real-time en goedkope screening procedure.

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) kanalen beschreven. De test maakt gebruik van membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen op GIRK activiteit op het kanaal te meten. Deze techniek is geschikt voor toepassing op een aantal cellijnen.

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G-proteïne-gestuurde inward rectifier K+-kanalen (GIRK-kanalen) functioneren als cellulaire mediatoren voor een breed scala aan hormonen en neurotransmitters en komen tot expressie in ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe geneesmiddelen die grk-kanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst de A TT 20-cellen in de 96-wells plaat uit te platen. De tweede stap is het verdunnen van de testverbindingen met behulp van het Verset vloeistofplaat-handlingsysteem.Vervolgens worden de verdunde testverbindingen met de verset op de cellen aangebracht. De laatste stap is om de 96-wells plaat in de Synergy two fluorescentieplaatlezer te plaatsen en de controle- en somatostatine-oplossingen in de wells te injecteren. Uiteindelijk wordt de fluorescentieplaatlezer gebruikt om de verbindingen aan te tonen die het door somatostatine geïnduceerde fluorescentiesignaal veranderen en daarmee de Grk-kanalen moduleren.Het voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande methoden, zoals patchclamp-registratie, is dat een groot aantal verbindingen snel gescreend kan worden om te bepalen of ze gerk-kanalen moduleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling van pijn, omdat verbindingen die het Gerk-kanaal activeren, wat leidt tot inhibitie van FI-nociceptieve transmissie, geïdentificeerd kunnen worden. De demonstratie van d

a-fluorescent-screening-assay-for-identifying-modulators-girk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Source: Rugjee, K. N., et al. Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the screening of cyclic di-GMP modulators using genetically modified bacteria that express green fluorescent protein (GFP) under the control of a c-di-GMP-sensitive promoter. Fluorescence is measured in a multi-well plate containing different test compounds. Compounds that inhibit c-di-GMP...

Screening of Cyclic di-GMP Modulators Using Bacteria Expressing a Fluorescent Reporter Protein 

This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds' stimulatory and inhibitory effects, respectively.

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

This video illustrates a cellular assay involving glioblastoma cells expressing CXCR4 chemokine receptors. The assay employs a calcium-sensitive dye to measure fluorescence changes upon agent interaction, offering insights into cellular signaling dynamics.

A Cellular Assay for the Identification of CXCR4-Interacting Agents

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Leer een real-time screeningsmethode voor het identificeren van modulatoren van GIRK-kanalen met behulp van fluorescentiegevoelige kleurstoffen in ATT20-cellen. Deze techniek versnelt de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen voor neurologische aandoeningen.

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

Meer video's verkennen