Name: Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer muizenembryonale fibroblasten (MEFs) isoleren voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze gestandaardiseerde methode garandeert hoogwaardige feederlagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Met dank aan dr. Boris Greber voor het opzetten van de Activin een ELISA-protocol, zoals gepubliceerd in Greber et al.. 2007. Wij zijn bijzonder dankbaar aan mevrouw Monica Shevack de voorbereiding van de grafisch overzicht. We zijn erg dankbaar dat dr. Heiko Fuchs voor alle hulp en waardevolle suggesties voor en tijdens het filmen. We willen alle leden van de Adjaye laboratorium, in het bijzonder Elisabeth Socha bedanken voor het handhaven van een constante aanvoer van MEFs en CM. Wij erkennen ook onze collega&#39;s van het dier faciliteit van de MPIMG voor hun blijvende steun. Dit werk werd mede gefinancierd door het Max Planck Instituut en de [BMBF; licentienummer 0315717A] en partners uit de ERASysBio + initiatief ondersteund door het EU ERA-NET Plus-regeling in KP7.

1. Isolatie van muis embryonale fibroblasten (MEF) De volgende twee stappen worden uitgevoerd onder niet-aseptische omstandigheden. <ol><li> Offer een zwangere muis (CF1, Harlan, USA) op 13 of 14 DPC (dag na de coïtus) door cervicale dislocatie. </li><li> Ontleden de baarmoederhoorns kort in 70% (v / v) ethanol en plaats spoel in een Falconbuis met PBS zonder Ca2 + Mg + 2 (Gibco, Invitrogen). </li></ol> De volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden en met steriele instrumenten. <ol start="3"><li> Plaats baarmoederhoorns in een petrischaal en scheid elk embryo uit de placenta en embryonale weg. </li><li> Ontleden hoofd en rode organen, te wassen in PBS en plaats alle embryo&#39;s in een schone petrischaal. Fijn gehakt het weefsel met behulp van een steriel scheermesje totdat het mogelijk wordt pipetteer aan. </li><li> Voeg 1 ml 0,05% trypsine / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluDing 100 Kunitz eenheden van DNase I (USB), per embryo. </li><li> Breng het weefsel in een 50 ml Falcon buis incuberen gedurende 15 min bij 37 ° C. Na elke vijf minuten incubatie, dissociëren cellen en neer te pipetteren goed. </li><li> Inactiveren van de trypsine door ongeveer 1 deel vers bereide MEF medium. MEF kweekmedium (componenten tot 500 ml van de media te maken, meng alle componenten en filter): 450 ml DMEM 50 ml FBS (10% (v / v)), 5 ml 200 mM L-glutamine (1/100 (v / v)) 5 ml penicilline-streptomycine (1/100 (v / v)). </li><li> Centrifugeer de cellen met lage snelheid (300 xg), 5 min, verwijder voorzichtig het supernatant af en resuspendeer celpellet in warme MEF medium. </li><li> Plaat ongeveer aantal cellen die gelijk 3-4 embryo per T150 (TPP) kolf bekleed met 0,2% gelatine (Gelatine van runderen huid, type B, Sigma) gedurende 2 uur. De fibroblasten (P0, passage 0) zijn de enige cellen die het vermogen om aan een gelatine beklede kolven. </li&gt; <li> Idealiter cellen 80-90% confluent na 24 uur en in dit stadium een ​​groot deel van P0 cellen ingevroren voor toekomstig gebruik. </li><li> Vouw de resterende T150 kolf (s) van P0 cellen tot P3 of P4 vervolgens geïnactiveerd en gebruikt als voeders voor hESC &#39;replate of geconditioneerde medium (CM) produceren. </li></ol> 2. Inactivatie en Plating MEF (Feeder cellen Voorbereiding) Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. <ol><li> Coat T150 flessen met 0,2% gelatine en incuberen bij kamertemperatuur ten minste 2 uur. </li><li> Verdun mitomycine C in PBS (1 mg / ml) en filter. </li><li> Zuig media van MEFs en wassen met PBS zonder Ca 2 + Mg 2 +. </li><li> 20 ml medium dat 10 ug / ml mitomycine C op MEFs. </li><li> Incubeer 2 uur bij 37 ° C met mitomycine C bevattend medium vervolgens tweemaal wassen met PBS, trypsinize, centrifuge (gedurende 5 min bij 300 x g) en hersuspenderen cellen in warm medium. </li><li>Tel cellen en plaat met een dichtheid van 56.000 cellen / cm 2 T150 flessen en gebruiken CM productie de volgende 6 dagen. </li></ol> 3. Geconditioneerd medium (CM) Voorbereiding Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. <ol><li> De dag erna plateren geïnactiveerd MEFs bij een dichtheid van 56.000 cellen / cm 2 vervangen MEF medium hESC medium (UM, ongeconditioneerd medium) (0,5 ml / cm 2) aangevuld vers met 4 ng / ml FGF2. </li><li> Verzamel CM van feeder kolven na 24 uur incubatie en voeg verse hESC medium dat 4 ng / ml van FGF2 op de voedingsdraden. </li><li> Herhaal deze procedure voor de komende 6 dagen. Elke dag slaan verzameld CM bij -20 ° C. </li><li> Na 6 dagen meng alle fracties van de middelgrote en filter (Corning, 0,22 pm, PAS). Maak 50 ml porties en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Supplement CM extra 4 ng / ml FGF2 voor het toevoegen aan hESC &#39;gegroeid Matrigel. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Meting van activine A in geconditioneerde media (ELISA) 15 <ol><li> Breng alle monsters en reagentia op kamertemperatuur komen. </li><li> Verdun vangen antilichaam (Human \ Mouse \ Rat Activin een mAb, R &amp; D Systems) in PBS met 1% BSA, toe te voegen aan microplaat (100 pl / putje) en overnachting in het RT uitbroeden. </li><li> Na 24 uur de putjes drie keer daarna wassen met PBST (PBS met 0,05% Tween 20) (300 ul / well) blok (1% BSA / PBS, 300 ul / well) gedurende 1 uur bij RT. </li><li> In deze tijd bereiden op een Activin A (R &amp; D Systems) standaard curve, waaronder 7 verdunningen (concentratie minder dan 30 ng / ml) en de blanco monster. De lineaire werkbereik van de Activin A tussen 0,25 en 32 ng / ml. </li><li> Voeg duplicaten van standaarden en monsters aan de gootjes (100 ul / well) en incubeer 2 uur bij KT. </li><li> Was putjes drie keer (300 ul PBST). </li><li> Voeg de secundaire (gebiotinyleerd) antilichaam (Human / muis / rat gebiotinyleerd Activin een mAb, R &amp; D Systems) (0.25 ug / ml in 1% BSA / PBS) en geïncubeerd gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was putjes drie keer (300 ul PBST) toevoegen Streptavidine-HRP (verdund in 1% BSA / PBS, R &amp; D Systems) en geïncubeerd gedurende 20 min bij KT. </li><li> Was putjes drie keer (300 ul PBST) toevoegen van 100 pi substraatoplossing (Quantikine, R &amp; D Systems) en geïncubeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Voeg 100 ul van stop-oplossing (Quantikine, R &amp; D Systems) in elk putje en meng voorzichtig. </li><li> Set microplaat afleesapparaat (Molecular Devices Spectra Max 250 Global medische instrumenten, Inc, Minnesota) tot 450 nm, met een golflengte correctie bij 540 of 570 nm, om de optische dichtheid van elk putje bepalen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten De opzet van de isolatieprocedure is weergegeven in figuur 1. De typische morfologie van hESC &#39;en hiPSCs gekweekt onder verschillende omstandigheden is weergegeven in figuur 2. De morfologie van<html> MEFs en geïnactiveerd feeder cellen die worden gebruikt om CM te bereiden is weergegeven in figuur 3. In het algemeen moet cellen zijn samenvloeiing 24 uur na isolatie en klaar om te worden ingevroren of uitgebreid. Echter, soms kan het 2-3 dagen duren voordat het verkrijgen van samenvloeiende culturen. De CM worden bereid uit cellen doorgang 4 en uiterlijk. Dit is cruciaal omdat de primaire cellen kunnen alleen worden uitgebreid voor 4-5 passages voor het begin van senescentie. De cytokine, Activin A, wordt beschouwd als de belangrijkste factor wordt uitgescheiden door feeder cellen voor de ondersteuning van ongedifferentieerde groei van pluripotente cellen 14. De meting van het niveau van activine A in CM (figuur 4) is een zeer gunstige kwantitatieve bepaling van de kwaliteit van MEF controleren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Figuur 1. Een schematische weergave van de MEF isolatieprocedure. NHOUD &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Figuur 2. De typische morfologie van ongedifferentieerde hESC &#39;gekweekt in aanwezigheid van (A) feeder cellen (B) geconditioneerd medium en (C) gedefinieerd medium. De typische morfologie van hiPSCs gekweekt in aanwezigheid van (D, E) feeder cellen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Figuur 3. De typische morfologie van muizen embryonische fibroblasten (MEF). (A) Passage 0 (P0) twee dagen na plating / isolatie, (B) geïnactiveerd voedingsbodem bij een dichtheid van 56.000 cellen / cm. 2 <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Figuur 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde metingen van de concentratie van activine A in geconditioneerd medium (CM) prepared met muis embryo fibroblasten afgeleid van de CF1 muizenstam. CM werd verzameld voor 6 dagen en dan samengevoegd. CM &quot;1&quot; en CM &quot;2&quot; naar verschillende partijen media en UM ongeconditioneerde media. Als de functie van de conditionering proces wordt Activin een afscheiding in het medium door MEF, Activin A is bijna niet op te sporen in de UM.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li>
<li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li>
<li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li>
<li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li>
<li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li>
<li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+%28hESCs%29+to+support+hESC+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li>
<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De MEF isolatieprocedure hier gepresenteerde maakt het opzetten van een gestandaardiseerde cultuur voorwaarde voor hESC &#39;s en hiPSCs. Bovendien is de ELISA-systeem gebruikt cytokine productie beoordelen door feeder cellen is een bruikbare indicator van de kwaliteit van de MEF verkregen geconditioneerde media. De onderhoud van het muizenstam (CF1) voor de ondersteuning fibroblasten moet batch-tot-partij variatie van kweekmedia voorkomen. Bovendien is het aan te raden om embryo&#39;s te isoleren van meerdere muizen tegelijkertijd om een ​​constante kwaliteit van de cellen te verkrijgen. Zeker vers geïsoleerde MEFs gehouden kunnen worden bevroren op P0 en P1. Ook geïnactiveerd MEF worden ingevroren in hoeveelheden van geschikte hoeveelheden afhankelijk van de eisen voor celkweek. Meestal ongeveer 250.000 cellen worden uitgeplaat in een put van een 6-wells plaat tot cultuur hESC &#39;s en IPS-cellen. De gevestigde en geoptimaliseerd methode routinematig worden gebruikt om de verschillen tussen diffe minimaliserenhuren experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM (High Glucose) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum filtersysteem </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0,22 pm, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum Vervanging </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> beta-mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycine C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Basic Fibroblast Growth Factor </td><td> PeproTech </td><td> 18B 100 </td><td></td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd Anti-human/mouse/rat Activin A Antilichaam </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> Human / muis /Rat Activin een mAb </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% trypsine-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Thin Iris Schaar </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Graefe tang </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse Fixatie tang </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van muis embryonale fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In het algemeen menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) 1 kunnen worden gekweekt onder wisselende omstandigheden. Het is echter niet eenvoudig om een ​​effectief voor het kweken van deze cellen. Omdat de kweekomstandigheden van invloed kunnen zijn expressie van genen die verleent pluripotentie in hESC &#39;s en hiPSCs, de optimalisatie en standaardisatie van de kweekmethode is cruciaal. De instelling van hESC lijnen werd beschreven door MEF als feeder cellen en foetaal runderserum (FBS) bevattende kweekmedium 2. Vervolgens werd FBS vervangen door knock-out serum vervanging (KSR) en FGF2, die verspreiding van hESC &#39;s 3 verbetert. Tot slot, feeder-vrije cultuur systemen maken het mogelijk het kweken van cellen op Matrigel gecoate platen in KSR-bevattende geconditioneerd medium (medium bepaald door MEF) 4. Vervolgens hebben hESC &#39;s kweekomstandigheden verhuisd naar feeder-vrije cultuur in chemisch defined omstandigheden 5-7. Bovendien hebben om de mogelijke besmetting door ziekteverwekkers en dierlijke eiwitten cultuur methoden met behulp van xeno-vrije componenten te voorkomen is opgericht 8. Om betere voorwaarden te verkrijgen muis feeder-cellen zijn vervangen door menselijke cellijnen (bijvoorbeeld spier-en foetale huidcellen 9, volwassen huidcellen 10, voorhuid fibroblasten 11-12, vruchtwater mesenchymale cellen 13). Echter, de efficiëntie van de handhaving van ongedifferentieerde hESC &#39;s met behulp van menselijke voorhuid fibroblast-afgeleide feeder lagen is niet zo hoog als dat van de muis feeder cellen als gevolg van het lagere niveau van de secretie van Activin A 14. Uiteraard is er een duidelijk verschil in groeifactor door muizen en mensen feeder cellen. Analyses van de transcriptomen van muis en mens feeder-cellen aangetoond dat er belangrijke verschillen tussen de ondersteunende en niet-ondersteunende cellen. Exogene FGF2 is cruciaal voor maintaining zelf-vernieuwing van hESC &#39;s en hiPSCs, en is geïdentificeerd als een belangrijke factor die de expressie van Tgfβ1, Activin A en Gremlin (een BMP-antagonist) in feeder-cellen. Activin A is aangetoond dat de expressie van OCT4, SOX2 en NANOG in hESC &#39;s 15-16 induceren. Voor de lange termijn cultuur, kan hESC &#39;s en hiPSCs worden geteeld op mitotisch geïnactiveerd MEFs of onder feeder-vrije omstandigheden in MEF-CM (MEF-geconditioneerd medium) op Matrigel-gecoate platen om hun ongedifferentieerde toestand te houden. Succes van beide kweekomstandigheden volledig afhankelijk van de kwaliteit van de feeder cellen omdat invloed uitoefenen op de groei van hESC &#39;. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor de isolatie en de cultuur van muis embryonale fibroblasten (MEF), voorbereiding van geconditioneerd medium (CM) en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) om de niveaus van activine A in de media te beoordelen.

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

In het algemeen kunnen menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) onder variabele omstandigheden worden gekweekt. Echter, het ...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van embryonale fibroblasten van muizen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst elk embryo te scheiden en de kop en rode organen te verwijderen. Vervolgens wordt het weefsel fijngehakt en gedigesteerd.Vervolgens worden de cellen geplaatst, drie tot vier embryo's per kolf, en uitgebreid. Ten slotte worden de geïnactiveerde mythes gebruikt om het geconditioneerde medium te bereiden. Uiteindelijk wordt e LSA gebruikt om de optimale concentratie van actief in een geconditioneerd medium aan te tonen die de ongedifferentieerde groei van pluripotente stamcellen ondersteunt.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de procedure gestandaardiseerd moet worden om embryonale fibroblasten van muizen van hoge kwaliteit te produceren, wat de ongedifferentieerde groei van zowel menselijke embryonale stamcellen als geïnduceerde pluripotente stamcellen mogelijk maakt. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de isolatie- en dissectiestappen van het embryo moeilijk te leren zijn omdat de hantering van het muizenembryo bepaalde handvaardigheden vereist. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Justina Suk, een postdoc in mijn laboratorium, en Caterina Dres, een promovendus.Nadat een zwangere muis 13 of 14 dagen na de copulatie is opgeofferd en de uterine hoorns zijn gedissecteerd, spoelt u deze kort af met 70% ethanol en plaatst u ze onder aseptische omstandigheden in een Falcon-buis met PBS onder een weefkweekkap. Plaats de uterine hoorns in een Petrischaal en scheid elke embryo van de placenta en de embryonale zak. Verwijder de kop en de rode organen, was de resterende delen van het embryo met PBS en plaats ze met een steriel scheermesje in een schone Petrischaal.Maal het weefsel tot slot fijn totdat het mogelijk is om het te pipetteren. Voeg vervolgens één milliliter 0,05% tripsine in EDTA en 100 K eenheden DNase I per embryo toe. Draag het weefsel daarna over naar een Falcon-buis van 50 milliliter en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 °C.Ontkoppelen de cellen na elke vijf minuten incubatie door grondig op en neer te pipetteren. Inactiveren de trypsine door ongeveer één volume vers bereid meth.Medium toe te voegen. Centrifugeren de cellen gedurende vijf minuten bij een lage snelheid.Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in warm meth-medium; bereid flessen voor die gecoat zijn met 0,2% gelatine en incubeer deze gedurende ten minste twee uur. Plaats bij kamertemperatuur de cellen van ongeveer drie tot vier embryo's in elke met 0,2% gelatine gecoate fles. De fibroblasten zijn de enige cellen die in staat zijn om aan de met gelatine gecoate flessen te hechten.Na ongeveer 24 uur, wanneer de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, worden sommige cellen ingevroren bij -80 °C. Voor toekomstig gebruik worden de overige cellen uitgebreid naar P3 of P4. Om feeder-cellen voor te bereiden met behulp van de P3- of P4-cellen, wordt gestart met het coaten van T150-flessen met 0,2% gelatine, waarna deze gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur worden geïncubeerd.Verdun mitomycine C in PBS en filter dit door een spuitfilter. Aspireer het medium van de meths en was deze met PBS zonder calcium of magnesium. Breng 20 milliliters medium met 10 micrograms per milliliter mitomycine C aan op de maths en incubeer gedurende twee uur bij 37 degrees Celsius.Was de cellen vervolgens twee keer met PBS en trypsiniseer ze. Na incubatie worden de cellen gesuspendeerd in meth-medium, waarna de cellen worden gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in warm meth-medium. Plaats de cellen met een dichtheid van 56.000 cellen per vierkante centimeter in T150-flasks en incubeer ze een nacht; de meth-cellen worden de dag na het uitplaten verder verwerkt.Vervang het kweekmedium door niet-geconditioneerd HESC-medium, aangevuld met verse 4 ng/mL FGF2, en plaats dit in een incubator bij 37 °C. Verzamel na 24 uur het geconditioneerde medium uit de flessen en vervang dit door vers HESC-medium. Bewaar het verzamelde medium bij -20 °C.Herhaal de collectie gedurende in totaal zes dagen na de zesde collectie. Combineer al het medium en filtreer het. Bewaar het vervolgens in aliquoten van 50 milliliter bij minus 80 graden Celsius.Om actief in a te meten in geconditioneerd medium, breng dan alle monsters en reagentia naar kamertemperatuur. Verdun het actieve in a-antilichaam in PBS met 1%BSA en voeg 100 µL toe aan de wells van een microplaat. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur na 24 uur.Was de wells drie keer met PBST. Blok vervolgens de wells gedurende één uur bij kamertemperatuur. Bereid in de tussentijd een actieve standaardcurve voor, bestaande uit zeven verdunningen en een blanco monster, met een werkbereik van 0,25 tot 32 nanogram per milliliter.Voeg duplicaten van de standaarden en monsters toe aan de wells en incubeer deze gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Was de wells drie keer met PBST. Voeg vervolgens een gebiotinyleerd secundair antilichaam toe en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Was de wells vervolgens drie keer met PBST en voeg streptavidine-HRP toe. Meng dit, voeg het substraat toe, wikkel de wanden in ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 100 µL stopoplossing toe aan elke well en meng voorzichtig.Stel tenslotte de microplate-reader in op 550 nanometer met golflengtecorrectie op 540 of 570 nanometer, en bepaal de optische dichtheid voor elke getoonde well. Hier is de typische morfologie van ongedifferentieerde h ESCs, gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen, geconditioneerd medium en gedefinieerd medium. In deze voorbeelden worden HI PSCs gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen.Deze afbeeldingen tonen de morfologie van mythes en geïnactiveerde feeder-cellen die worden gebruikt voor het bereiden van geconditioneerd medium. Over het algemeen moeten de cellen 24 uur na isolatie confluent zijn en gereed zijn om te worden ingevroren of uitgebreid. Soms kan het echter twee tot drie dagen duren voordat er confluente culturen zijn verkregen.Het geconditioneerde medium dient te worden bereid uit cellen in passage vier en niet later. Dit is cruciaal omdat primaire cellen slechts vier tot vijf passagen kunnen worden uitgebreid voordat senescence optreedt. De cytokine actief in a wordt beschouwd als een van de meest kritische factoren die door feeder-cellen worden uitgescheiden voor de ondersteuning van de ongedifferentieerde groei van pluripotente cellen.Het meten van het niveau van actieve in een geconditioneerd medium, zoals hier getoond, is een handige kwantitatieve assay om de kwaliteit van mets te monitoren. Zodra de techniek beheerst is, kan de isolatie van muisembryonale fibroblasten in één tot twee uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de dieren vooraf te fokken en alle instrumenten vooraf voor te bereiden en te autoclaveren.

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Leer muizenembryonale fibroblasten (MEFs) isoleren voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze gestandaardiseerde methode garandeert hoogwaardige feederlagen.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen