Name: Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Leer endotheliale colony forming cellen (ECFCs) isoleren uit menselijk navelstrengbloed voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode karakteriseert klonale proliferatiepotentieel en vaatvorming in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Yoder is consultant voor EndGenitor Technologies, Inc en lid van de raad van Rimedion Technologies, Inc

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Fenotypische en functionele karakterisering van vermeende endotheliale voorlopercellen is belangrijk om de bonafide ECFCs die in staat zijn klonaal en serieel re-plating in cultuur te identificeren en aanleiding geven tot duurzaam en functioneel implanteerbare bloedvaten in vivo. Human navelstrengbloed is verrijkt met ECFCs en de concentratie van deze circulerende cellen neemt af met het ouder worden of ziekte 10. Recente studies suggereren dat ECFC kan een belangrijke rol in vasculaire repa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Heparine Natrium injectie, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Mengen canule </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> Gedefinieerd FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE express </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Rat type I collageen </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FcR Block </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugated </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, FITC-geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, FITC-geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE geconjugeerd </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE geconjugeerd </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Mevrouw IgG 1, k antilichaam, FITC-geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Mevrouw IgG 1, k antilichaam, PE geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Mevrouw IgG 2a, k antilichaam, FITC-geconjugeerd </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-menselijke CD31 </td><td> Dako </td><td> kloon JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22 pm vacuümfiltratie systeem </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> IJsazijn, 17.4N </td><td> Visser </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC Zink Fixatief </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox groene reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Klonen cilinders, steriel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale colony forming cellen uit menselijk navelstrengbloed

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Sinds zeer lange tijd uitzicht op de vorming van nieuwe bloedvaten via angiogenese, vasculogenese en arteriogenese zijn onlangs beoordeeld 1. De aanwezigheid van circulerende endotheliale voorlopercellen (EPC&#39;s) werden voor het eerst geïdentificeerd in volwassen menselijke perifeer bloed door Asahara et al.. In 1997 2 het instellen van een infusie van nieuwe hypothesen en strategieën voor vasculaire regeneratie en reparatie. EPC&#39;s zijn zeldzaam, maar de normale componenten van het circulerende bloedvolume dat huis naar sites van bloedvatvorming of vasculaire remodellering, en grotendeels te vergemakkelijken of postnatale vasculogenese, angiogenese, of arteriogenese via paracriene stimulatie van de bestaande vaatwand afgeleide cellen 3. Er is geen specifieke marker om een EPC te identificeren is geïdentificeerd, en op dit moment de staat van het veld is om te begrijpen dat een groot aantal soorten cellen, waaronder proangiogenic hematopoietische stamcellen en progenitorcellen, circulerende angiogene cellen, Tie2 + monocyten, myeloïde progenitor cells, tumor geassocieerde macrofagen en M2 geactiveerde macrofagen deel stimuleren angiogene proces verscheidene preklinische diermodelsystemen en bij mensen in talrijke ziektetoestanden 4, 5. Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) zijn zeldzaam circulerende levensvatbare endotheliale cellen kenmerkt zich door robuuste klonale proliferatie potentieel, secundaire en tertiaire kolonievormende mogelijkheid op opnieuw platen, en het vermogen om intrinsieke vormen in vivo schepen bij de transplantatie in immunodeficiënte muizen 6-8. Terwijl ECFCs zijn met succes geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde volwassen personen, navelstrengbloed (CB) van gezonde pasgeboren baby&#39;s, en de vaatwand van een groot aantal menselijke arteriële en veneuze vaten 6-9, CB bezit de hoogste frequentie van ECFCs 7 dat scherm de meest robuuste klonale proliferatieve potentieel en de vorm duurzaam en functioneel bloedvaten in vivo 8, 10-13. Hoewel de afleiding vanECFC volwassen perifeer bloed is ingediend 14, 15, hier de methoden voor het afleiden beschrijven klonen expansie en in vitro als in vivo karakterisering van ECFCs van het menselijk umbilical CB.

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te geven<em&gt; In vivo</em&gt; Vat het vormen van vermogen. Fenotypische en functionele karakterisering van uitgroei endotheliale cellen afkomstig van CB zijn belangrijk om te identificeren en te isoleren<em&gt; Bona fide</em&gt; ECFCs voor potentiële klinische toepassing bij het herstel van beschadigde weefsels.

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Langdurige opvattingen over de vorming van nieuwe bloedvaten via angiogenese, vasculogenese en arteriogenese zijn onlangs herzien1. De aanwezigheid van ...

Het algemene doel van deze procedure is om uit te leggen hoe endotheliale kolonievormende cellen of e CFC's kunnen worden afgeleid uit humaan navelstrengbloed. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen uit het navelstrengbloed uit te platen, om vervolgens kolonie-uitgroei van E CFC's te klonen en te expanderen. De tweede stap is om de cellen in vitro te karakteriseren met behulp van een nieuwe single-cell assay-techniek voor klonaal proliferatief potentieel.Ten slotte worden de cellen gekarakteriseerd in een in vivo vaatvormende assay door de productie en implantatie van gels met ECFC's in nud/nud-muizen. Uiteindelijk kan de in vivo vorming van de novo met bloed gevulde gastvaten worden geëvalueerd door middel van H&amp;E-kleuring van de cellulaire implantaten die ECFC's bevatten. Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden is dat zij de bestudering van het proliferatievermogen van endotheelcellen op enkelcelniveau mogelijk maken.De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar het vinden van diagnostische en therapeutische instrumenten voor ziekten zoals perifeer arterieel vaatlijden of PAD, omdat deze techniek ons in staat stelt om het proliferatieve potentieel en het genetische vermogen van de endotheelcellen van een patiënt te onderzoeken. Voeg vóór aanvang van de procedure één milliliter rattenstaartcollageen type 1 toe aan elke put van een weefselkweekplaat met zes putten en laat de plaat vervolgens een nacht incuberen. Verdeel op de dag van de procedure het navelstrengbloed in aliquoten van 15 milliliter in conische centrifugebuizen van 50 milliliter. Voeg vervolgens 20 milliliter PBS toe aan elke buis en pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer.Trek vervolgens 15 milliliter Ficoll-PA op in een pipet, plaats de punt van de pipet op de bodem van de buis met verdund bloed en voeg voorzichtig de Ficoll toe. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 740 ×g bij kamertemperatuur, zonder de vertragingsrem ingesteld. Verwijder na de celscheiding met een transferpipet de troebele laag met mononucleaire cellen met lage dichtheid, die zich bevindt op de interface tussen de Ficoll-piek en het verdunde plasma. Breng de verzamelde cellen over naar een conische buis van 50 milliliter met 10 milliliter EGM-2 medium en pellet de mononucleaire cellen gedurende 10 minuten bij 515 ×g bij kamertemperatuur met de hoge vertragingsrem ingesteld; aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant en gooi dit weg.Was vervolgens de gepelletteerde cellen twee keer met EGM twee en resuspendeer de mononucleaire cellen in EGM twee op een concentratie van 1,25 × 10⁷ cellen per milliliter. Pipetteer nu vier milliliter van de mononucleaire celsuspensie in elke well van de collageen-gecoate plaat en incubeer de cellen tot er op de eerste dag kolonies worden gevormd. Verwijder na incubatie langzaam het gebruikte medium uit de wells met een pipette zonder de losjes hechtende cellen te verstoren.Voeg vervolgens voorzichtig vier milliliters E GM two toe aan de wells en plaats de plaat terug in de incubator. Kolonies verschijnen gewoonlijk tussen dag vijf en 14, de dag vóór de procedure. Bij 50 microliters rattenstaartcollageen.Voeg, zoals voorheen, één van elk toe aan elke well van een 96-wells plaat en incubeer de plaat overnacht op de dag van de procedure. Begin met het tweemaal wassen met PBS van cellen die slechts twee tot drie keer zijn gepassaged. Plaats na het aspireren van de laatste PBS-was een steriele, met gel gecoate klooncilinder rond elke kolonie, waarbij elke cilinder met een steriele pincet stevig tegen de plaat wordt gedrukt.Voeg twee tot drie druppels warme triple E express toe aan elke klooncilinder en incubeer de cilinders gedurende drie tot vijf minuten totdat de cellen beginnen los te laten. Zodra de cellen zijn begonnen los te laten, voegt u ongeveer 250 µL EGM two-medium toe in het midden van de cilinder en pipetteert u dit op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te genereren. Draag nu de suspensie van enkelvoudige cellen uit elke klooncilinder afzonderlijk over naar een individuele microcentrifugebuis.Infecteer de cellen in een plaat met zes putjes met EGFP-expresserende lentivirussen en verzamel de cellen die EGFP tot expressie brengen middels fluorescentie-cytometrie. Incubeer vervolgens de EGFP-positieve cellen en EGM-2 in de met collageen gecoate platen. Wanneer de E-CFC's gereed zijn, verzamel deze met behulp van TrypLE Express zoals zojuist gedemonstreerd en resuspendeer de cellen in EGM-2 medium tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10⁶ cellen per milliliter.Sorteer vervolgens met een flowsorter met een lage stroomsnelheid van 20 cellen per seconde één enkele EGP-positieve ECFC per put in de eerder voorbereide collageen-gecoate 96-wells plaat en vul het uiteindelijke volume van elke put aan met EGM-2 tot ongeveer 200 µL per put. Gebruik daarna een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om te controleren of elke put slechts één cel bevat. Incubeer de plaat gedurende een periode van twee weken, met twee mediumverversingen op dag 14 van de cultuur.Was elke put met 100 µL PBS voordat de cellen worden gefixeerd met 100 µL 4% paraformaldehyd gedurende 30 minuten. Voor CFC's die geen EGFP tot expressie brengen, wordt na fixatie met paraformaldehyd een cyt-reagens toegevoegd, een groen fluorescerende kernkleurstof, waarna incubatie gedurende één nacht bij vier °C volgt. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het aantal uitgebreide endotheelcellen visueel te kwantificeren zoals hier gedemonstreerd; putten met een aantal endotheelcellen van 2 tot 50 worden beschouwd als endotheelcelclusters.Wells met 51 tot 2000 cellen zijn e CFC's met een laag proliferatievermogen en wells met 2001 of meer worden beschouwd als e CFC's met een hoog proliferatievermogen. Nadat de cellen zoals voorheen zijn losgemaakt met triple E express, wordt het aantal levensvatbare cellen van de celcultuur bepaald met een hemocytometer en trypan blue. Breng 2,4 miljoen levensvatbare cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en pellet vervolgens de cellen door centrifugatie terwijl de cellen worden neergesponnen.Meng de componenten voor de gelmatrix grondig en stel vervolgens de pH in op 7,4 met natriumhydroxide terwijl de oplossing op ijs wordt bewaard. Resuspendeer na het verwijderen van het supernatant de pellet in 360 µL warme e GM twee. Voeg vervolgens 840 µL van de gelmatrixoplossing toe aan de cellen en meng de oplossing voorzichtig totdat de cellen volledig in de gel zijn gesuspendeerd. Breng deze ene milliliter cellulair-gel-suspensie over naar één putje van een 12-well weefselkweekplaat en incubeer de plaat totdat de gel polymeriseert.Dek de gel vervolgens vóór de incubatie gedurende de nacht voorzichtig af met twee milliliter warme EGM two; doe dit de volgende dag vlak voor de implantatie. Gebruik irisscharen om de gel in twee gelijke stukken te snijden en plaats de gelstukken terug in dezelfde kweekput met EGM two-medium. Bevestig de sedatie door middel van een knijptest bij de teen en scheer vervolgens de onderbuik van een geanestheseerde nudig mouse van vijf tot zes weken oud, en maak de chirurgische plaats grondig schoon met alcohol- en betadine-doekjes.Gebruik vervolgens steriele, scherpe irisscharen om een incisie van ongeveer vijf millimeter te maken in het onderste kwadrant van de buik, zodat de subcutane ruimte tussen de huid en de buikspier wordt blootgesteld. Disseceer de dermale laag met botte dissectie van de buikspier in twee verschillende gebieden van de buik om pockets van 15 tot 20 millimeter breed te creëren, waarvan één naar het bovenste buikkwadrant leidt en één naar een ander gebied van de buik. Til vervolgens de dermale laag net naast de incisie op.Plaats één helft van de gel in één abdominale pocket en de andere helft van de gel in de andere abdominale pocket. Sluit na het inbrengen van de gels elke incisie met twee tot drie hechtingen met behulp van 5-0 polypropyleen hechtdraad op een snijdende naald. Label de kooikaarten en voer postoperatieve monitoring en analgesie uit volgens de institutionele en protocollaire vereisten.Na het opofferen van het dier op dag 14 na implantatie, wordt de buik van de muis gereinigd met alcoholpads en wordt de huid ingesneden langs de oorspronkelijke incisielijn. Verwijder vervolgens huidflappen op de waarschijnlijke locatie van de gels. Maak circumferentiële incisies rondom de gels om elk implantaat te verwijderen en plaats de uitgenomen implantaten vervolgens in het zinkfixatiemiddel.Met deze ECFC-afleidingsmethode hebben we de uitgroei van primaire kolonievorming al vanaf dag vijf waargenomen. Let op de kasseistenenmorfologie van deze ECFC-culturen op dag vijf, zoals aangegeven door de pijlpuntjes. Uitgebreide koloniën brengen endotheliale antigenen tot expressie, maar geen hematopoëtische antigenen.Zoals getoond in deze representatieve in vitro fenotypische beoordeling van endotheliale en hematopoëtische cellen, heeft immunofenotypering uitgewezen dat e CFCs endotheliale antigenen tot expressie brengen zoals CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four en NRP two, maar geen hematopoëtische antigenen tot expressie brachten, zoals CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four of CD 1 33. Belangrijk is dat, zoals weergegeven in deze staafgrafiek, uitgebreide koloniën een volledige hiërarchie van klonaal proliferatiepotentieel op enkelcelniveau vertonen, variërend van clusters van twee tot 50 cellen tot koloniën van meer dan 2001. Deze micrografieën van koloniën, gekleurd met cyt, een groen fluorescent kernkleurmiddel, zijn verkregen nadat uit navelstrengbloed afgeleide E CFCs gedurende 14 dagen op enkelcelniveau zijn gekweekt.Bovendien vormen ECFC's gehumaniseerde bloedvaten die worden geperfuseerd met rode bloedcellen van de gastheer wanneer ze worden geïmplanteerd in immuundeficiënte muizen. In deze H&amp;E-kleuring van CELLULARIZE-gelimplantaten die ECFC's uit navelstrengbloed bevatten, kunnen microvaten worden waargenomen die gevuld zijn met rode bloedcellen van de gastheer en die zich na 14 dagen implantatie in de collageen-fibronectinegel hebben gevormd. Hier bevestigt de bruine anti-humane CD 31-kleuring verder de humane oorsprong van deze vaten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ECFC's afleidt uit menselijk navelstrengbloed, en hoe u ECFC-kolonies na hun ontwikkeling kloont, expandeert en hun functionaliteit karakteriseert. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers naar het vasculaire endotheel om het endotheliale clonale proliferatiepotentieel en het genetische vermogen van endotheliale cellen uit meerdere bronnen te onderzoeken.

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

De kolonievormende cel (CFC) assay is een in vitro assay waarin hematopoietische voorlopercellen vormen kolonies in een semi-vast medium. Een combinatie van kolonie morfologie, celmorfologie en flowcytometrie worden gebruikt om het vermogen van de voorouders te laten groeien en differentiëren langs de verschillende hematopoietische lijnen te beoordelen.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Dit protocol maakt de betrouwbare generatie en karakterisering van endotheliale cellen uit bloeduitgroei (BOEC's) mogelijk vanuit een klein volume volwassen perifeer bloed. BOEC's kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen en als een substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens

Leer endotheliale colony forming cellen (ECFCs) isoleren uit menselijk navelstrengbloed voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode karakteriseert klonale proliferatiepotentieel en vaatvorming in vivo.

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Meer video's verkennen