Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Het algemene doel van deze procedure is om uit te leggen hoe endotheelkolonievormende cellen of e CFC's uit menselijk navelstrengbloed kunnen worden afgeleid. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen uit het navelstrengbloed te plateren en vervolgens kolonie-uitgroeiingen van E CFC's te klonen en uit te breiden. De tweede stap is het karakteriseren van de cellen in vitro met behulp van een nieuwe eencellig aanvalstechniek voor klonaal proliferatief potentieel.

Ten slotte worden de cellen gekarakteriseerd in een in vivo vaatvormende assay door de productie en implantatie van gels met E CFC's in nod skid muizen. Uiteindelijk kan de in vivo vorming van de novo gastbloedgevulde vaten worden geëvalueerd door h en e kleuring van de ECFC-bevattende cellulaire implantaten. Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden is dat deze methoden het mogelijk maken om het proliferatieve potentieel van endotheelcellen op eencellig niveau te onderzoeken.

De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar het vinden van diagnostische en therapeutische hulpmiddelen voor ziekten zoals ferale arteriële ziekte of PAD omdat deze techniek ons in staat stelt om het proliferatieve potentieel en de genische capaciteit van de endotheelcellen van een patiënt te onderzoeken. Voordat u met de procedure begint, voegt u één milliliter rattenstaartcollageen, type één toe aan elke put van een zesputs weefselkweekplaat en incubeer de plaat 's nachts op de dag van de procedure, verdeel het navelstrengbloed in eenheden van 15 milliliter in 50 milliliter kegelvormige centrifugeerbuizen. Voeg vervolgens 20 milliliter PBS toe aan elke buis en pipet het mengsel meerdere keren op en neer.

Trek vervolgens 15 milliliter fial PA in een pipet, plaats de punt van de pipet op de bodem van de buis met verdund bloed en onderlaag voorzichtig de alpac centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 740 keer G bij kamertemperatuur zonder de deceleratierem in te stellen. Na de celscheiding, gebruikt u een overdrachtpipet om de wazig laag van mononucleaire cellen met lage dichtheid te verwijderen die zich op het grensvlak tussen de fial piek en het verdunde plasma bevindt. Verdeel de verzamelde cellen in een kegelvormige buis van 50 milliliter met 10 milliliter E GM twee medium en pellet de mononucleaire cellen gedurende 10 minuten bij 515 keer G bij kamertemperatuur met de hoge deceleratierem instelling, zuig voorzichtig en gooi het supernatant weg.

Dan, na het wassen van de gepelletiseerde cellen met EGM twee twee keer, suspendeert u ze in EGM twee bij 1,25 keer 10 tot de zevende cellen per milliliter. Pipet nu vier milliliter van de mononucleaire celsuspensie in elke put van de collageen gecoate plaat en incubeer de cellen tot er kolonies vormen op de eerste dag. Na het incuberen, verwijdert u langzaam het gebruikte medium uit de putten met een pipet zonder de losjes hechtende cellen te verstoren.

Voeg vervolgens voorzichtig vier milliliter E GM twee toe aan de putten en plaats de plaat terug in de incubator. Kolonies verschijnen meestal tussen dag vijf en 14 de dag voor de procedure. Bij 50 microliters rattenstaartcollageen.

Type één in elke put van een 96-puts plaat zoals eerder en incubeer de plaat 's nachts op de dag van de procedure. Begin met het wassen van cellen die slechts twee tot drie keer zijn gepasseerd, twee keer met PBS. Na het zuigen van de laatste wasbeurt van PBS, plaatst u een steriele gel gecoate kloningscylinder rond elke kolonie en drukt u elke cylinder stevig tegen de plaat met behulp van steriele pincetten.

Voeg twee tot drie druppels warm triple E express toe aan elke kloningscylinder en incubeer de cilinders gedurende drie tot vijf minuten totdat de cellen beginnen los te komen. Nadat de cellen zijn begonnen los te komen, zuigt u ongeveer 250 microliters EGM twee medium in het midden van de cilinder en pipet omhoog en omlaag om een enkele cel suspensie te genereren. Breng nu de enkele cel suspensie van elke kloningscylinder afzonderlijk over in een individuele micro centrifugeerbuis.

Besmet de cellen in een zes-puts plaat met EGFP-expresserende lentivirussen en verzamel de cellen die EGFP expresseren door middel van fluorescentiecytometrie. Incubeer vervolgens de EEG FP positieve cellen en EGM twee in de collageen gecoate platen. Wanneer de E CFC's klaar zijn, verzamel ze met behulp van trip E express zoals zojuist is aangetoond en suspendeert u de cellen en e GM twee medium tot een eindconcentratie van ongeveer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Gebruik vervolgens een flow sorter met een lage stroomsnelheid van 20 cellen per seconde om één enkele EGP positieve ECFC per put in de eerder voorbereide collageen gecoate 96-puts plaat te sorteren. Pas het eindvolume van elke put aan met EGM twee tot ongeveer 200 microliters per put. Gebruik vervolgens een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat elke put slechts één cel bevat. Incubeer de plaat gedurende een periode van twee weken met twee media veranderingen op dag 14 van cultuur.

Was elke put met 100 microliters PBS voordat u de cellen fixeert met 100 microliters 4% paraform aldehyde gedurende 30 minuten. Voor e CFC's die geen EGFP uitdrukken, voegt u een cyt reagens toe, een groen fluorescerende nucleaire kleurstof na para formaldehyde fixatie en incubeert u bij vier graden Celsius overnacht. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het aantal uitgebreide endotheelcellen zichtbaar te kwantificeren zoals hier wordt aangetoond. Wells met een aantal endotheelcellen van twee tot 50 worden beschouwd als endotheelcelclusters.

Wells met 51 tot 2000 cellen zijn e CFC's met een laag proliferatief potentieel en wells met 2001 of meer worden beschouwd als e CFC's met een hoog proliferatief potentieel. Nadat u de cellen hebt losgemaakt met triple E express zoals eerder, verkrijgt u een levensvatbaar celtelling van de celcultuur door hemo, cytometer en trian