De polyvinylalcohol Sponge Model Implantatie

Het algemene doel van deze procedure is het gebruik van een polyvinylalcohol-spons om wondgenezing bij muizen te modelleren. Dit wordt bereikt door de spons eerst te hydrateren en te laden voor implantatie. Vervolgens wordt de spons in een pocket tussen de buikspier en de huid van de muis geplaatst.

Na implantatie kan elke spons vervolgens worden geïnjecteerd met een behandeling. De laatste stap is het verwijderen van de sponzen uit de muis. Uiteindelijk kunnen coupes worden gemaakt, kleuringen worden uitgevoerd en kwantitatieve assays worden gedaan om veranderingen en variaties in het wondgenezingsproces waar te nemen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in wondgenezing, kan deze ook worden toegepast op andere onderzoeksgebieden, zoals tumorangiogenese, geneesmiddelentoediening en het overleven en innesten van geïmplanteerde cellen. Begin met het hydrateren van de sponzen door deze een nacht lang te roeren in een 0,9% waterige natriumchloride-oplossing. Autoclaveer vervolgens 75 milliliters van de gehydrateerde sponssuspensie gedurende 25 minuten bij 121 °C.

Om de sponzen te steriliseren, plaatst u de autoclaaf-sponsoplossing in een steriele zuivkap. Gebruik vervolgens steriele pincetten om één spons op te pakken, knijp de spons met de pincetten uit en gebruik een vacuümtip om zoveel mogelijk oplossing uit de spons te verwijderen. Plaats de uitgeknepen spons nu in een kweekplaat voor weefselculturen, waarbij u erop let dat er ruimte tussen de sponzen blijft, en pipetteer de behandelingsoplossing direct op het midden van een spons. Druk vervolgens voorzichtig met de pipetpunt op de spons om de absorptie van de oplossing door de spons te bevorderen.

Zodra alle sponsjes zijn geladen, wordt de plaat op ijs bewaard tot de sponsjes in de muis worden geïmplanteerd. Na het bevestigen van de sedatie met de knijpreflextest, wordt de muis in rugligging in een neusconus geplaatst. Gebruik vervolgens een elektrisch scheerapparaat om een gebied van één bij één inch aan haar te verwijderen op de lagere ventrale zijde van de muis, onder de ribbenkast.

Veeg daarna het gebied schoon om afgeknipte haren te verwijderen. Steriliseer het geschoren gebied met Betadine, gevolgd door 70% alcohol. Span vervolgens de huid strak.

Gebruik het scalpel om een verticale incisie te maken, met een lengte van anderhalf tot twee keer de diameter van de in te brengen sponsjes. Let erop dat u niet door de lichaamsholte snijdt. Gebruik de pincet om de rand van de huid vast te pakken.

Gebruik vervolgens een Metzenbaum-schaar om de huid aan beide zijden van de incisie langzaam van de spier te scheiden. Vergroot de pocket over de volledige breedte van de muis en van de borstkas tot aan de achterpoten. Gebruik nu de pincet om de eerste spons die in het dier geplaatst moet worden op te pakken door deze aan de zijkanten samen te knijpen.

Plaats de spons vervolgens in een paar rechte pincetten zodat deze aan de boven- en onderkant wordt vastgehouden. Pak daarna de rand van de huid vast en til deze op met een ander pincet, en voer de spons langzaam in, waarbij contact met de huid of de onderliggende spier wordt vermeden. Zodra alle sponzen zijn ingebracht, worden beide zijden van de incisie met een pincet tegen elkaar gehouden en wordt de hechtdraad door beide huidlagen geregen.

Trek de eerste worp net genoeg aan om de huidranden te sluiten en voltooi de chirurgische knoop met nog een worp in de tegenovergestelde richting. Trek de knoop ditmaal stevig aan. Knoop vervolgens nog twee chirurgische knopen om de hechting te voltooien.

Plaats extra hechtingen om de gehele incisie te sluiten. Verwijder tot slot het dier uit het anesthesiesysteem en houd het in de gaten totdat het bewustzijn is teruggekeerd. De muis zou snel weer moeten gaan lopen en de preoperatieve mobiliteit moeten hervatten.

Begin met het vullen van een spuit met de gewenste oplossing en bevestig een naald met gauge 28 aan de spuit. Bevestig vervolgens de sedatie door middel van een knijptest bij de teen en steek de naald onder een hoek van 45 graden door de huid in het midden van de sponzen, om er zeker van te zijn dat de naald zich in de spons bevindt. Trek de naald vervolgens langzaam verticaal omhoog.

Als de naald zich in de spons bevindt, zal de spons samen met de naald omhoog bewegen. Injecteer vervolgens langzaam de stof in de spons en verwijder de naald. Nadat het dier is geëuthanaseerd, houdt u de huid vast met een pincet en maakt u een incisie nabij de gewenste spons.

Scheid tot slot voorzichtig de sponsjes van de omringende capsule, waarbij wordt voorkomen dat er extra weefsel rondom het verwijderde sponsje wordt geoogst. Sponsjes kunnen onder verschillende omstandigheden worden bewaard, afhankelijk van het type analyse dat zal worden uitgevoerd. Voor het maken van coupes kunnen de teruggewonnen sponsjes worden ingebed in een vriesmedium, zoals optimal cutting temperature compound, of worden geplaatst in 10% formaline voor inbedding en coupesnijden in paraffineblokken, zoals is gedaan voor deze met H&E gekleurde sponsjes.

En in deze coupes van gekleurde trireme-sponzen worden de beste resultaten voor het snijden verkregen wanneer de spons, zoals hier getoond, over de diameter in tweeën wordt gesneden en vervolgens met het snijvlak naar beneden wordt ingebed. Zoals hier wordt gedemonstreerd, moeten de coupes van de spons zo worden genomen dat de volledige breedte van de spons in deze figuur aanwezig is. De spons links is onjuist ingebed of gesneden, wat blijkt uit de verstoorde weefselrand langs de rechterzijde van de coupe, terwijl de intacte spons rechts correct is verwerkt.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het voorbereiden, implanteren, injecteren en verwijderen van polyvinylalcohol-sponzen om wondgenezing bij muizen te bestuderen.