Name: On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer isotachophorese (ITP) voor ionenscheiding en nucleïnezuurzuivering op microfluidische chips. Deze elektrokinetische techniek maakt gevoelige detectie en preconcentratie van analyten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We dankbaar erkennen financiering van DARPA gesponsorde Micro / nanofluïdica Fundamentals Focus (MF3) Center onder contract nummer N66001-10-1-4003, en van DARPA subsidie ​​N660001-09-C-2082.

1. Fysica van ITP ITP vormt een scherpe bewegende grens tussen ionen van soortgelijke kosten. De techniek kan worden uitgevoerd met anionische of kationische monsters, maar we passen deze inleiding tot anionische ITP en noteer dezelfde principes van toepassing op kationische ITP. We kozen LE en TE buffers zodat LE ionen hogere mate doeltreffende elektroforetische mobiliteit. De effectieve elektroforetische mobiliteit, μ = E / E, is de evenredigheidsconstante tussen elektrisch veld, E, en ion drift snelheid, U 13. We hebben een diffuse interface tussen de LE en TE vast te stellen en toe te passen een elektrisch veld gestuurd vanuit de high- geleidbaarheid LE zone van de lage-geleidbaarheid TE zone. Het systeem wordt snel een sterke helling in elektrisch veld in de ITP interface door de niet-uniforme geleidbaarheid profiel. Volgens zijn naam (van het Grieks, &quot;isos&quot; betekent &quot;gelijk&quot;, &quot;takhos&quot;, &quot;snelheid&quot; betekent), TE en LE-ionen reizen op dezelfde, uniforme velocity als gevolg van de niet-uniforme elektrische veld en het behoud van stroom (dit is de zogenaamde &quot;ITP toestand&quot;, zie figuur 1). Het ITP-interface is zelfslijpende: LE ionen die diffunderen in de TE-zone ervaring een sterk herstel van flux en terug te keren naar de leidende zone (en vice versa voor TE-ionen in de LE-zone). Voorbeeld ionen zich in dit interface als de effectieve mobiliteit in de TE zone groter is dan die van de TE co-ionen en hun effectieve mobiliteit in de LE zone kleiner is dan die van de LE co-ionen (zie figuur 1). De zelfslijpende en zich te concentreren eigenschappen van ITP bijdragen aan de robuustheid van deze techniek en maak ITP relatief ongevoelig voor storingen van de interface (bijv. als gevolg van druk-gedreven stroming of veranderingen in de geometrie, zoals weeën, uitbreidingen, en slagen). In de piek modus ITP (zie Figuur 2a en Video&#39;s 1-2), monster ion concentratiesaltijd aanzienlijk lager dan LE en TE ionconcentraties en dus verwaarloosbaar bijdragen tot lokale geleidbaarheid. De verdeling van het monster ionen wordt bepaald door de zelfslijpende interface tussen aangrenzende zones (hier de TE-LE) en de waarde van het monster effectieve mobiliteit opzichte van deze zones 14. Meerdere monsters ionen zich binnen hetzelfde smalle ITP raakvlak regio grotendeels overlappende pieken. De interface en piekbreedte, alsmede de bijbehorende preconcentratiestap factor schaal omgekeerd evenredig met de toegepaste stroom (zie experimenten in figuur 2b) 14. Voor voldoende hoge initiële concentraties in het monster en voldoende accumulatie tijd, sample-ionen tot een drempelconcentratie waarde. Voor volledig geïoniseerd soorten, wordt deze waarde bepaald door de Kohlrausch regulerende functie (KRF). 15 Voor zwakke elektrolyten, wordt bepaald door de Alberty en Jovin functies. 16,17 In plateaustand zoals weergegeven in figuur 3 en Video 3 monster ionen scheiden en zuiveren tot zones lokaal uniforme en constante concentratie in de volgorde bepaald door de effectieve mobiliteit. Zeer verdunde ionen kan nog steeds richten in de piek-modus tussen de plateau zones. In ITP kunnen monster ionen worden ingevoerd in een eindige injectie tussen TE en LE (zie figuur 3) of afwisselend vermengd met de TE-en / of LE (zie figuur 2). Wij verwijzen naar menging in de TE zone &quot;semi-oneindig&quot; injectie, die kan worden gebruikt om continu accumuleren analyt ionen. Continu monster accumulatie verhoogt de gevoeligheid in zowel piek en plateau-modus testen. Echter, eindige injecties komen vaker voor in plateau-modus. Dit is waarschijnlijk omdat de hoge aanvankelijke analytconcentraties in semi-oneindige injectie kan aanzienlijk te verhogen TE geleidbaarheid en een lagere focussen tarieven. Ook volledige reiniging niet mogelijk is semi-oneindig injectie (er remains een eindige concentratie TE). 2. Inrichting reinigen en behandelen Voor de testen die in dit protocol gebruiken we isotroop nat-geëtst (ongeveer D-vormige dwarsdoorsnede) glas microfluïdische chips met een cross-channel ontwerp (zie figuur 1). De volgende reinigen en behandelen protocol is geoptimaliseerd voor borosilicaat en gesmolten silica kanalen, maar kan ook worden gebruikt met glas / PDMS chips. Voer deze schoonmaak procedure voorafgaand aan de experimenten uit te voeren-to-run herhaalbaarheid en de succesvolle toepassing van dynamische coatings die nodig is om elektro-flow (EOF) te onderdrukken garanderen. Het overslaan van dit protocol kan leiden tot een sterke verspreiding van de ITP-interface. 14 <ol><li> Om het kanaal te ontsmetten, vul het Noorden, Oosten en Zuid-reservoirs met 10-20 pl van 10% bleekwater en toe te passen onderdruk bij de West reservoir voor 2 minuten. Bij gebruik van een standaard Remklauw chip caddy, kan vacuum effectief kunnen worden toegepast door simpelweg attaching het brede einde van 200 pi (ongefilterde) pipet op de chip reservoir en het verbinden van de vacuümleiding een 2 mm binnendiameter buis. </li><li> Leeg de reservoirs en spoel het kanaal (zoals in stap 1) met een M natriumhydroxide gedurende 2 minuten. Deze etsen voorzichtig het kanaal wanden, waardoor een schoon borosilicaat oppervlak om te helpen een uniforme oppervlakte-eigenschappen vast te stellen. </li><li> Leeg de reservoirs en schoon met gedeïoniseerd water (DI), dan spoel het kanaal met LE voor ~ 2 minuten. Gedurende deze periode oppervlakte-eigenschappen en dynamische coatings evenwicht binnen het kanaal. </li></ol> 3. Fluorofoor richten in de piek-modus ITP <ol><li> Bereid 1 ml LE bestaande uit 100 mM HCl, 200 mM tris en 1% PVP. </li><li> Bereid 1 ml TE bestaande uit 100 mM HEPES en 200 mM tris. Combineer 90 ul van TE met 10 ul 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Na spoelen met LE, zoals beschreven in deel 2, leeg de West-reservoir en maak een paar keer met DI in of in deder elke LE nog in het reservoir te verdunnen. Vul dit reservoir met 20 pi TE met AF488. </li><li> Plaats de positieve elektrode in het Oosten reservoir en de grond (negatieve) elektrode in het Westen reservoir en toe te passen 2 uA (constante stroom). Het monster piek migreren een constante snelheid uit het Westen reservoir naar het oosten reservoir (zie figuur 1) en de spanning tussen deze reservoirs toenemen als de onderste geleiding TE vult het kanaal. </li></ol> 4. Extractie en zuivering van nucleïnezuren uit gekweekte E. coli De mogelijkheid om selectief te richten ionen maakt ITP een ideale techniek voor biologisch monster voorbereiding. We zuiveren nucleïnezuren van onbehandelde cellysaat door het selecteren van een trailing anion met een effectieve mobiliteit van grootte lager is dan het doelnucleïnezuur maar hoger dan co-ionische PCR-remmers (zoals anionische detergenten, eiwitten en organische oplosmiddelen, ook al aanwezig in high concentratie). Kationische PCR remmers (bijvoorbeeld alkalimetalen en kationische eiwitten en detergentia) migreren in de tegenovergestelde richting en dus ook achter. ITP onttrekt en zich target nucleïnezuren van het monster reservoir, terwijl lagere PCR-remmende species achter (zie figuur 4). <ol><li> Zorg voor een steekproef van of cultuur E. coli-cellen met een dichtheid groter dan 10 8 CFU / ml. </li><li> Breng 1 ml celcultuur in een safe-lock microcentrifugebuis en pellet door centrifugeren bij 4000g gedurende 6 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 80 ul RNAse-vrij water waarna 10 pi van lyseermiddel bestaande uit 10 mM tricine, 10 mM bis-tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, en 5 mg / ml lysozym. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur (lyseren protocol aanpassing van Bercovici et al.. 11). </li><li> Voeg 10 pi 1 M natriumhydroxide om de pH te verhogen tot lysaat ~ 12.5. Voorzichtig bedienen de pipet op en neer totde oplossing wordt helder, en op dat moment lyserende is voltooid. </li><li> Combineer 10 pi van lysaat met 90 pi 50 mM en 100 mM tricine bis-tris. Deze oplossing wordt gebruikt als TE. </li><li> Bereid 1 mL LE bestaande uit 500 mM bis-tris, 250 mM HCl, 1% PVP en 1X SYBR Green II. Vul de microfluïdische chip met LE zoals beschreven in deel 3. </li><li> Om het gezuiverde nucleïnezuur extract voor off-chip analyse na ITP, vervangen inhoud van het reservoir East een PCR-compatibele LE bevattende 50 mM bis-tris, 25 mM HCl en 0,1% PVP. Breng 1000 V tussen de Oost-en West putten om het experiment te beginnen. De huidige tussen deze reservoirs afnemen. </li><li> Aan het einde van het experiment monster elueert in de LE reservoir. Tegelijk met deze elutie, de huidige versus tijd voor dit systeem bereikt meestal een plateau-waarde (sinds weerstand nu wordt gedomineerd door TE ionen gelijkmatig verdeeld in kanaal). Meng voorzichtig het reservoirinhoud door herhaalde pipetteren en pak een 5 ul volume voor analyse met behulp van kwantitatieve RT-PCR. </li></ol> 5. Scheiding van aminozuren met kationische plateau mode ITP en niet-gericht tracer (NFT) voor visualisatie ITP kan worden gescheiden en kleine ionen zich in aangrenzende en detecteerbaar plateaus tussen TE en LE. Dit maakt detectie en identificatie op basis van fysisch-chemische eigenschappen, zoals lokale geleidbaarheid, UV-absorptie, temperatuur sensor, of brekingsindex. Hier tonen een niet-richt tracer (NFT) assay wanneer een fluorescente, co-ionen wordt toegevoegd LE. Deze fluorescerende soort niet gericht, maar de concentratie aanpast aan een lokaal elektrisch veld en daarmee maakt visualisatie van gezuiverd plateau zones (zie figuur 5). <ol><li> Bereid 1 ml LE bestaande uit 100 mM ethanolamine, 200 mM tricine en 1% PVP en 100 pM van de kationogene fluorofoor Rhodamine 6G. </li> &lt;li&gt; Prepare 1 ml TE bestaande uit 20 mM Tris, 40 mM tricine. Bereid monster door mengen 90 ul TE met 10 pi 50 mM elk van arginine en lysine 50 mM. </li><li> Spuit 20 ul LE in het Westen en Noord-reservoirs en proef in het Oosten reservoir. Breng vacuüm bij Zuid-reservoir voor 1 minuut. </li><li> Spoel het Oosten met DI en te vervangen door TE (TE zonder monster). </li><li> Breng 500 V tussen Oost-en West-reservoirs. </li></ol> 6. Representatieve resultaten We tonen isotachopherograms van piek stand experimenten in figuur 2b en nucleïnezuur extractie experimenten in figuur 4. In de piek modus experimenten met een fluorescerende reporter (bijv. AF488, SYBR Green II), de totale fluorescentie-intensiteit kunnen worden geïntegreerd en vergeleken met een ijkcurve kwantitatieve concentratie informatie te verkrijgen. 12 Bovendien, in nucleïnezuur extractie experimenten, is een voorbeeld mag elueren in thij LE reservoir en geëxtraheerd met een pipet voor analyse door kwantitatieve RT-PCR. 10,12 We tonen plateau mode isotachopherograms voor aminozuren scheiding in figuur 5. Fluorescentie-intensiteit (opzichte LE of TE zone intensiteit) kan worden gebruikt voor de identificatie zone, terwijl zone breedte mogelijk kwantificering. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figuur 1. Isotachophoresis (ITP) is een elektrokinetische techniek die gebruikt wordt in microfluïdische toepassingen voor gevoelige detectie en scheiding van ionen. ITP biedt een scheiding, selectief scherpstellen, en preconcentratiestap mogelijkheden. Bovendien is zeer robuust is en ongevoelig voor storingen fysische vanwege zelfslijpend aard. Voorbeeld ionen selectief richten van een leidende (LE) en achterrand elektrolyt (TE) en via de microchannel een constante snelheid bepaald door de snelheid van de leidende ionen in de LE zone. Sample-ionenrichten als hun effectieve elektroforetische mobiliteit wordt tussen haakjes door de effectieve mobiliteit van de LE en TE-ionen. Het schema toont een model ITP experiment waarbij monster continu richt zich tussen de LE en TE zones. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figuur 2. Verdunnen monster ionen focus in &quot;piek mode&quot; ITP. a) Twee verschillende verdunde (c monster &lt;&lt; c LE) soorten focus in piek-modus op het grensvlak gevormd tussen de LE en TE zones. Alleen al de LE en TE bepalen het elektrisch veld, als monster soorten niet significant bijdragen aan de huidige. Voorbeeld ionen gemengd met TE (in een semi-oneindig injectie) en zich tezamen in een ongeveer Gaussische piek de ITP interface. Scherpstellen criterium (weergegeven als ongelijkheden) is van toepassing op sterk geïoniseerd soorten. b) Experimenten met Alexa Fluor 488 (AF488) richtte zich in de piek-modus voor een reeks van toegepaste stromen (zie ook VIDEO 1). Voorbeeld piekbreedte omgekeerd evenredig is met de huidige (voor verwaarloosbare advectief dispersie door elektro flow). 14 zelfscherpend interface tegen dispersie onder druk aangedreven flow (zie Video 2). <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figuur 3. Voorbeeld bevat bij een voldoende hoge concentratie focus &quot;plateau mode&quot; en bepalen lokale geleidbaarheid. We meestal introduceren monster ionen in een eindige injectie tussen de TE en LE. In deze modaliteit, monster ionen gescheiden en volgorde van hun effectieve elektroforetische mobiliteit (zie Video 3). Voor sterk geïoniseerd soorten, zijn de TE en plateau zone concentraties bepaald door de Kohlrausch regulerende functie (KRF, een invariante set in eerste instantie door de LE-zone). Verdun ionen zich blijven richten in de piek-modus tussen plateau zones bracketing hun effectieve mobiliteit. Scherpstellen criterion (weergegeven als ongelijkheden) is van toepassing op sterk geïoniseerd soorten. <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figuur 4. Lysaat voorbereiding en nucleïnezuur extractie met piek-modus ITP. Nucleïnezuur wordt uit E. coli cel culture met behulp van lysozym-assisted alkaline lyserende en gezuiverd door middel van selectieve elektroforetische richten via ITP. TE gemengd met lysaat (bruin) bevat doelnucleïnezuur (groen), eiwitten en potentiële PCR-remmende chemie. De juiste selectie van slepende en het leiden van ionen maakt selectieve concentratie van doelnucleïnezuur terwijl PCR-inhibitoren achter. Totaal nucleïnezuur ITP piek duurt het vaak op een niet-ideale vorm, zoals hier in de inzet afbeelding. Als bewijs van het vitro assay geëxtraheerd totale nucleïnezuur van gramnegatieve bacteriën, Escherichia coli (gelyseerd met natronloog alleen) gezuiverd NA uit lysaat gebruikt ITP, verzameldde afgezogen genetisch materiaal, en uitgevoerd qRT-PCR-analyses voor een succesvolle zuivering van 16S rRNA (rood) en 16S rDNA (groen) van bacteriële cultuur te verifiëren. Negatieve controle drempel cycli voor 16S rRNA (blauw) en 16S rDNA (geel) waren elk meer dan 30 cycli. We voerden qRT-PCR het gebruik van elektrische SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit van Applied Biosystems met 150 nM forward (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) en achteruit (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers, bij de aanbevolen thermische cycli omstandigheden. <img alt="Figuur 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figuur 5. Niet-richt tracer (NFT) assay voor scheiding en detectie van ongelabelde aminozuren. a) Schematische voorstelling van de NFT assay. Een eindige injectie van het monster ionen wordt in de Oost kanaal. We mengen de LE met een tracer kationische fluorofoor met effectieve mobiliteit lager dan de TE-ionen (μ tracer &lt;μ TE). De fluorofoorMen zegt op te treden als een &quot;underspeeding tracer&quot;. Omdat de fluorofoor electromigrates van de LE in zones nu bezet door monster plateaus en TE, maar ervaart een hoger elektrisch veld en daarmee de concentratie toeneemt. Deze verandering in de concentratie leidt tot stappen in de isotachopherogram. b) scheiden van twee aminozuren, arginine en lysine met de NFT assay met Rhodamine 6G de underspeeding fluorescerende tracer. De lichte piek tussen TE en arginine komt vaak voor bij ITP, is niet goed begrepen, en hier heeft geen invloed op het detecteren of de kwantificering van de plateaus. Aanvullende Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Klik hier om de aanvullende film te bekijken</a> . Aanvullende Movie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Klik hier om de aanvullende film te bekijken</a> . Aanvullende Movie 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Klik hier om de aanvullende film te bekijken</a> .

<ol><li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li>
<li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li>
<li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotachophoresis%3A+Theory%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science & Technology. , (1976).</li>
<li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration%2C+separation%2C+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable%2C+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li>
<li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li>
<li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li>
<li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+extraction%2C+isolation%2C+preconcentration%2C+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li>
<li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li>
<li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li>
<li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li>
<li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I%3A+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li>
<li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+dispersion+in+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li>
<li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l%C3%96sungen+und+l%C3%96sungsgemischen%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li>
<li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li>
<li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li>
<li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Het ITP methoden hier gepresenteerde snelle, gevoelige en robuuste detectie en behandeling van ionische moleculen. De belangrijkste uitdaging in het gebruik van ITP is een goede keuze van LE en TE buffers. In anionogene ITP wij meestal kiezen chloride als belangrijkste anion omdat het een sterk zuur met een hoge absolute mobiliteit en dus zeer voorspelbare eigenschappen. Daarom wordt buffer keuze anionogene ITP typisch beperkt tot het kiezen van een goede TE en tegenion. Voor selectieve focus experimenten, TE keuze is van cruciaal belang voor uitsluiting van verontreinigende ionen. In toepassingen waar de verontreinigingen niet aanwezig zijn, de lagere TE effectieve mobiliteit leidt tot een sneller tempo van zich te concentreren. Wij raden u aan de volgende, relatief anionische TE-ionen die zich goed gedragen: MES, MOPS, HEPES, tricine. Keuze van tegenion heeft invloed op zowel het systeem pH en TE effectieve mobiliteit. Vaak tegenionen tris (pKa 8.1) en bis-tris (pKa 6.4). Voor de testen die lager of hoger pH, raden wij u pyridine (pKa 5,25) enethanolamine (pKa 9.5), respectievelijk. In de tabellen 1 en 2 voor anionische en kationische ITP respectievelijk vatten we een aantal nuttige buffer voorbeelden. Wij HCl als anionische LE ion en natrium als kationische LE ion, en we nemen 100 mM ionensterkte van de LE buffer. De lezer zal opmerken dat buffer ionensterkte in protocollen (en in de tabellen 1-2) is altijd groter dan of gelijk aan 10 mM. Hoewel het in theorie de fysica van ITP is van toepassing op ionsterkte lager dan 10 mm, natuurlijke stoffen (bv koolzuur uit reactie tussen water en atmosferische kooldioxide) in de buurt van de 1 mm niveau is vaak beperkt het praktische gebruik van lage ionsterkte buffers. Wij merken op dat signaaltransductie mechanisme niet beperkt tot de assays in dit protocol. Zoals kort besproken in deel 5, in de plateau-modus gezuiverde zones kunnen worden gedetecteerd via veranderingen in de lokale geleidbaarheid, UV-absorberendeBance, temperatuur of brekingsindex. In onze eigen groep, hebben we een methode ontwikkeld waarbij fluorescerende drager amfolyten maakt gebruik van voor de gevoelige detectie en identificatie van onbekende analyten. 5 piek modus experimenten, specifieke probes kunnen worden gebruikt om gericht analyten te labelen. In een voorbeeld maken we gebruik van moleculair beacons - oligonucleotide probes die bij hybridisatie fluoresceren om hun doelsequentie - om doel-DNA of RNA-moleculen te detecteren met een hoge specificiteit 11,18. Hoewel ITP relatief robuust dispersie door drukgedreven stroom en EOF, overmatige EOF kan leiden tot stagnatie van de ITP interface, waarbij de gemiddelde snelheid EOF gelijk wordt aan de ITP snelheid 14. Deze sterke EOF komt vooral bij een hoge pH en lage ionensterkte. Om deze reden adviseren wij het gebruik van buffers met pH 8 of lager en met ionische sterkte op de orde van 100 mm als handig. Onze ervaring is dat PVP is demeest effectieve coating EOF onderdrukking in borosilicaat chips. Vanwege de zeven eigenschappen kunnen PVP niet geschikt voor sommige toepassingen, zoals scherpstelling genomisch DNA. In experimenten, zien we dat de toevoeging van PVP kan sterk genomisch DNA absolute bewegingsvrijheid te beperken (tot het punt waar het niet focussen). In deze gevallen silanol bekleding zoals Sigmacote in samenwerking met een oppervlakteactieve stof (bijvoorbeeld Triton-X 100) kan ook effectief in het verminderen EOF 10. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anion (pKa -1) </td></tr><tr><td> Buffer tegenion (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7.20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> ethanolamine (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6.40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> pyridine (5.18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Effectieve mobiliteit grootte (× 10 -9 m 2 / V / s) van de gecorrigeerde pure analyt zone in anionische ITP waar de LE is 100 mM HCl en 200 mM buffering tegenion. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE kation (pKa +1) </td></tr><tr><td> Buffer tegenion (pKa -1) </td><td> ethanolamine (9.50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6.40) </td><td> pyridine (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Effectieve mobiliteit grootte (× 10 -9 m 2 / V / s) van de gecorrigeerde pure analyt zone in kationische ITP waar de LE is 100 mM natrium en 200 mM buffering tegenion.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENTIA </td></tr><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Gedistilleerd water </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase vrij </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> natriumhydroxide (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> zoutzuur (HCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidon (PVP) </td><td> Polysciences Inc </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 carbonzuur </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lysozym </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> ethanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> Acros Organics (Geel, België) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminozuren </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Vermogen SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> UITRUSTING </td></tr><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Borosilicaat microfluïdische chip </td><td> Caliper Life Sciences Inc </td><td> NS12A </td><td> Wordt geleverd met of zonder plastic caddy </td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Constante stroom en constante spanning werkingsmodi </td></tr><tr><td> Omgekeerde epifluorescerende microscoop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> Gebruik kwiklamp (Olympus) of LED (Thorlabs) voor verlichting </td></tr><tr><td> Filter kubus </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Bekrachtiging / emissie: blauw / groen </td></tr><tr><td> Veilig-Lock microcentrifugebuizen </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifieke reagentia en materialen.

on-chip isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Elektrokinetische technieken zijn een hoofdbestanddeel van microschaal toepassingen omwille van hun unieke mogelijkheid om een ​​verscheidenheid van vloeibare en elektroforetische processen uit te voeren in eenvoudige, compacte systemen zonder bewegende delen. Isotachophoresis (ITP) is een eenvoudige en zeer robuuste elektrokinetische techniek die miljoen-voudige preconcentratiestap 1,2 en efficiënte scheiding en de winning op basis van ionische mobiliteit kan bereiken. 3 bijvoorbeeld, hebben we de toepassing van het ITP aangetoond dat scheiding en gevoelige detectie van niet-gemerkte ionische moleculen (bijvoorbeeld toxinen, DNA, rRNA, miRNA) met weinig of geen monstervoorbereiding 4-8 en de extractie en zuivering van nucleïnezuren uit complexe matrices met celkweek, urine en bloed. 9-12 ITP bereikt richten en af ​​te scheiden met behulp van een aangelegd elektrisch veld en twee buffers binnen een vloeibare kanaals systeem. Voor anionogene analyten wordt de eerste elektrolyt (LE) buffer gekozen such dat de anionen groter effectief elektroforetische mobiliteit dan de anionen van de achterrand elektrolyt (TE) buffer (effectieve mobiliteit beschrijft waarneembare driftsnelheid van een ion en houdt rekening met de ionisatie stand van de ion, zoals beschreven door Persat et al. hebben 13.). Na de oprichting van een interface tussen de TE en LE, wordt een elektrisch veld toegepast, zodanig dat LE ionen bewegen weg van de streek bezet door TE-ionen. Voorbeeld ionen van intermediaire effectieve mobiliteit ras vooruit TE ionen, maar kan niet inhalen LE-ionen, en daarom ligt de focus op de LE-TE-interface (hierna te noemen de &quot;ITP interface&quot;). Verder, de TE-LE vorm gebieden van respectievelijk lage en hoge geleidbaarheid, dat een steile gradiënt elektrisch veld in het raakvlak ITP stellen. Dit veld gradiënt preconcentrates monster soorten richten zij. Een goede keuze van TE en LE de resultaten in het richten en zuivering van de doelsoorten van andere niet-gerichte soorten en, uiteindelijk, de scheiding eend scheiding van het monster soorten. Wij hier herziening van de fysische principes die ten grondslag liggen ITP en bespreken twee standaard modi: &quot;piek&quot; en &quot;plateau&quot; modi. In de top-modus, relatief verdunde monster ionen samen richten zich binnen overlappende smalle pieken op de ITP-interface. In plateau mode, meer overvloedig monster ionen bereiken een steady-state concentratie en te scheiden in de aangrenzende plateau-achtige gebieden in volgorde van de effectieve mobiliteit. Peak en plateau vormen komen voort uit dezelfde onderliggende fysica, maar vertegenwoordigen verschillende regimes van elkaar onderscheiden door de eerste analyt concentratie en / of de hoeveelheid tijd uitgetrokken voor de sample accumulatie. We beschrijven eerst in detail een model piek modus experiment en vervolgens aan te tonen een piek modus test voor de extractie van nucleïnezuren van E. coli cel cultuur. We sluiten af ​​met de presentatie van een plateau-modus test, waar we gebruik van een niet-gericht tracer (NFT) soorten om de scheiding te visualiseren en pervormen kwantificering van aminozuren.

Isotachophoresis (ITP) is een robuuste elektrokinetische scheiding en preconcentratiestap techniek met toepassingen variërend van toxine detectie tot monstervoorbereiding. Wij beoordelen de fysische principes van ITP en de methodologie van het toepassen van deze techniek om twee specifieke voorbeeld toepassingen: scheiding en detectie van kleine moleculen en zuivering van nucleïnezuren uit celkweek lysaat.

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Elektrokinetische technieken zijn een basis onderdeel van toepassingen op microschaal vanwege hun unieke vermogen om diverse fluidische en elektroforetische ...

Het algemene doel van deze video is het presenteren van een elektrokinetische techniek genaamd isotachforese, afgekort ITP, en de microfluïdische toepassingen hiervan voor de gevoelige detectie en scheiding van ionen. Eerst worden de fysieke principes ten grondslag aan ITP besproken, samen met de twee standaard werkingsmodi, namelijk de peak-modus en de plateau-modus. Vervolgens wordt on-chip ITP gedemonstreerd aan de hand van drie experimenten, beginnend met een eenvoudig protocol voor monstervoorconcentratie, waarbij fluorforen worden gedetecteerd door ze te focussen in een scherpe piek. Ten tweede wordt een ITP-assay getoond die wordt gebruikt voor on-chip monstervoorbereiding, waarbij DNA en RNA selectief worden geëxtraheerd uit een bacterieel cellysaat.Ten slotte wordt een labelvrije detectieassay gebruikt om aminozuren te zuiveren en te kwantificeren met behulp van ITP in plateau-modus. Uiteindelijk kunnen aminozuurzuivering, analyt-preconcentratie en selectieve extractie van nucleïnezuren worden bereikt via ITP. Vandaag introduceren we u in de onderliggende fysica en methodologie van een veelzijdige elektrokinetische techniek genaamd isotaferesis.Onze groep is pionier op het gebied van ITP-methoden voor labelvrije detectie, monstervoorbereiding en snelle hybridisatie-assays. We delen drie representatieve assays met u die het vermogen van ITP aantonen om analyten te preconcentreren, lytische zuren te extraheren, en aminozuren te zuiveren en te detecteren. Deze assays benadrukken de veelzijdigheid van ITP en demonstreren de eenvoudige stappen die nodig zijn om reproduceerbare experimenten te waarborgen.In het laboratorium. Bij ITP focussen monsterionen selectief op de interface tussen een leidend en een volgend elektrolyt, respectievelijk afgekort als LE en TE. De monsterionen bewegen zich door het microkanaal met een constante snelheid die wordt bepaald door de snelheid van de leidende ionen.Monsterionen focussen als hun effectieve elektroforetische mobiliteit omsloten wordt door de mobiliteit van LE- en TE-ionen, waarbij mobiliteit wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de driftsnelheid van het ion en het lokale elektrische veld. Monsterionen die gemengd zijn in de TE bewegen sneller dan de omringende TE-ionen en hopen zich daarom op bij de LE-TE-interface. Bovendien is de ITP-interface zelfverscherpend; LE-ionen die in de TE-zone diffunderen, ervaren een sterke herstelstroom en keren terug naar de leidende zone. Hetzelfde geldt voor TE-ionen in de LE-zone.De zelfverscherpende en focuserende eigenschappen van I twee P dragen bij aan de robuustheid van deze techniek en maken deze ongevoelig voor verstoringen aan de interface, zoals door druk gedreven stroming. In de peak-modus zijn de ionconcentraties van het monster aanzienlijk lager dan die van LE- en TE-ionen. Daarom dragen monsterionen onder deze omstandigheden nauwelijks bij aan de lokale geleidbaarheid.Meerdere analyten die zich concentreren binnen het ITP-interfacegebied vertonen grotendeels overlappende pieken. Uiteindelijk kunnen monsterionen een voldoende hoge concentratie bereiken om zich te scheiden en te concentreren in de plateau-modus. In de plateau-modus scheiden monsterionen zich en zuiveren ze zich in zones met een lokale, uniforme en constante concentratie in een volgorde die wordt bepaald door hun elektroforetische mobiliteit.Ionen in plateau-modus bepalen de lokale conductiviteit. Zeer verdunde ionen kunnen nog steeds focussen in piek-modus tussen plateauzones. Voor de assays die in dit protocol worden gepresenteerd, wordt een isotroop nat-geëtste glazen microfluidische chip met een kruiskanaalontwerp gebruikt.ITP kan echter ook worden uitgevoerd in eenvoudige rechte kanalen of capillairen zonder kruispunten of verbindingen. De volgende reinigingsprocedure moet vóór de experimenten worden uitgevoerd om de reproduceerbaarheid tussen runs en de succesvolle toepassing van dynamische coatings ter onderdrukking van de elektro-osmotische stroom te waarborgen. Om het kanaal te aanhoudig te maken, vult u de noordelijke, oostelijke en zuidelijke reservoirs met 10 tot 20 µL van een 10% bleekmiddeloplossing.Indien er een standaard caliper chip caddy wordt gebruikt, bevestig dan het brede uiteinde van een 200 µL pipetpunt aan het westelijke reservoir van de chip en sluit de vacuümlinie aan op een buis met een binnendiameter van 2 mm. Pas gedurende twee minuten vacuüm toe, maak vervolgens de reservoirs leeg en reinig deze grondig door de reservoirs te vullen met gedeïoniseerd water en deze via de vacuümlinie te legen. Voer deze DI-wassing meerdere keren uit.Herhaal dit proces met één molair natriumhydroxide. De kanaaloppervlakken zullen licht worden geëtst, waardoor een schoon borosilicaatoppervlak ontstaat om te helpen uniforme oppervlakte-eigenschappen te vestigen. Reinig de reservoirs met DI-water en spoel vervolgens de kanalen om met le.Gedurende deze periode zullen de oppervlakte-eigenschappen en dynamische coatings binnen de kanalen equilibreren. Bereid ter start van het experiment één milliliter voorlopige elektrolyt en één milliliter nawelpende elektrolyt voor. Combineer vervolgens 90 microliters TE met 10 microliters van één micromolair.Alexa Fluor 488. Na het spoelen met le wordt het westelijke reservoir geleegd en wordt het reservoir meerdere keren gespoeld met di water om eventueel resterende LE in het reservoir sterk te verdunnen. Vul dit reservoir tot slot met 20 microliters TE met kleurstof.Plaats de positieve elektrode in het oostelijke reservoir en de aarding of negatieve elektrode in het westelijke reservoir en breng een constante stroom van twee microamps toe. De piek van het monster zal migreren met een constante snelheid en het voltage tussen de reservoirs zal toenemen naarmate de TE met lagere conductiviteit wordt gevuld. Kernzuren uit onbehandeld cellysaat kunnen worden gezuiverd met ITP door een trailing anion te selecteren met een electrophoretische mobiliteitsmagnitude die lager is dan die van het doelkernzuur, maar hoger dan die van ionische PCR-inhibitoren.Ionische PCR-remmers migreren in de tegenovergestelde richting en blijven daarom ook achter. Om te beginnen, resuspendeer het E. coli-celpellet dat 10⁸ colony forming units bevat in 80 µL RNase-vrij water en voeg 10 µL lysemedium toe; meng voorzichtig en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na incubatie 10 µL 1 M natriumhydroxide toe om de pH van het lysaat te verhogen tot ongeveer 12,5. Bedien de pipet voorzichtig op en neer tot de oplossing helder wordt, op welk punt de lyse voltooid is.Voeg vervolgens 10 µL lysaat toe aan 90 µL 50 mM Racine en 100 mM bis-tris. Deze oplossing kan nu als de te worden gebruikt; bereid daarnaast één ml LE voor met SYBR Green-kleurstof zoals beschreven in het geschreven protocol, en gebruik de LE om de microfluïdische chip te vullen zoals eerder gedemonstreerd. Vervang na het spoelen de inhoud van het oostelijke reservoir door een PCR-compatibele oplossing.Spoel het westelijke reservoir met DI en vul dit met 20 microliters te. Breng 1000 volt aan tussen de oostelijke en westelijke reservoirs om het experiment te starten. De stroom tussen deze reservoirs zal aan het einde van het experiment afnemen.Het monster elueert in het LA-reservoir samen met deze oplossing. De stroom versus tijd voor het systeem bereikt doorgaans een plateauwaarde. Meng de inhoud van het reservoir voorzichtig door de pipet een paar keer op en neer te bewegen.Extraheer vervolgens een volume van 5 µL voor analyse via kwantitatieve R-T-P-C-R-I-T-P, wat ook gebruikt kan worden om kleine ionen te scheiden en te focussen in aangrenzende en detecteerbare plateaus tussen de TE en LE, waardoor detectie op basis van aangetoonde fysisch-chemische eigenschappen mogelijk is. Hieronder volgt een niet-focuserende tracer-assay waarbij een fluorescerende ionische soort aan de le wordt toegevoegd.De fluorescerende soort focust niet, maar de concentratie past zich aan aan een lokaal elektrisch veld, waardoor visualisatie van gezuiverde plateauzones mogelijk wordt. Begin met het bereiden van één milliliter leidende elektrolyt die de kationische Fluor four rod Domine six G bevat en één milliliter slepende elektrolyt. Combineer vervolgens 90 µL TE met telkens 10 µL van 50 mM arginine en 50 mM lysine om het monster te laden voor finite-injectie.Dispenseer 20 µL Ellie in de westelijke en noordelijke reservoirs en dispenseer het aminozuurmonster in het oostelijke reservoir. Pas vervolgens gedurende één minuut een vacuüm toe bij het zuidelijke reservoir. Spoel na het spoelen van het oostelijke reservoir met DI-water de inhoud vervangen door te.Als laatste stap wordt in experimenten in piekmodus met de fluorescente reporter Alexa Fluor 4 88 een spanning van 500 volt aangelegd tussen de oostelijke en westelijke reservoirs. De totale fluorescentie-intensiteit kan worden geïntegreerd en vergeleken met een kalibratieruimte om de kwantitatieve concentratie te bepalen. De hier getoonde informatie betreft experimenten over een reeks aangelegde stroomsterktes die het monster onthullen.De piekbreedte is omgekeerd proportioneel aan de stroom. Dit is een voorbeeld van nucleïnezuurextractie uit een volledig cellysaat met piekmodus ITP. De totale nucleïnezuur-ITP-piek neemt vaak een niet-ideale vorm aan.Bij experimenten voor de extractie van nucleïnezuren wordt het monster geëlueerd in het LE-reservoir en met een pipet onttrokken voor analyse via kwantitatieve R-T-P-C-R resultaten van kwantitatieve reverse transcriptie. PCR verifieert de succesvolle zuivering van 16 s ribosomaal RNA en 16 s ribosomaal DNA uit de bacteriële cultuur; de drempelwaarden voor de cycli (threshold cycles) voor 16 s ribosomaal RNA en 16 s ribosomaal DNA lagen beide boven de 30 cycli, zoals verwacht. Plateau-modus ITP werd uitgevoerd voor twee aminozuren, arginine en lysine, met gebruik van de NFT-assay met RUMINE six G als fluorescerende tracer voor de snelheid.Hier kan de fluorescentie-intensiteit relatief ten opzichte van de intensiteit van de LE- of TE-zone worden gebruikt voor zone-identificatie, terwijl de zonebreedtes kwantificatie mogelijk maken. Na het bekijken van deze video zou u een goed fysiek begrip moeten hebben van ITP en van de methodologie achter drie verschillende ITP-gebaseerde assays. In het bijzonder hebben we laten zien hoe ITP kan worden gebruikt om aminozuren te zuiveren, analyten te preconcentreren en nucleïnezuren selectief te extraheren.Vergeet niet dat werken met hoge spanning uiterst gevaarlijk kan zijn. U dient altijd voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het gebruik van apparatuur die de stroom begrenst en het bewaren van voldoende afstand tot de elektroden.

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit interview, Dr Klapperich bespreekt de fabricage van thermoplastische microfluïdische apparaten en hun toepassing voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostica.

Microfluïdische Aanvragen voor eenmalig gebruik Diagnostics

Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.

Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

In this video, we demonstrate an anion-exchange chromatography technique to purify human calcium-binding protein S100A12 based on the net surface charge of the protein from an Escherichia coli culture.

Anion-Exchange Chromatography-Based Protein Purification: A Separation Technique to Isolate a Protein of Interest From Dialyzed Bacterial Lysate Based on Net Charge

This video describes the microfluidic capillary electrophoresis technique to separate PCR amplicons based on their size. This technique helps in fragment sizing using fluorescent dyes and standard molecular size markers.

Microfluidic Capillary Electrophoresis for Fragment Sizing of PCR Products: A Microchip-Based Electrophoretic Separation Technique to Separate DNA Fragments Based on Size

We presenteren een discrete druppel monster introductie voor inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICPMS). Het is gebaseerd op een goedkope en wegwerpbare microfluïdische chip die sterk monodisperse druppeltjes in een groottebereik van 40-60 pm bij frequenties van 90 tot 7000 Hz.

Een Microfluïdische Chip voor ICPMS Sample Inleiding

Het doel is om bioactieve kleine moleculen, peptiden uit een complex plantenextract en eiwitten uit pathogene microben te fractioneren en te isoleren door gebruik te maken van de isoelectrische focusmethode (IEF) met vloeibare fase. Verder werden de gescheiden moleculen geïdentificeerd en hun bioactiviteit bevestigd.

Scheiding van bioactieve kleine moleculen, peptiden uit natuurlijke bronnen en eiwitten uit microben door preparative isoelectric Focus (IEF) Methode

De iChip-techniek maakt gebruik van een goedkoop en eenvoudig in-situ isolatieapparaat dat de snelheid van de ontdekking van nieuwe micro-organismen uit de bodem verhoogt. Nieuwe micro-organismen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek met betrekking tot onder meer het bodemmicrobioom of de ontdekking van natuurlijke producten.

Isolatie van bodemmicro-organismen met behulp van iChip-technologie

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Leer isotachophorese (ITP) voor ionenscheiding en nucleïnezuurzuivering op microfluidische chips. Deze elektrokinetische techniek maakt gevoelige detectie en preconcentratie van analyten mogelijk.

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Meer video's verkennen