Name: Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Leer technieken voor het induceren van seksuele ontwikkeling en het evalueren van recombinante nakomelingen in Fusarium graminearum. Deze methode ondersteunt genetisch onderzoek en mutantenscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Science Foundation (MCB-0923794 aan FT).

1. Het produceren van Perithecia <ol><li> Center inoculatie wortel agar 10 in een 6,0 cm diam petrischaal met een vruchtbare stam van F. graminearum (aanbevolen PH-1). </li><li> Plaats geënte schalen onder felle tl-verlichting bij kamertemperatuur (18-24 ° C) en laat ze groeien tot mycelium heeft bereikt de buitenste rand van de petrischaal (3-5 dagen). Commerciële huishoudelijke tl-lampen werken prima voor het stimuleren van vruchtlichaam vorming en afscheiding. </li><li> Verwijder de antenne mycelia met een steriele tandenstoker. </li><li> Verdeel 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq aan de oppervlakte met een steriele glazen hockeystick of afgeronde einde van een steriele glazen staaf. </li><li> Terug platen aan het licht. Voeg geen Parafilm aan platen. </li><li> Na 24 uur dient het oppervlak van de platen hebben een glanzend uiterlijk. Als mycelia opnieuw verschijnt, schraap het oppervlak en breng Tween-60 oplossing. </li><li> Let op de ontwikkeling van perithecia in de komende week. De stadia tijdens hetperithecium ontwikkeling kan worden geoogst door zachtjes te schrapen het oppervlak van de agar en flash bevroren RNA-extractie (figuur 1). </li><li> Oudere sporen zullen zich ophopen op het deksel van de plaat op dag 7. In eerste instantie zullen deze alleen zichtbaar onder een stereomicroscoop, maar door dag 9, zullen ze hebben verzameld om een ​​voldoende dichtheid, zodat zij met het blote oog. </li></ol> 2. Ascospore Discharge Assay <ol><li> Op dag 6 na het aanbrengen van Tween oplossing, snijd een 1 cm diameter cirkel uit de agar met een houten boor. Als alternatief kan een scalpel worden gebruikt om een ​​vergelijkbare grootte segment verwijderen. De cirkel gesneden worden in half en elke halve op een microscoopglaasje. </li><li> Plaats de stukken zodat het oppervlak met de vruchtlichamen loodrecht op het oppervlak van de schuif en de sporen afgevuurd de lengte van de schuif. </li><li> Plaats de dia in een vochtige kamer &#39;s nachts onder lampen. Sporen zullen zich ophopen opde dia en zichtbaar voor het blote oog de ​​volgende ochtend (figuur 2). </li><li> Cumulatieve sporen kan worden gewassen van de dia met water en gekwantificeerd indien gewenst. </li><li> Mogelijke ascospore afvoer remmers kan worden getest door ze aan de achterzijde van de agar blok tijdens montage van de test. Sommige ionkanaal-remmers die de lozingen te beperken zijn eerder getest met deze techniek 15. </li></ol> 3. Generatie van Recombinant Progeny <ol><li> Start over te steken door het enten wortel agar met twee stammen van F. graminearum (een Nit + en een neet-), waarbij de inoculatie punten aan weerszijden van de petrischaal. </li><li> Zodra hyfen hebben het oppervlak gevuld afschrapen antenne gedeelte en toepassing Tween-60 oplossing zoals hierboven beschreven. Gebruik marker vast aan de zijde van de petrischaal waar de hyfen voldoen. </li><li> Keer terug culturen aan het licht en incubeer tot perithecia hebben ontwikkeld, en cirrhi hebben zijnpistool te vormen van de perithecia langs de kruising tussen de twee culturen. </li><li> Onder de microscoop ontleden, te brengen in de perithecia te bekijken langs de kruising van de twee culturen. Met behulp van een insect pin, gesteriliseerd en gedompeld in steriel water, een cirrhus lichtjes aan te raken langs deze grens met de punt van de pen. Het vocht op de pin moet het mogelijk maken de cirrhus vast te houden aan de pin. </li><li> Spoel het uiteinde van de pen met cirrhus op het in 200 pi steriel water in een eppendorfbuisje de sporen wassen. </li><li> Verhit de pin, opnieuw bevochtigen en kies een andere cirrhus. Extra 10-15 cirrhi en plaats elk in een afzonderlijke buis water. </li><li> In het kort vortexbuizen met zwevende cirrhi. </li><li> Verwijder 60 pi van de sporesuspensie met een pipet plaats op MMT medium een in een 9cm petrischaal. Verdeel met een steriel hockeystick. De resterende sporensuspensie worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week en opnieuw geplaat indien nodig. </li><li> Incubatorte bij kamertemperatuur (licht niet noodzakelijk) gedurende 3-5 dagen tot zeer kleine kolonies verschijnen (figuur 3). Er zullen twee soorten fenotypes bij de kolonies. De NIT-koloniën zullen schaarser hyfen dan de Nit + koloniën. Cirrhi van recombinante perithecia zal zowel kolonie fenotypes in ongeveer gelijke verhouding. Gooi de platen met kolonies slechts een fenotype daarop. Merk op dat soms meer dan twee fenotypes leiden door segregatie van andere factoren. </li><li> Ga kolonies op V8 of wortel agar voor opslag. Test kolonies op Dox Agar Czapek (de NIT-stammen zullen niet groeien op Czapek&#39;s Dox) en op de pda met Chloraat (0,5 M Kalium Chloraat, de Nit + stammen zullen niet groeien op de pda met Chloraat) om de juiste fenotype te bevestigen. Controleer deze kolonies voor de gewenste kwaliteiten. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Het produceren van perithecia Het doel is om een ​​gazon vanperithecia zonder mycelia of sporen duidelijk. Het oppervlak van de cultuur zal lijken op zwart fluweel (figuur 1). Bij 24 uur na het aanbrengen van Tween het oppervlak van de agar moet een lichte glans. Als mycelia weer verschijnen, dan is de plaat mag niet genoeg zijn geschraapt om perithecium ontwikkeling te induceren. Ascospore ontslag Zorg altijd voor in uw test een aantal blokken van agar van de wild-type stam. Als u hier geen brand, dan is ofwel uw perithecia zijn te jong of te oud. Als ze te oud zijn, dan is een groot aantal hyfen zal verschijnen over het oppervlak van de cultuur waardoor het een witte tint. Indien dit niet het geval is, kan zij te jong de test opnieuw moet worden beproefd in 24 uur. Af en toe een cultuur heeft geen goed ontladen, en het experiment zal moeten worden herhaald. Zorg ervoor dat u de test onder de juiste lichtomstandigheden. Recombinant nageslacht <p class="jove_content"&gt; Recombinant perithecia moet de meerderheid van perithecia langs de kruising tussen de twee stammen. We gewoonlijk proces 10 cirrhi een kruis minstens 4-6 van deze moet recombinant. Heel af en toe, een mutatie voorkomt dat een soort van dekking. Als een van de ouders een afwijkende groei fenotype, dan meer dan 2 fenotypen aanwezig zijn tussen de kolonies MMT. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Figuur 1. Fasen van perithecium ontwikkeling op wortel agar. Links, 72 uur na het aanbrengen van Tween. Opmerking rood pigment zeer jonge perithecia zichtbaar als een zwart korrels aan het oppervlak. Rechts, op 144 uur, hebben volwassen perithecia gevormd. Let op bijna volledige afwezigheid van oppervlakkige mycelia in beide culturen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Figuur 2. Discharge assay. De oranje wortel agar plug is gericht zo that sporen gedwongen afgevoerd uit de rijpe perithecia op het oppervlak kan ophopen op het oppervlak van het glaasje. 15 uur accumulatie tijd. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Figuur 3. Verschillen in groei tussen Nit + en NIT-kolonies op selectieve MMT&#39;s medium. De NIT-kolonies (pijlpunten) zijn kleiner. De Nit + kolonies (pijlen) tonen een sterke groei. Foto genomen na 7 dagen.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

F. graminearum is bijzonder goed aangepast aan de studie van het vruchtlichaam ontwikkeling als gevolg van de beschikbaarheid van een goed geannoteerde genoom ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), en de beschikbaarheid van een Affymetrix- gebaseerd microarray 6. Hiermee kan het vermogen om genen die belangrijk zijn te identificeren voor ascospore ontlading 7,11,3. De methoden die hier gepresenteerd zal de onderzoeker op een discrete set van ontwikkelingsstadia en functies richten zich voor de genetische analyse van de vruchtlichamen van F. graminearum. De werkwijzen zijn ook gemakkelijk aan verwante schimmels kunnen worden geïnduceerd om fruit in cultuur en kan worden gebruikt als een standaard op tal van andere schimmelsoorten vruchtlichaam types. De mogelijkheid om een ​​spore afvuren fenotype te beoordelen kan subtiel zijn in soorten waar sporen zijn klein en moeilijk te zien, zoals <em&gt; F. graminearum. De collectie van sporen op een schone foto maakt zowel het visuele beoordeling, en kwantitatieve beoordeling, zoals sporen kan worden gewassen van de dia en gekwantificeerd. Sommige schimmelsoorten produceren een slijm dat hun sporen en de sporen kan niet worden afgespoeld omringt, maar moet microscopisch worden geteld als ze blijven op de dia. We hebben dit om waar te zijn van Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Fusarium stam graminearum PH-1 </td><td> Schimmel Genetica Stock Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Dox Agar Czapek&#39;s </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Kaliumchloraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

seksuele ontwikkeling en ascospore lozing in fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum is uitgegroeid tot een modelsysteem voor studies in de ontwikkeling en pathogeniteit van filamenteuze schimmels. F. graminearum gemakkelijkst produceert vruchtlichamen genoemd perithecia op wortel agar. Perithecia bevatten talloze soorten weefsel, geproduceerd in specifieke fasen van perithecium ontwikkeling. Deze bevatten (in volgorde van verschijning) vorming van de perithecium initialen (die aanleiding geven tot de ascogenous hyfen), de buitenwand paraphysen (steriele mycelia waar het centrum van de perithecium bezetten tot asci ontwikkelen), de ASCI en ascosporen in de ASCI 14. De ontwikkeling van elk van deze weefsels wordt gescheiden door ongeveer 24 uur en is de basis geweest van transcriptoom studies tijdens de seksuele ontwikkeling van 12,8. Raadpleeg de Hallen et al.. (2007) voor een meer uitgebreide beschrijving van de ontwikkeling, inclusief foto&#39;s van elke fase. Hier we de werkwijzen voor het genereren en het oogsten synchronely het ontwikkelen van grasvelden van perithecia voor tijdelijke studies van genregulatie, ontwikkeling en fysiologische processen. Hoewel deze werkwijzen worden specifiek geschreven worden gebruikt F. graminearum kan de technieken worden gebruikt voor diverse andere schimmels, mits vruchtlichamen kan worden versterkt cultuur er een synchroon voor ontwikkeling. We hebben onlangs aangepast dit protocol om de seksuele ontwikkeling van F. te bestuderen verticillioides. Hoewel individuele perithecia moet de hand worden geplukt in deze soort, omdat een gazon van het ontwikkelen van perithecia kon niet worden opgewekt, is het proces werkte goed voor het bestuderen van ontwikkeling (Sikhakolli en Trail, niet gepubliceerd). De belangrijkste functie van de schimmel vruchtlichamen is de verspreiding van de sporen. In vele soorten Ascomycota (ASCUS producerende schimmels) worden sporen Schot ASCUS door het genereren van turgor in de ASCUS, rijden uitwerpen van sporen (en epiplasmic vloeistof) door deporie in de ASCUS tip 2,7. Onze studies van gedwongen ascospore ontslag hebben geleid tot de ontwikkeling van een &#39;spore ontlading test &quot;, die we gebruiken om te screenen op mutaties in het proces. Hier dienen de details van deze test. F. graminearum is homothallic en kan dus vruchtlichamen vormen in afwezigheid van een compatibel partner. Het voordeel van homothallism dat kruising is niet nodig nakomelingen homozygoot voor een bepaalde eigenschap een facet de studie van seksuele ontwikkeling vergemakkelijkt deze soort 14,7 genereren. Echter heterothallic stammen gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor kruising 5,9. Het is ook mogelijk om homothallic stammen steken om mutanten verkrijgen meerdere genen in een stam 1. Dit wordt gedaan door coinoculating een petrischaal met 2 stammen. Langs de meeting point, zal de meerderheid van perithecia zijn recombinant (op voorwaarde dat een mutatie in een van de ouders stammen heeft geen remmend effectuitkruising). Als perithecia leeftijd, ademen ze ascosporen massaal in plaats van met geweld te lozen. De resulterende spore exsudaat (een zogenaamde cirrhus) zit op het puntje van de perithecium en kan gemakkelijk verwijderd worden voor het herstel van de individuele sporen. Hier presenteren we een protocol bij de identificatie van recombinant perithecia en het herstel van recombinante nakomelingen te vergemakkelijken.

Seksuele kruisen en isolatie van recombinante nakomelingen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten voor de filamenteuze schimmel,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, De technieken die nodig zijn succes uit te voeren deze processen worden gepresenteerd.

Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum</em

*Fusarium graminearum* is een modelsysteem geworden voor studies naar de ontwikkeling en pathogeniteit van filamenteuze schimmels. *F. graminearum* produceert het gemakkelijkst ...

Het algemene doel van deze procedure is leren hoe de ontwikkeling van parathesia kan worden opgewekt en gemanipuleerd en hoe de APO-lozing in culture kan worden gestimuleerd. Dit wordt bereikt door eerst een actieve groeiende cultuur te induceren om de seksuele ontwikkeling in gang te zetten. De tweede stap is het analyseren van de actieve sporenelozing, waarna recombinante parathesia worden gegenereerd.De laatste stap is het evalueren van het nageslacht op fenotypes die aangeven of er recombinatie heeft plaatsgevonden of niet. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden gebruikt om te screenen op mutanten in de seksuele ontwikkeling of om meerdere mutaties binnen één stam te genereren. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen moeilijk te beschrijven zijn en, hoewel ze eenvoudig zijn, nauwkeurig moeten worden uitgevoerd om een optimale sporenafgifte en een consistente productie van parathesia te verkrijgen.Begin met het centraal inoculeren van een wortelboor in een Petri-schaal van zes centimeter met een fertile stam van f gramine. Arum Incubeer de geïnoculeerde schalen onder heldere standaard commerciële fluorescentieverlichting bij kamertemperatuur.Laat de schimmels drie tot vijf dagen groeien totdat het mycelium de buitenrand van de schaal heeft bereikt. In de zuurkast. Schraap voorzichtig over het oppervlak van de cultuur met de steriele tandenstoker om de luchtmycelia te verwijderen.Breng vervolgens één milliliter surfactant aan op de boor en wrijf dit in het oppervlak met het gebogen of bolvormige uiteinde van een steriele glazen staaf. Breng geen perfil aan. Plaats de platen terug onder de lampen.Na 24 uur moeten de platen een glanzend uiterlijk hebben. Als er opnieuw mycelia verschijnen, schraap dan het oppervlak af, breng de tween 60-oplossing opnieuw aan en stel ze nog eens 24 uur bloot aan licht. Observeer nu gedurende een week de ontwikkeling van de parathesia.Jonge parathesia zijn zichtbaar als zwarte korrels op het oppervlak van de boor. In vergelijking met volwassen parathesia zou er vrijwel geen oppervlakkig mycelium aanwezig moeten zijn.Tegen de zevende dag hopen rijpe sporen zich op het deksel van de plaat op, en tegen de negende dag zijn de sporen zo dicht dat ze zonder vergroting zichtbaar zijn. Om het tussenstadium te oogsten, worden de parathesia voorzichtig met een scalpel van het oppervlak van de boor geschraapt en overgebracht naar een cryobuis. De buis kan vervolgens flash-frozen worden voor RNA-extractie zes dagen na het aanbrengen van het surfactant.Snijd met een houtboor of scalpel een cirkel met een diameter van één centimeter uit de auger. Snijd de cirkel doormidden en monteer de helften op een glazen microscoopglas. Orienteer de stukken zodanig dat het oppervlak met de vruchtlichamen loodrecht op het oppervlak van het objectglas staat en de sporen in de lengte van het glas worden afgevuurd. Indien een acrosporenremmer gewenst is, breng deze dan op dit moment aan op de achterzijde van het augerblok.Deze techniek kan worden gebruikt om chemicaliën te screenen op ontladingsremmers en om genetische mutanten te screenen op het verlies van het vermogen om sporen af te vuren; we hebben beide succesvol uitgevoerd. Incubeer het objectglas vervolgens gedurende de nacht in een eenvoudige, verlichte, bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Terwijl de vruchtlichamen uitbarsten, hopen sporen zich op het objectglas op en zullen deze in de ochtend zichtbaar zijn.Geaccumuleerde sporen kunnen nu van het objectglas worden gewassen, opgevangen in een schone schaal en gekwantificeerd worden. Begin met het opzetten van een genetische kruising tussen twee stammen van f gramine arum door deze te inoculeren aan tegenovergestelde zijden van een wortelboor-petrischaal. Laat de schimmels, zoals eerder beschreven, groeien tot de hyfen het oppervlak hebben gevuld.Schraap de bovengrondse delen weg en breng T tussen 60 oplossing aan. Markeer in dit scenario de plaat waar de hyfen elkaar raken. Plaats de culturen terug in het licht en incubeer deze gedurende ongeveer zeven dagen, totdat de parathesia zijn ontwikkeld en Siri begint te vormen vanuit de parathesia langs de intersectie tussen de culturen.Deze techniek kan worden gebruikt om meerdere mutaties in één stam te combineren. Het is ook vermeldenswaardig dat zowel knit plus als knit minus geselecteerd kunnen worden, waardoor dit een zeer nuttige selecteerbare marker is. Breng onder de dissectiemicroscoop de parathesia in beeld langs de intersectie van de twee culturen.Zoek vervolgens het sear-oog. Doop nu een gesteriliseerde insectennaald in steriel water en raak met de naald een sereus aan dat zich heeft gevormd op de grens tussen de culturen. De SRI's zouden aan het vocht van de naald moeten hechten.Spoel vervolgens de punt van de naald af in 200 µL steriel water in een microcentrifugebuisje van 1,5 mL. Flammeer de naald, bevochtig deze opnieuw en neem een andere sru op. Neem drie tot vijf Siri op en breng deze allemaal over naar een eigen buisje.Vortex nu kortstondig. Voor elke buis met gesuspendeerde Siri: verspreid 60 µL van de sporensuspensie op een Petri-schaal van 9 mm.Incubeer de platen met MMTS-medium bij kamertemperatuur, met of zonder licht, en bewaar de resterende sporenсусpensie bij vier graden Celsius voor maximaal een week. Na drie tot vijf dagen verschijnen er zeer kleine kolonies op de plaat. Eén fenotype kan onder een microscoop worden gescoord.Knit-negatieve kolonies zullen minder dichte hyfen hebben dan knit-positieve kolonies. Verwijder de platen die slechts één van de fenotypen vertonen. De Siri van recombinante parathesia bevatten beide kolonie-fenotypen in ongeveer gelijke proporties.Bewaar deze platen. Soms treden andere fenotypen op door segregatie van andere factoren zoals kolonies; voor bewaaringsdoeleinden worden de kolonies van de recombinante platen overgebracht naar een V8- of wortelagarplaat om de studie voort te zetten door andere fenotypen te onderzoeken. Zaai de kolonies uit op Chap X dock's agar en op platen met PDA bevatten chloraat. Parathesia groeiden uit tot een zwart fluweelachtig gazon zonder mycelia of sporen.24 uur na het aanbrengen van tween vertoonde het oppervlak van de boor een lichte glans. Indien mycelia opnieuw waren verschenen, is de plaat mogelijk niet voldoende geschraapt om de ontwikkeling van parathesia te induceren. Verschillende blokken van de boor met vruchtlichamen van een wildtype-stam werden klaargezet om hun sporen op glazen objectglazen af te vuren ten behoeve van observatie.De juiste verlichting voor het afvuren werd voorbereid. Parathesia die te jong of te oud waren, vuurden vaak niet af. Wanneer ze te oud waren, verschenen er talrijke hyfen over het oppervlak van de cultuur, waardoor deze een witachtige tint kreeg.Wanneer deze te jong waren, vormden de vruchtlichamen zich niet en werd het experiment herhaald. 24 uur later, toen er 10 Siri werden verzameld uit een kruising, waren er doorgaans minstens zes recombinant, bepaald op basis van een mix van knit-negatieve en knit-positieve fenotypes. In zeer zeldzame gevallen voorkwam een mutatie dat een stam kon paren.Indien een van de ouders een duidelijk groeifenotype vertoonde, waren er meer dan twee fenotypen aanwezig tussen de kolonies op MMTS. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat men moet beginnen met een cultuur die goed is onderhouden en niet gedurende langere tijd opeenvolgend is overgeplaatst. Begin altijd met een cultuur die is opgekweekt uit een stabiele vriesvoorraad.

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.

Gibberella zeae Ascospore Productie en collectie voor microarray experimenten.

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

Hier presenteren we een basisprotocol voor de inductie van P. blakesleeanus paring.

Seksuele kruisingen met de Mucoromyceet Phycomyces blakesleeanus

Mammatumor cellen die luciferase worden subcutaan geïmplanteerd in muizen en gevisualiseerd met behulp van optische beeldvorming om tumoren groei en ontwikkeling niet-invasief in een longitudinale studie monitor.

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

Techniek die nodig is voor het visualiseren van het kloppend hart in de larven en...

Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila</em

Leer technieken voor het induceren van seksuele ontwikkeling en het evalueren van recombinante nakomelingen in Fusarium graminearum. Deze methode ondersteunt genetisch onderzoek en mutantenscreening.

Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum

Meer video's verkennen