Name: Het gebruik van eieren van Schistosoma mansoni Als een In vivo Model van Helminth veroorzaakte longontsteking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer hoe Schistosoma mansoni-eieren longontsteking en immuuncelreacties induceren in muizen. Deze methode onderzoekt Th2-gemedieerde ontstekingsmechanismen en granuloomvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) AI091759 en de Crohn en Colitis Foundation of America&#39;s William en Shelby Modell Family Foundation Research Award (tot MN). Schistosoma-geïnfecteerde muizen werden geleverd door de NIAID schistosome Resource Center (NIAID Contract N01 A130026).

1. Zuiverende Schistosoma mansoni eieren <ol><li> Infect Zwitserse muizen met Webster Schistosoma cercariae, de fase van de infectieuze Schistosoma levenscyclus 8. Als alternatief krijgen schistosoma-geïnfecteerde muizen uit de NIAID Schistosomiasis Resource Center ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Laat muizen 6-7 weken na infectie, waarbij de tijd-punt eieren in de lever en kan teruggewonnen zoals hieronder beschreven worden (zie Fig. 1). </li><li> Euthanaseren muizen met CO 2, en bevochtig met 70% ethanol. Plaats de muis op de rug. Gebruik stompe tang en schaar weg te snijden huid en de onderliggende buikvlies. Accijnzen de lever, die zich onder de ribbenkast en het middenrif. </li><li> Fijn gehakt lever en voeg 20 ml per lever digestiemengsel, samengesteld collagenase / Dispase (0,5 mg / ml), penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 pg / ml) in PBS. Zet Mixture in een 50 ml Falcon buis en incubeer overnacht in een 37 ° C shaker. </li><li> Centrifugeer mengsel bij 400 xg / 3 min / 20 ° C. Giet het overtollige vloeistoffen en vul buis met PBS. Centrifugeer opnieuw en herhaal PBS wassen. Na de laatste centrifugatie, Resuspendeer pellet in 25 ml PBS. </li><li> Zeef de geresuspendeerde pellet via een standaard keuken metalen zeef (gebruik maken van een 50 ml spuit zuiger om mash de lever stukken door in een glazen beker), gevolgd door het passeren van het mengsel door een fijne zeef (gebruik 10 ml spuit om mengsel duwen door de fijne zeef in een tweede bekerglas). </li><li> Doe gespannen mengsel in een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer op 400 xg / 5 min / 20 ° C. Giet voorzichtig uit bovenstaande vloeistof zonder verlies van pellet. Resuspendeer de cellen in 3 ml PBS. </li><li> Overlay meng voorzichtig op een 20% Percoll, 40 ml stijgingspercentage van 8 ml en 32 ml Percoll 0,25 M sucrose (FW = 342,3 dus 8,56 g sucrose/100 mL H 2 0). </li><li> Centrifugeer 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipetteer uit eend gooi gelatineuze bovenste laag van de levercellen. Verwijder ei pellet aan de onderkant met een transfer pipet en in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Was de pellet 3X in 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA met centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C. Resuspenderen in 500 ul PBS. </li><li> Overlay mix op een nieuwe 25% Percoll, 10 ml gradiënt (2,5 ml Percoll en 7,5 ml 0,25 M sucrose) met behulp centrifuge instellingen: 10 min / 800 xg / 20 ° C. </li><li> Was 3X in 10 ml PBS met behulp centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C. </li><li> In de laatste 10 ml wassen, verwijder dan 100 ul om eieren te tellen. Eieren snel af te wikkelen, zodat de Falcon buis moet goed gemengd worden alvorens het verwijderen van monster. Verdun het 100 ul monster met 900 ul PBS. 100 pi van het mengsel te worden beschouwd als druppels op een microscoopglaasje met een stereomicroscoop (1:10). Wide-boring pipetpunten te worden gebruikt. </li><li> Resuspenderen eieren op 50.000 eieren / ml in PBS. Eieren kunnen worden opgeslagen gedurende een aantal maanden bij -80 ° C en een of TWIC ontdooide voor gebruik. Inspecteer voor gebruik onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de eieren nog steeds intact zijn (zie Fig. 1). </li></ol> 2. Intraperitoneale Overgevoeligheid met S. mansoni Eieren: dag 0 <ol><li> Bereid eieren 5000 eggs/100 pi PBS in een 5 ml snapcap buis. Voor injectie, schat 50% meer eieren dan nodig is. </li><li> Laad een 23 gauge 3/4inch naald en een 1 ml spuit met 100 ul van ei suspensie per muis. Eieren af ​​te wikkelen, zodat belasting naald met eieren onmiddellijk vóór gebruik. </li><li> Rock spuit heen en weer om eieren te mengen voorafgaand aan elke injectie, en injecteer intraperitoneaal 100 ul van de schorsing per muis. </li></ol> 3. Retro-orbitale Intraveneuze Challenge met S. mansoni Eieren: Dag 14 <ol><li> Bereid eieren hierboven op 5.000 eggs/100 pi. </li><li> Verdoven muizen gespecialiseerde kamer met isofluraan (4%) of intraperitoneaal met xylazine (10 mg / kg) en ketamine (120 mg / kg). Diepte van Anesthesia wordt bepaald door knijpen van de voetzool en het waarborgen van geen fysieke reactie. </li><li> Na het laden van de 1 ml spuit en 23 gauge 3/4inch naald met eieren, een tang om de naald te buigen in een hoek van 90 ° met de schuine kant naar beneden in de hoek. Zorg dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. </li><li> Plaats muis op een kant. Trek de huid, zodat de ogen zal uitsteken, en injecteer 100 ul in de vaten achter de oogbol in een hoek van 45 ° op de neus. </li><li> Trek de naald en breng lichte druk om het bloeden onder controle. </li></ol> Al deze procedures worden uitgevoerd zorg en muizen worden gecontroleerd tot ze herstellen anesthesie. Deze protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 4. Experimentele Oogst: Dag 22 <ol><li> Euthanaseren muizen met CO 2. </li><li> Wet muis met 70% ethanol, en de plaats op de rug. </li><li> Met behulp van stompe Forceps, pakt de muis buik en maak een kleine incisie in de huid. Verwijder voorzichtig de huid met een schaar en bloot de ribbenkast en het buikvlies. </li><li> Knip het buikvlies. Snijd de abdominale aorta om het bloed te herstellen met een Pasteur pipet. Sla op het ijs. </li><li> Beweeg de lever naar de membraan bloot. Gebruik fijne schaar om het membraan te snijden. Voorzichtig opengesneden de ribbenkast naar het longweefsel bloot te leggen. </li><li> Herstel de parathymic lymfeklieren dat de long drain met fijne pincet. Deze worden gestopt onder de ribben aan weerszijden van de thymus 9. Store op ijs in 1 ml steriele media (DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, alle verkrijgbaar bij Invitrogen). </li><li> Om de BAL te herstellen, en blaas de longen voor histologische analyse moet intratracheale intubatie worden uitgevoerd. Expose de luchtpijp door het bewegen van de speekselklieren naar de zijkant, en placing fijn pincet onder de luchtpijp. Met behulp van fijne schaar, knipte een gat in het midden van de luchtpijp, en steek slang in de longen. Zet slang door koppelverkoop met chirurgische draad. </li><li> Bevestig PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en pomp longen met 1 ml PBS. Voorzichtig op te halen BAL wassen met een spuit. Sla op het ijs. </li><li> Bevestig 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en blaas de longen. </li><li> Verwijder de slang en draai de chirurgische draad om te voorkomen dat lekken van de PFA. </li><li> Voorzichtig ontleden van longweefsel en doe dit in een 50 ml Falcon buis met 5 ml 4% PFA. </li></ol> 5. Voorbereiding van de verkregen weefsels <ol><li> Serum: Na bewaren op ijs gedurende 30 minuten tot 2 uur voor de bloedstolling, serum wordt gewonnen uit het bloed door centrifugeren (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Het serum wordt opgeslagen bij -20 ° C en kan worden gebruikt voor cytokine ELISA of S. mansoni eieren antigeen-specifieke IgG-isotype ELISA&#39;s <sup&gt; 6, 10. </li><li> Lymfeklieren: enkelvoudige cel suspensies worden bereid en celtellingen gebruikt om de grootte van de immuunrespons te evalueren. Om Th2 cel polarisatie te onderzoeken, worden de cellen opnieuw gestimuleerd met S. mansoni eieren antigeen voor 72 uur. Intracellar cytokine vlekken kunnen worden onderzocht door flowcytometrie en supernatanten kan worden teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C ELISA van Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: Cellen zijn pellets (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAS vloeistof wordt teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C voor de analyse van Th2 cytokinen door ELISA. BAL-cellen telt worden gebruikt als een indicatie voor de luchtwegontsteking. Cytocentrifuge preparaten van 10.000-100.000 cellen (500 toeren / min 5/4 ° C), zal gevolgd door kleuring Diffquik kunnen opsomming van ontstekingsinfiltraat 4, 6. Als alternatief kunnen BAL-cellen worden onderzocht door middel van flowcytometrie 6. </li><li> Longweefsel: Lung weefsel is opslaged overnacht bij 4 ° C. Vaste weefsel is in paraffine ingebedde, doorsnede en gemonteerd op dia&#39;s voor histologische en immunofluorescentie analyse. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Dit protocol staan ​​alle stappen die nodig zijn om (i) het opstellen gezuiverd Schistosoma mansoni eieren voor in vivo gebruik (afb. 1), (ii) te sensibiliseren en uitdagen muizen met deze eieren en (iii) organen te herstellen voor het onderzoek van de longen ontstekingsreactie. Deze in vivo model drijft reproduceerbaar een krachtige Th2 long inflammatoire respons. Dit blijkt uit de luchtwegen ontsteking en eosinofilie als gevisualiseerd door BAL-cellen en cytocentrifuge preparaten (afb. 2). H &amp; E gebeitst longcoupes kan worden gecontroleerd ei-geïnduceerde granulomen (Fig. 3a) en immunofluorescente kleuring van longcoupes maakt visualisatie van alternatief geactiveerde macrofagen en Th2 cytokinen geïnduceerde genen zoals weerstandstin-achtige molecule (RELM) α (Fig. 3b). De antigeen-specifieke CD4 Th2 cytokine reactie wordt gecontroleerd door ELISA voor IL-5, IL-4 en IL-13 antigeen gestimuleerde parathymic lymfeknoopcellen (Fig. 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Figuur 1 Schistosoma mansoni ei injectie model vertegenwoordiger foto&#39;s van granulomateuze levers, kenmerk van een hoge S.mansoni-ei-lasten, en van S.mansoni eieren worden getoond -.. Gemiddelde grootte (L) 120 micrometer door (W) 50 um. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Figuur 2. S. mansoni ei injectie rijdt luchtwegontsteking. A. BAL celaantallen (x10 5) van naïeve (N) of S.mansoni (Sm) ei-geïnjecteerde muizen. * P &lt;0.05. B. Cytocentrifuge bereiding van BAL cellen. Mac, macrofagen; Eos, eosinofielen, lymfe, lymfocyten. Bar, 10 pm. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Figuur 3. Visualisatie van pulmonaire granulomen en als alternatief geactiveerde macrofagen rondom het S.mansoni ei. A. Pulmonale granuloom rond de Sm ei (zwarte pijl) werd gevisualiseerd in H &amp; E-gekleurde long secties. B. immunofluorescentiekleuring voor RELMα (groen), mannose receptor (rood) en DAPI (blauw) blijkt alternatief geactiveerde macrofagen (witte pijl) in het granuloom rond de autofluorescente Sm ei (zwarte pijl). Bar, 50 pm. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Figuur 4. S.mansoni ei antigeenspecifieke Th2 cytokinereactie. Afvoeren parathymic lymfeknoopcellen van naïeve (N) of Sm ei-geïnjecteerde muizen werden gestimuleerd met Sm &lt;/ Em&gt; ei antigeen 72 uur, gevolgd door ELISA van supernatanten van IL-4, IL-5 en IL-13. Schaal, ng / ml. * P &lt;0,05.

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier wordt een model in dienst Schistosoma mansoni eieren van type 2 longontsteking veroorzaken beschreven. Kenmerken van dit model zijn de krachtige Th2 immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen granuloomvorming. Aangezien deze parameters afhankelijk van CD4 Th2 celreacties 11 is een nuttig model om de effecten van eiwit-specifieke of lijn-specifieke deleties op Th2 cel respons. Hier is de uitlezingen zou omvatten kwantificering van antigeen-specifieke Th2 cytokines, een analyse van de c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Grootte / Beschrijving </td><td> Vennootschap </td><td> Catalog # </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Verpakken </td><td> Fisher Scientific Co LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Vloeistof </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon 50 ml </td><td> Verpakken </td><td> Valk </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE slang </td><td> 0,58 mm </td><td> Becton Dickinson &amp; Co </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> 250 ml </td><td> Abt Animal Health </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> 100 mg / mL </td><td> Fort Dodge Animal Health </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Mannose receptor antilichaam </td><td> Biotine </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metallic Zeef </td><td> Standaard keuken zeef </td><td> Doel </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Wetenschappen </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 Liter </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 0891 01 </td></tr><tr><td> RELMα antilichaam </td><td> 50 ug </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Chirurgische bericht </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Chirurgische Specialties Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Naald </td><td> 23g, 3/4 inch </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> USA Standard Testing Zeef </td><td> 150 pm, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc </td><td> ASTME-11, Spec. Nr. 100 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 20 mg / ml </td><td> Butler </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

het gebruik van eieren van<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; als een<em&gt; in vivo</em&gt; model van helminth veroorzaakte longontsteking

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasieten zijn bloed staartvinnen die naar schatting 200 miljoen mensen wereldwijd een infecteren. In chronische infectie met Schistosoma de ernstige pathologie, zoals leverfibrose en Splenomegalie, wordt veroorzaakt door de immuunreactie tegen het parasieteneitjes dan de parasiet zelf 2. Parasieteneitjes induceren Th2 respons gekenmerkt door de productie van IL-4, IL-5 en IL-13, de andere activering van macrofagen en de rekrutering van eosinofielen. We beschrijven hier de injectie van Schistosoma mansoni eieren als een model om parasiet-specifieke Th2 cytokine reacties in de longen en de drainerende lymfeklieren, de vorming van pulmonaire granulomen rondom het ei, en luchtwegontsteking te onderzoeken. Na intraperitoneale sensibilisatie en intraveneuze uitdaging, S. mansoni eieren worden vervoerd naar de longen via de longslagaders waar ze worden gevangen in het longparenchymdoor granulomen samengesteld uit lymfocyten, eosinofielen en alternatief geactiveerde macrofagen 3-6. In verband met granuloomvorming, ontsteking in de broncho-alveolaire ruimtes, uitbreiding van de drainerende lymfeklieren en CD4 T-cel activatie kan worden waargenomen. Hier hebben we details van het protocol voor het isoleren van Schistosoma mansoni eieren van besmette levers (gemodificeerd uit 7), sensibiliserende en uitdagend muizen, en het herstellen van de organen (broncho-alveolaire lavage (BAL), long-en drainerende lymfeklieren) voor analyse. We hebben ook vertegenwoordiger van histologische en immunologische gegevens en suggesties voor aanvullende immunologische analyse. Over het algemeen deze methode zorgt voor een in vivo model om helminth geïnduceerde immunologische responsen te onderzoeken in de longen, dat in grote mate van toepassing zijn op de studie van de Th2-inflammatoire ziekten, waaronder worminfecties, fibrotische ziekten, allergische ontsteking en astma. Voordelen van dit model voor de studie van type 2 ontstekingen in de longen zijn de reproduceerbaarheid van een krachtige Th2 ontstekingsreactie in de long en drainerende lymfeklieren, het gemak van de beoordeling van de ontsteking door histologisch onderzoek van de granulomen rondom het ei, en het potentieel voor lange termijn opslag van de parasiet eieren.

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Schistosoma-parasieten zijn bloedzuigers die naar schatting 200 miljoen mensen wereldwijd infecteren 1. Bij chronische infectie met Schistosoma leiden de ernstige ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om longontsteking en immuuncelresponsen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door helminth-eieren te zuiveren uit shta-geïnfecteerde levers. Als tweede stap worden muizen geïmmuniseerd en blootgesteld aan de gezuiverde eieren, wat een krachtige inflammatoire respons in de longen teweegbrengt.Vervolgens worden de longen en de drainerende lymfoïde organen van de muizen geïsoleerd om de mate van de ontstekingsreactie op de helm te beoordelen. De verkregen resultaten tonen een krachtige, door de helm geïnduceerde longontsteking aan, gebaseerd op de rekrutering van ontstekingscellen naar de long en de observatie van de door de eitjes geïnduceerde longpathologie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek enige moeite ondervinden, omdat nauwkeurigheid vereist is bij de dissectie van de long en lymfeklieren, evenals bij de injectie van de eitjes.Het perfectioneren van deze techniek is echter lonend, omdat het de visualisatie mogelijk maakt van een krachtige inflammatoire longrespons op de helmunt-eieren. Karen en laboratoriumtechnici in het laboratorium van Nyer en Greenberg demonstreerden de techniek. Plaats een geëuthanaseerde muis die is geïnfecteerd met Schistosoma circ op de rug en maak een incisie door de huid om het peritoneum bloot te leggen. Verwijder de lever, die zich onder de ribbenkast en het diafragma bevindt. Maal de levers fijn en voeg per lever 20 milliliters digestiemengsel toe, bestaande uit collagenase, dys, base, penicilline en streptomycine in PBS. Plaats dit mengsel in een 50 milliliter Falcon-buis en incubeer dit gedurende de nacht in een shaker bij 37 °C.De volgende dag. Centrifugeer het mengsel. Giet het overtollige vocht af en vul de buis met PBS; centrifugeer opnieuw en herhaal de PBS-wasstap na de laatste centrifugatie.Resuspendeer het pellet in 25 milliliters PBS. Zeef vervolgens het geresuspendeerde pellet door een metalen zeef, gevolgd door een fijne zeef. Plaats dit gezeefde mengsel in een 50 milliliter Falcon-buis en centrifugeer.Giet het supernatant af en resuspendeer het pellet in drie milliliters PBS. Breng het mengsel voorzichtig aan over een 40 milliliter gradiënt van acht milliliters per call en 32 milliliters 0,25 molar sucrose en centrifugeer 10 minuten bij 800 G bij 20 °C.Vervolgens verwijdert u de bovenste laag levercellen met een transferpipet. Neem het eipellet onderin weg en plaats dit in een Falcon-buis van 50 milliliter. Was het pellet drie keer in 10 milliliter PBS met EDTA en EGTA en centrifugeer.Resuspendeer het pellet in 500 µL PBS. Breng dit mengsel over een nieuwe gradiënt van 10 mL, bestaande uit 2,5 mL per call en 7,5 mL 0,25 M sucrose, en centrifugeer. Was het pellet drie keer in 10 mL.PBS en centrifugeren. Zorg ervoor dat de Falcon-buis goed is gemengd en neem 50 µL van de laatste wasstap af. Om de eieren te tellen, dient de 50 µL te worden verdund.Meng met 450 µL PBS en breng 100 µL van dit mengsel aan op een glazen objectglas op de tafel van een dissectiescoop om de druppels te tellen; resuspendeer de eitjes op 50.000 eitjes per mL in PBS. Eitjes kunnen enkele maanden worden bewaard bij -80 °C en één of twee keer worden ontdooid voor gebruik. Inspecteer de eitjes voor gebruik onder een microscoop in een snap-cap buisje van 5 mL om er zeker van te zijn dat ze nog intact zijn.Bereid de eitjes voor voor injectie in een concentratie van 5.000 eitjes per 100 µL PBS. Schat 50% meer eitjes in dan nodig is. Vul een 23 gauge naald van 5/8 inch en een spuit van 1 mL met 100 µL eisuspensie per muis.Schud de spuit voorzichtig heen en weer om de eieren te mengen vóór elke injectie en injecteer 100 µL suspensie per muis intraperitoneaal, 14 dagen na sensibilisatie. Bereid de eieren zoals voorheen voor op 5.000 eieren per 100 µL en vul een spuit van 1 ml met een naald van 23 gauge met de eieren. Gebruik een pincet om de naald in een hoek van 90 graden te buigen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Anestheseer de muis en plaats deze op de zijligging. Injecteer 100 µL van de suspensie in de vaten achter het oog onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de neus. Acht dagen na de intraveneuze challenge wordt de muis geëuthanaseerd en wordt er een kleine incisie in de huid van de buik gemaakt.Snijd het peritoneum open en lokaliseer de abdominale aorta. Snijd de aorta door om bloed op te vangen met een Pasteurpipet en bewaar dit op ijs. Verschuif de lever naar beneden om het diafragma bloot te leggen.Gebruik een fijne schaar om het diafragma door te snijden en snijd voorzichtig verder. Open de borstkas om het longweefsel bloot te leggen. De parathymische lymfeklieren bevinden zich onder de borstkas, boven de longen en aan weerszijden van de thymus.Verwijder de lymfeklieren met een fijne pincet en bewaar deze op ijs in één milliliter steriel medium. Om te beginnen met de intubatieprocedure, schuif dan de speekselklieren opzij om de trachea bloot te leggen. Plaats een fijne pincet onder de trachea en gebruik een fijne schaar.Maak een gat in het midden van de luchtpijp en voer een buisje in de longen in. Bevestig het buisje door het vast te knopen met chirurgisch garen. Bevestig nu een met PBS gevulde spuit van één milliliter aan het buisje en pomp de longen op met één milliliter PBS.Verwijder zorgvuldig het BAL-spoelvocht met de spuit en bewaar dit op ijs. Bevestig vervolgens een spuit van één milliliter, gevuld met 4% paraformaldehyde in PBS, aan de slang en pomp de longen op. Verwijder daarna de slang en knoop de chirurgische draad stevig aan om te voorkomen dat het PFA weglekt.Dissekeer ten slotte zorgvuldig het longweefsel uit en plaats dit in een Falcon-buis van 50 milliliter met vijf milliliter 4% PFA in PBS. Na een incubatie van 0,5 tot twee uur op ijs wordt het verzamelde bloed gecentrifugeerd om de serumlaag te scheiden; het serum kan worden gebruikt voor ELISA's voor IgG-isotypes die specifiek zijn voor het antigen van S. mansoni-eieren. De uitgesneden paracalyrale lymfeklieren kunnen opnieuw worden gestimuleerd met het antigen van S. mansoni-eieren om antigeenspecifieke TH2-cytokinen te analyseren. Na centrifugatie en het pelleten van de cellen wordt de BAL-vloeistof teruggewonnen voor analyse van TH2-cytokinen via ELISA. De BAL-cellen worden teruggewonnen voor cyto-centrifuge-preparatie.Overnacht gefixeerd longweefsel voor histologische en immunofluorescentie-analyse; hier getoond zijn beelden van granulomateuze levers, die kenmerkend zijn voor een hoge last van S. mansoni-eieren. Ook zijn S. mansoni-eieren afgebeeld. Deze figuur representeert luchtweginflammatie veroorzaakt door injectie van S. mansoni-eieren.De grafiek links laat zien dat de BAL-celaantallen veel hoger zijn bij muizen waarin s mansoni-eieren zijn geïnjecteerd in vergelijking met naïeve muizen. De afbeeldingen links zijn representatieve cytocentrifuge-preparaten van BAL-cellen; het inflammatoire infiltraat, bestaande uit macrofagen, eosinofielen en lymfocyten, kan hier duidelijk worden gevisualiseerd.Een pulmonaal granuloom rondom het esson-ei is weergegeven in een H&amp;E-gekleurde longsectie. Deze afbeelding toont immunofluorescente kleuring voor realm alpha in het groen. De mano-receptor is in het rood weergegeven en de DPI-kleurstof in het blauw, wat alternatief geactiveerde macrofagen onthult, aangegeven door de witte pijl.Hier wordt de cytokine-respons van TH2-cellen, specifiek voor het eiantigeen van S. mansoni, getoond in de paraïle lymfeklieren van naïeve muizen en muizen geïnjecteerd met S. mansoni. Lymfekliercellen van elke groep werden gedurende 72 uur gestimuleerd met s. mansoni eiantigeen. Vervolgens werd er een ELISA van het supernat uitgevoerd voor IL-4, IL-5 en IL-13.De concentraties van alle drie de inflammatoire cytokinen waren veel hoger in de muizen die waren geïnjecteerd met esman na de ontwikkeling daarvan. Deze techniek biedt onderzoekers in het veld van allergieën en helmintentinfecties een eenvoudige manier om immuuncellen te bestuderen die worden gerekruteerd als reactie op infecties met parasitaire helminthen en allergieën in een muismodel.

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Heligmosomoides polygyrus is een muizen nematode met krachtige immunomodulerende mogelijkheden die sterk lijken op die van zeer voorkomende menselijke worminfecties. Hier beschrijven we een protocol voor het onderhoud van de H. langdurige polygyrus levenscyclus.

Teelt van<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten

Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.

Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

Strongyloides ratti is een parasitaire nematode die voorbijgaande infecties veroorzaakt bij laboratoriummuizen, die weefselmigrerende en darmlevensstadia vertonen. Hier presenteren we een protocol voor het in stand houden van de parasietcyclus bij ratten en experimentele infectie van muizen, inclusief kwantificering van parasieten in het hoofd, de longen en de darmen.

Experimentele infectie van muizen met de parasitaire nematode Strongyloides ratti

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Deze methode toont het kippenembryo als een eenvoudig en kosteneffectief in vivo model om de bacteriële ziekteverwekker L. monocytogenes te doen herleven uit een levensvatbare maar niet-kweekbare (VBNC) toestand en met mogelijke verdere toepassingen bij het begrijpen van bacteriële kiemwerkingsmechanismen.

Kippenembryo als een in vivo model om levensvatbare maar niet-kweekbare pathogenen te doen herleven

Leer hoe Schistosoma mansoni-eieren longontsteking en immuuncelreacties induceren in muizen. Deze methode onderzoekt Th2-gemedieerde ontstekingsmechanismen en granuloomvorming.

Het gebruik van eieren van

Meer video's verkennen