Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerd vervolg te realiseren op het in vivo gedrag van stamcellen die in de muizenhersenen worden getransplanteerd. Dit wordt bereikt door eerst de uit het beenmerg afgeleide stromacellen, die EGFP en luciferase co-expresseerden, te labelen met fluorescente microgrootte ijzeroxidedeeltjes. De tweede stap is het MPIO-gelabelde BMC's in het muizenhersenweefsel te injecteren.

Vervolgens worden het overleven en de lokalisatie van celtransplantaten niet-invasief gevolgd met behulp van bioluminescentie-imaging en magnetische resonantie-imaging. De laatste stap is het valideren van de in vivo beeldresultaten met behulp van postmortem histologische analyse. Deze methode kan inzicht geven in het gedrag van stamcellen na transplantatie in de muizenhersenen, maar kan ook worden toegepast op andere systemen zoals modelorganismen en studies van een ziekte.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de stappen voor het omgaan met dieren moeilijk te leren zijn omdat intraveneuze en intracerebrale injecties moeilijk uit te voeren zijn en bepaalde risico's voor het overleven van dieren met zich meebrengen. Om deze procedure te beginnen, voegt u 75 keer 10 tot zes glazuurblauwe microgrootte ijzeroxidedeeltjes toe aan een sub confluent groeiende celcultuur. Incubeer ze nog 16 uur om deeltjesopname via endocytose mogelijk te maken en was vervolgens de resterende deeltjes weg.

Laat de cellen nog 24 uur groeien om celco fluentie en homogene verdeling van de G-B-M-P-I-O te verkrijgen. Gebruik vervolgens fluorescentiemicroscopie om de deeltjesopname visueel te valideren door de verhouding van EGFP-positieve en G-B-M-P-I-O-positieve cellen te berekenen tot de totale hoeveelheid EGFP-positieve cellen. Was vervolgens de G-B-M-P-I-O, gelabelde BMSC luciferase EGFP cellen twee keer met 10 milliliter.

Behandel de cellen met tripsine EDTA en verzamel ze daarna. Was vervolgens de cellen en suspendeer ze in een uiteindelijke concentratie van 133 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in PBS. Bewaar de cellen tenslotte op ijs tot de transplantatie.

Anesthetiseer de muis in deze procedure door intraperitoneaal een mengsel van ketamine te injecteren van 80 milligram per kilogram en xylazine van 16 milligram per kilogram. Wacht vijf minuten tot de muis in slaap valt en scheer vervolgens zijn hoofd om steriele manipulaties mogelijk te maken. Plaats de muis vervolgens in een stereotactische frame en desinfecteer de huid met alcohol.

Breng vervolgens zalf aan op zijn ogen om uitdroging te voorkomen. Maak een middenlijn incisie in de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen om de hippocampus te targeten. Boor een gat in de schedel op twee millimeter posterieur en twee millimeter lateraal met behulp van een tandheelkundige boortje.

Vortex de celsuspensie op dit punt kort en zuig vervolgens de celsuspensie in de spuit. Laat vervolgens de naaldspuiten zakken tot een diepte van 2,5 millimeter onder de duura en laat de druk een minuut gelijkwaardig worden. Na een minuut trekt u de naald terug naar een positie van twee millimeter onder de duura.

Injecteer vervolgens drie microliters celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde micro-injectiepomp met een snelheid van 0,70 microliters per minuut. Wacht na de injectie nog eens vijf minuten om terugstroom van de geïnjecteerde celsuspensie te voorkomen. Trek vervolgens langzaam de naald terug.

Desinfecteer vervolgens de huidgrenzen en naai de huid. Injecteer 300 microliter 0,9% natriumchloride-oplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis ten slotte onder een verwarmingslamp om te herstellen van de anesthesie om bioluminescentie-imaging uit te voeren.

Anesthetiseer de muis met een mengsel van 3% iso, fluor en zuurstof. Plaats vervolgens de muis in de foton imager. Verlaag de anesthesieniveau door de iso-fluorine aan te passen tot 1,5%. Injecteer vervolgens d Lucifer intraveneus bij 150 milligram per kilogram lichaamsgewicht.

Verkrijg vijf minuten lang een afbeelding met behulp van de fotovisionsoftware. Voer vervolgens beeldverwerking uit met behulp van de M three visionsoftware en kwantificeer het waargenomen signaal met behulp van vaste gebieden van belang. Om magnetische resonantie-imaging uit te voeren, anesthetiseert u de muis met 3% ISO-fluorine in een mengsel van zuurstof en stikstofmonoxide.

Plaats vervolgens de muis in de begrenzer van een horizontaal 9,4 Tesla MR-systeem. Verlaag het anesthesieniveau door de iso-fluorine aan te passen tot 1%. Breng vervolgens zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een rectale sonde om de lichaamstemperatuur te controleren.

Plaats vervolgens een sensor onder de buik van de muis om de ademhalingssnelheid te controleren. Houd de ademhalingssnelheid op 110 plus minus 10 keer per minuut en houd de lichaamstemperatuur constant binnen een nauwkeurig bereik van 37 plus minus 0,5 graden Celsius. Plaats vervolgens de oppervlakte RF-spoel op het hoofd van de muis.

Positioneer de muis in het midden van de magneet. Open vervolgens ParaVision 5.1. Stel de sequentieparameters in volgens het bijbehorende manuscript. Verkrijg vervolgens een set van 10 coronale T twee gewogen spin-echobeelden om specifieke anatomische informatie te verkrijgen.

NT twee ster gewogen gradiënt-echo beelden om stamcelmigratie te bestuderen met een in-plain resolutie van 70 micrometer vierkant. In deze stap wordt de muis opgeofferd en wordt de hersenen verwijderd. Bevestig het hersenweefsel op kamertemperatuur in 4% paraldeyde in PBS gedurende twee uur.

Na twee uur. Ontwater de hersenweefsel door het in verschillende gradiënten van sucrose te plaatsen bij vier graden Celsius. Bevries vervolgens het hersenweefsel met vloeibare stikstof en bewaar het weefsel bij minus 80 graden Celsius tot het gereed is voor sectie.

Snijd het hersenweefsel in 10 micrometer dikke sect