Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Het algemene doel van deze procedure is het realiseren van een gestandaardiseerde follow-up van het in vivo gedrag van stamcellen die in de muizenhersenen zijn getransplanteerd. Dit wordt bereikt door eerst de uit het beenmerg afgeleide stromale cellen, die EGFP en luciferase co-expresseren, te labelen met fluorescerende, micron-grote ijzeroxidepartikels. De tweede stap bestaat uit het op de juiste wijze injecteren van de met MPIO gelabelde BMC's in het hersenweefsel van de muis.

Vervolgens worden de overleving en lokalisatie van de celtransplantaten non-invasief gevolgd met behulp van bioluminescentie-imaging en magnetische resonantie-imaging. De laatste stap is het valideren van de in vivo imaging-resultaten middels postmortale histologische analyse. Deze methoden kunnen inzicht bieden in het gedrag van stamcellen na transplantatie in de muizenhersenen, maar kunnen ook worden toegepast op andere systemen, zoals modelorganismen en studies naar ziekten.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het hanteren van de dieren moeilijk te leren zijn omdat intraveneuze en intracerebrale injecties lastig uit te voeren zijn en bepaalde risico's vormen voor de overleving van het dier. Om deze procedure te starten, voegt u 75 × 10⁶ glacial blue micron-formaat ijzeroxide-deeltjes toe aan een subconfluente groeiende celcultuur. Incubeer deze gedurende nog eens 16 uur om opname van de deeltjes via endocytose mogelijk te maken, en spoel vervolgens de resterende deeltjes weg.

Laat de cellen nog 24 uur groeien om een volledige confluentie en een homogene distributie van de G-B-M-P-I-O te verkrijgen. Gebruik daarna fluorescentiemicroscopie om de opname van deeltjes visueel te valideren door de ratio van EGFP-positieve en G-B-M-P-I-O-positieve cellen ten opzichte van het totale aantal EGFP-positieve cellen te berekenen. Was vervolgens de met G-B-M-P-I-O gelabelde BMSC-luciferase-EGFP-cellen tweemaal met 10 milliliters.

Behandel de cellen met trypsine EDTA in PBS en oog ze vervolgens. Was daarna de cellen en resuspendeer ze in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 133 × 10⁶ cellen per milliliter. Bewaar de cellen tot slot op ijs tot aan de transplantatie.

Anestheseer bij deze procedure de muis door middel van een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (16 mg/kg). Wacht vijf minuten tot de muis in slaap is gevallen en scheer vervolgens de kop om steriele manipulaties mogelijk te maken. Plaats de muis daarna in een stereotactisch frame en desinfecteer de huid met alcohol.

Breng daarna oogsalve aan in de ogen om uitdroging te voorkomen. Maak een midlijnincisie in de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen, zodat de hippocampus kan worden bereikt. Boor met een tandheelkundige boor een gat in de schedel op twee millimeter posterieur en twee millimeter lateraal.

Vortex op dit punt de cel-suspensie kortstondig en zuig vervolgens de cel-suspensie op in de spuit. Breng daarna de naald van de spuit tot een diepte van 2,5 millimeter onder de dura en laat het systeem gedurende één minuut druk-equilibreren. Trek de naald na een minuut terug naar een positie van twee millimeter onder de dura.

Inject vervolgens drie µL celstuspensie met een geautomatiseerde micro-injectiepomp met een snelheid van 0,70 µL per minuut. Wacht na de injectie nog vijf minuten om terugstroming van de geïnjecteerde celsuspensie te voorkomen. Trek daarna de naald langzaam terug.

Desinfecteer vervolgens de huidranden en hecht daarna de huid. Injecteer subcutaan 300 µL 0,9% natriumchlorideoplossing om dehydratie te voorkomen. Plaats de muis tot slot onder een warmtelamp om het herstel van de anesthesie mogelijk te maken alvorens de bioluminescentie-imaging uit te voeren.

Anestheseer de muis met een mengsel van 3% isofluraan en zuurstof. Plaats de muis vervolgens in de foton-imager. Verlaag het anesthesieniveau door het isofluraan aan te passen naar 1.5%. Injecteer daarna d-luciferine intraveneus in een dosis van 150 mg/kg lichaamsgewicht.

Verwerf gedurende vijf minuten beelden met behulp van de photo vision-software. Voer daarna beeldverwerking uit met de M three vision-software en kwantificeer het waargenomen signaal met behulp van vaste regions of interest. Voor het uitvoeren van MRI wordt de muis geanestheseerd met 3% ISO-fluorine in een mengsel van zuurstof en stikstofoxide.

Plaats de muis vervolgens in de fixatiehouder van een horizontaal 9.4 Tesla MR-systeem. Verlaag het anesthesieniveau door de isofluoran aan te passen naar 1%. Breng daarna zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een rectale probe om de lichaamstemperatuur te bewaken.

Plaats vervolgens een sensor onder de buik van de muis om de ademhalingsfrequentie te monitoren. Houd de ademhalingsfrequentie op 110 plus of minus 10 keer per minuut en houd de lichaamstemperatuur constant binnen een nauw bereik van 37 plus of minus 0,5 graden Celsius. Plaats daarna de oppervlakte-RF-spoel bovenop de kop van de muis.

Plaats de muis in het midden van de magneet. Open vervolgens ParaVision 5.1. Stel de sequentieparameters in volgens het bijbehorende manuscript. Neem daarna een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo beelden op om specifieke anatomische informatie te verkrijgen.

Maak NT two star gewogen gradiënt-echo beelden om stamcelmigratie te bestuderen met een in-plane resolutie van 70 µm². Offer in deze stap de muis en verwijder de hersenen. Fixeer het hersenweefsel bij kamertemperatuur gedurende twee uur in 4%paraldehyde in PBS.

Na twee uur wordt het hersenweefsel gedehydrateerd door het in verschillende sucrose-gradiënten bij 4 °C te plaatsen. De volgende dag wordt het hersenweefsel bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C tot het moment van coupesnijden.

Snijd het hersenweefsel in secties van 10 micrometer dik met behulp van een cryostaat. Screen vervolgens de niet-gekleurde cryosecties onder een fluorescentiemicroscoop op blauwe fluorescentie van de G-B-M-P-I-O-partikels en groene fluorescentie van de EGFP-expresserende cellen. Screen daarna de niet-gekleurde cryosecties op groen-rode achtergrondfluorescentie van de ontstekingscellen.

De beschreven glacial blue MPIO-labelingsprocedure resulteert in een zeer efficiënte labeling van BMSC-luciferase-EGFP-cellen, wat eenvoudig kan worden gevalideerd middels fluorescentiemicroscopie. Vervolgens, na het transplanteren van G-B-M-P-I-O-gelabelde BMSC-luciferase-EGFP-cellen in het CZS van muizen, kan de overleving van het cellulaire transplantaat worden gemonitord via in vivo bioluminescentie-imaging op basis van luciferase-activiteit. Daarnaast kan de exacte lokalisatie van de getransplanteerde cellen worden gemonitord via in vivo MRI op basis van het ijzergehalte van de glacial blue MPIO.

Ten slotte toont histologische analyse de validatie van de resultaten die zijn verkregen via bioluminescentie-imaging en magnetische resonantie-imaging. Stabiele overleving werd bevestigd door een stabiele EGFP-expressie in de tijd na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van moleculaire imaging om cellulaire en moleculaire gebeurtenissen na stamceltransplantatie te onderzoeken in verschillende diermodellen voor neurodegeneratieve ziekten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u moleculaire beeldvorming uitvoert, waarbij bioluminescentie en magnetische resonantie-beeldvorming worden toegepast, en hoe u in vivo resultaten adequaat valideert met behulp van postmortale histologische evaluatie.