Name: Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer multimodale beeldvorming van stamceltransplantatie in het centrale zenuwstelsel van muizen. Deze methode combineert bioluminescentie en MRI voor niet-invasieve opvolging van celoverleving en lokalisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"&gt; De auteurs werk werd ondersteund door onderzoek te verlenen ID-BOF 2006 van de Universiteit Antwerpen (toegekend aan PPO en AVdL), door onderzoek te verlenen G.0136.11 en G.0130.11 (toegekend aan AVdL, ZB en PPO) en 1.5.021.09. N.00 (toegekend aan PPO) van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen (FWO-Vlaanderen, België), door de SBO onderzoek te verlenen IWT-60838: BRAINSTIM van het Vlaams Instituut voor Wetenschap en Technologie (toegekend aan ZB en AVDL), in deels door een Methusalem onderzoek subsidie ​​van de Vlaamse overheid (toegekend aan ZB), deels door EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005 tot 512146), EG-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004 tot +503.569) , en door de Inter University Attraction Poles IUAP-NIMI-P6/38 (toegekend aan AVDL). Nathalie De Vocht heeft een PhD-stipendium van het FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts is een post-doctoraal onderzoeker van het FWO-Vlaanderen.</p

1. Celpreparaat <ol><li> Experimenten dient te worden gestart met behulp van ex vivo gekweekte stamcellen populaties genetisch gemanipuleerd om de Luciferase en eGFP reporter eiwitten uit te drukken. Hier gebruikt Luciferase / EGFP-expressie muizen beenmerg-afgeleide stromacellen (BMSC-Luc/eGFP) zoals eerder beschreven door Bergwerf et al.. 2, 5. </li><li> Twee dagen voor cel etikettering plaat BMSC-Luc/eGFP cellen een dichtheid van 8 x 10 5 cellen per T75 fles cultuur in 15 ml compleet medium expansie (CEM) aangevuld met 1 ug / ml Puromycine. </li><li> Laat cellen gedurende 48 uur toenemen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voeg 5 x 10 6 Glacial Blue microscopisch kleine deeltjes ijzeroxide (GB MPIO) per ml cultuur medium om de groeiende cel cultuur (totaal: 75 x 10 6 deeltjes per 15 ml kweekmedium in een T75 cultuur kolf). </li><li> Incubeer gedurende 16 uur om de deeltjes opname via endocytose toe te staan. </li><li> Was de weg resterende deeltjesen laat cellen groeien gedurende 24 uur aan cel confluentie en homogene verdeling van het GB MPIO verkrijgen. </li><li> Visueel valideren deeltjes opname met fluorescentiemicroscopie door het tellen van de verhouding van EGFP + en GB MPIO + cellen de totale hoeveelheid van EGFP + cellen. </li><li> Wash GB MPIO-gelabelde BMSC-Luc/eGFP cellen twee keer met 10 ml PBS en oogst cellen na trypsine-EDTA-behandeling (5 ml per T75 cultuur kolf gedurende 5 minuten). </li><li> Was geoogste cellen en hersuspenderen van eindconcentratie van 133 x 10 6 cellen / ml in PBS. </li><li> Houd cellen op ijs tot transplantatie. </li></ol> 2. Cel implantatie in het CZS van Muizen <ol><li> Verdoof muizen door een intraperitoneale injectie van een ketamine (80 mg / kg) + xylazine (16 mg / kg) mengsel. </li><li> Wacht 5 minuten zodat muizen in slaap te vallen. </li><li> Scheer met de muis hoofd toe te staan ​​voor steriele manipulaties. </li><li> Plaats de muis in een stereotactische frame. </li><li> Ontsmetten van dehuid en nat de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen. </li><li> Maak een middellijn hoofdhuid incisie aan de schedel bloot te leggen, en boor een gat in de schedel met een tandartsboor braam op de aangegeven coördinaten: 2 mm achter en 2 mm lateraal van bregma. </li><li> Vortex de celsuspensie kort en zuig de celsuspensie in de spuit. </li><li> Plaats de naald op een diepte van 2,5 mm onder de dura en laat de druk equilibratie gedurende 1 minuut. </li><li> Injecteer 3 pi celsuspensie (4 x 10 5 cellen) op een diepte van 2 mm onder de duur en met een snelheid van 0,70 pl / min met een automatische micro-injectie pomp. </li><li> Wacht nog 5 minuten om terugstromen van de geïnjecteerde celsuspensie voorkomen. </li><li> Langzaam trekken de naald en desinfecteren van de huid grenzen van voor het hechten van de huid. </li><li> Subcutaan injecteren 300 pi 0,9% NaCl-oplossing om uitdroging te voorkomen, en plaats de muis onder een warmtelamp om te herstellen van anesthesie. Dien post-operatieve analgeticum in overeenstemming met de institutionele normen. </li></ol> 3. In vivo Bioluminescentie <ol><li> Verdoven de muizen door een mengsel van 3% isofluraan en zuurstof. </li><li> Plaats de muizen in de Photon imager en vermindering van anesthesie-niveau tot 1,5% isofluraan en zuurstof. </li><li> Injecteer 150 mg D-luciferine per kg lichaamsgewicht intraveneus. </li><li> Ontvangen van het beeld gedurende 5 minuten met behulp van de Photo Vision software. </li><li> Voer beeldverwerking met behulp van de M3vision software. Kwantificeer het waargenomen signaal met behulp van een vaste regio&#39;s van belang. </li></ol> 4. In vivo magnetische resonantie beeldvorming <ol><li> Verdoven de muizen met 3% isofluraan in een mengsel van O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Plaats de muizen in de restrainer een horizontale 9.4 Tesla MR, de vermindering anesthesie niveau 1% isofluraan in een mengsel van O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Maak de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomenTIE, bevestig een rectale sonde om de lichaamstemperatuur te controleren en de ademhaling te controleren door het plaatsen van een sensor onder de muis buik. </li><li> Houd ademhaling bij 110 ± 10 ademhalingen per minuut en houdt de lichaamstemperatuur constant binnen een nauwe bandbreedte van 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Plaats het oppervlak RF spoel op de muis kop en de positie van de muis in het midden van de magneet. </li><li> Schaf een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo (SE) beelden op specifieke anatomische informatie en T2 *-gewogen gradient echo (GE) beelden te verkrijgen om stamcelmigratie studeren met een in-plane resolutie van 70 micrometer 2. Stel sequentie parameters als volgt: repetitietijd (TR): 500 ms, echo tijd (TE): 8 ms (GE sequentie) en repetitietijd (TR): 4200 ms, echo tijd (TE): 12,16 ms (SE volgorde); gezichtsveld (FOV): 18x18 mm 2, matrix: 256x256, 1 mm slice dikte en 1 mm slice scheiding (Paravision 5.1 software). </li><li> Voer gegevensverwerkingmet Amira 4.0 software. </li></ol> 5. Post Mortem Histologie <ol><li> Verdoof de muizen heel diep door inademing van een isofluorane (4%), zuurstof (0,5 L / min) en stikstof (1 L / min) mengsel gedurende 2 minuten. Offer de muizen door cervicale dislocatie. </li><li> Verwijder muizenhersenen van de schedel en fixeren het hersenweefsel in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 2 uur. </li><li> Dehydrateer het hersenweefsel door het plaatsen van de hersenen vervolgens in verschillende gradiënten van sucrose: 2 uur in 5% sucrose in PBS, 2 uur bij 10% sucrose in PBS, &#39;s nachts in 20% sucrose in PBS. </li><li> Bevries hersenweefsel met vloeistof stikstof en opslaan het weefsel bij -80 ° C tot snijden. </li><li> Sectie het hersenweefsel bij 10 micrometer dikke panelen met behulp van een cryostaat. </li><li> Scherm onbesmet vriescoupes voor blauwe fluorescentie van de GB MPIO deeltjes en groene fluorescentie van de eGFP uiten cellen met behulp van een fluorescentie microscoop. </li><li> Scherm ongekleurd vriescoupes voorgroen / rode achtergrond fluorescentie van ontstekingscellen. </li><li> Voer verder immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen aan endogene celpopulaties (bijv. microglia, astrocyten, T-cellen, ...) de interactie met cellulaire grafts te identificeren. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Wij hier visueel voorgesteld een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor een succesvolle multimodale beeldvorming van Luciferase / eGFP-expressie (stam) cel populaties in het CZS van muizen. Eerst de beschreven GB MPIO kenmerken procedure resulteert in zeer efficiënte labeling van BMSC-Luc/eGFP cellen, die gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentiemicroscopie (Figuur 2A). Vervolgens bij het ​​enten van GB MPIO BMSC-Luc/eGFP gekenmerkt het CZS van muizen kunnen overleven van de cellen graft worden gecontroleerd door in vivo BLI gebaseerd op luciferase-activiteit (Figuur 2B). Daarnaast kan de exacte ligging van getransplanteerde cellen worden gecontroleerd door in vivo </em&gt; MRI gebaseerd op het ijzergehalte van het GB MPIO (Figuur 2C). Tot slot, histologische analyse maakt het mogelijk de validering van de resultaten van BLI en MRI. Stabiele overleving werd bevestigd door een stabiele eGFP uitdrukking in de tijd (Figuur 2D). Voor deze, colokalisatie van EGFP-expressie cellen met blauwe fluorescerende MPIO staat voor de exacte bepaling van de lokalisatie en de overleving van de getransplanteerde cellen. Bovendien is deze twee fluorescerende kenmerken van de stamcellen vermindert de kans op vals-positieve resultaten gebaseerd op fluorescentie achtergrond die door inflammatoire cellen 5 nemen. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van de behandeling volgorde <ol class="lroman"><li> Cell etikettering: BMSC-Luc/eGFP zijn voorzien van 5 x 10 6 GB MPIO deeltjes per ml kweekmedium. Na 16 uur incubatie en een volgende rusttijd van 24 uur werden cellen geoogst voorintracerebrale implantatie. </li><li> Cell implantatie: GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP zijn geënt in de hersenen van muizen op de volgende coördinaten: bregma -2 mm, 2 mm rechts van de middellijn en 2 mm onder dura. </li><li> In vivo BLI: Na intraveneuze toediening van 150 mg D-luciferin/kg lichaamsgewicht, werd het gegenereerde licht verworven gedurende 5 minuten met behulp van de Photon Imager. </li><li> In vivo MRI: Een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo (SE) beelden en T2 *-gewogen gradient echo (GE) beelden met een in-plane resolutie van 70 micrometer 2 werden verworven. Sequence parameters waren als volgt: repetitietijd (TR): 500 ms, echo tijd (TE): 8 ms (GE sequentie) en repetitietijd (TR): 4200 ms, echo tijd (TE): 12,16 ms (SE volgorde); gezichtsveld (FOV): 18x18 mm 2, matrix: 256x256, 1 mm slice dikte en 1 mm slice scheiding. </li><li> Post-mortem histologie: 10 pm dik cryosection werden gescreend op eGFP uiten en blauw fluorescent gelabelde BMSC uzingen een fluorescentie microscoop. </li></ol><img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> Figuur 2. Multimodale beeldvorming van stamcel transplantatie <ol class="ualpha"><li> Directe immunofluorescentie microscopie van Glacial blauw (GB) MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP. </li><li> In vivo BLI van muizen geïnjecteerd met 4x10 5 GB MPIO BMSC-Luc/eGFP cellen gelabeld in week 1 en week 2 na de implantatie. Statistische analyse van de gevonden BLI signalen in week 1 en week 2 na de implantatie. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde aantal fotonen per seconde per steradiaal per vierkante centimeter (ph / s / sr / cm 2) van 5 minuten tijd + / - standaardafwijking berekend op een vaste gebied van belang in muizen met een duidelijk BLI signaal op de injectieplaats. </li><li> Coronale tweedimensionale MRI van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP (linker paneel: (i) T2-gewogen spin-echo-beeld en (ii) T2 *-gewogen gradiënt echo beeld) en niet-gemerkte BMSC-Luc / eGFP (rechterkant van het scherm: (iii) T2-gewogen spin-echo-beeld en (vi) T2 *-gewogen gradiënt echo beeld) transplantaten in de hersenen van muizen. </li><li> Histologische analyse van de GB MPIO BMSC-Luc/eGFP implantaten label in week 2 na de implantatie. (I) Directe immunofluorescentie-analyse voor het lokaliseren van eGFP-expressie en GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP enten. (Ii) hoge vergroting detail van (i). (Iii) Immunofluorescente kleuring voor GFAP antigeen, met vermelding van de ontwikkeling van astrocytaire littekenweefsel in de omgeving van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP. (Vi) Immunofluorescente kleuring voor Iba-1 antigeen, met vermelding van de invasie en de omgeving van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP door microglia. </li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodriguez-Porcel%2C+M+%22Molecular+imaging+of+stem+cells%22">Molecular imaging of stem cells</a>. , (2008).</li>
<li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1(2009).</li>
<li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain%27s+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li>
<li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li>
<li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Luciferase%2FeGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li>
<li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li>
<li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li>
<li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li>
<li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo%3A+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li>
<li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li>
<li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke%3A+a+serial%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li>
<li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles%3A+a+comprehensive+study%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li>
<li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li>
<li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li>
<li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li>
<li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li>
<li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li>
<li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li>
<li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics%3A+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li>
<li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li>
<li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D%3A+-luciferin%3A+effect+on+intensity%2C+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2%2FBCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li>
<li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li>
<li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li>
<li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression%3A+implications+for+stem+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li>
<li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter%3A+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor de combinatie van drie elkaar aanvullende beeldvormende technieken (BLI, MRI en histologie) voor gedetailleerde karakterisering van cellulaire implantaten in het CZS van immuun-competente muizen. Een combinatie van reportergen etikettering van de cellen, op basis van genetische modificatie met de reporter genen Firefly luciferase en eGFP, en een direct cel etikettering met GB MPIO, leidt tot een nauwkeurige beoordeling van de stamcellen grafts in vivo.<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> Onderdeel van de cel groeimedium CEM </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> Onderdeel van de cel groeimedium CEM </td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> Onderdeel van de cel groeimedium CEM </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> Onderdeel van de cel groeimedium CEM </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> Onderdeel van de cel groeimedium CEM </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> ant-pr-1 </td><td></td></tr><tr><td> trypsine </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> Bangs Laboratories </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferine </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine (Ketalar) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (Rompun) </td><td> Bayer Gezondheidszorg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl-oplossing </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> Merck </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> sucrose </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-injectie pomp </td><td> KD wetenschappelijke </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> Photon imager </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4 Tesla MR-scanner </td><td> Bruker BioSpin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM cryostaat </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> injectiespuit </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 30 gauge naald </td><td> Hamilton </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Foto Vision software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1 software </td><td> Bruker BioSpin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira 4.0-software </td><td> Visage Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging van stem cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van muizen

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

In de afgelopen tien jaar heeft stamceltransplantatie kreeg steeds meer interesse als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid van ziekten, zowel in de preklinische en klinische studies. Echter, tot op heden de resultaten met betrekking tot functioneel resultaat en / of weefsel regeneratie volgende stamceltransplantatie zijn zeer divers. Over het algemeen wordt een klinisch voordeel waargenomen, zonder diepgaande kennis van het onderliggende mechanisme (s) 1. Daarom hebben meerdere inspanningen geleid tot de ontwikkeling van verschillende moleculaire beeldvormende technieken om stamcellen enten met het uiteindelijke doel om nauwkeurig te evalueren overleven, het lot en de fysiologie van geënte stamcellen en / of hun micro-omgeving te bewaken. Veranderingen waargenomen in een of meer parameters bepaald door moleculaire beeldvorming kan worden gerelateerd aan de waargenomen klinisch effect. In deze context, onze studies richten zich op het gecombineerd gebruik van bioluminescentie (BLI), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en histologische analysis om stamcel transplantatie te beoordelen. BLI wordt vaak gebruikt om niet-invasief te voeren cel volgen en te controleren overleving van de cel in de tijd na de transplantatie 2-7, op basis van een biochemische reactie waarbij cellen die de Luciferase-reporter-gen in staat zijn om licht volgende interactie uit te stoten met zijn substraat (bijv. D- luciferine) 8, 9. MRI anderzijds een niet-invasieve techniek die klinisch toepassing 10 en kan worden gebruikt om nauwkeurig cellulaire grafts lokaliseren met zeer hoge resolutie 11-15 hoewel de gevoeligheid sterk afhankelijk van het contrast gegenereerd na labeling cel met een MRI contrastmiddel . Tot slot, post-mortem histologische analyse is de methode bij uitstek om onderzoeksresultaten verkregen met niet-invasieve technieken met de hoogste resolutie en gevoeligheid te valideren. Bovendien eindpunt histologische analyse laat ons toe om uit te voeren gedetailleerde fenotypische analyse van geënte cellen en / of het omliggende weefsel, based op het gebruik van fluorescerende reporter eiwitten en / of direct cel labeling met specifieke antilichamen. Samenvattend kunnen we hier visueel tonen de complementariteit van BLI, MRI en histologie aan verschillende stamcel-en / of milieu-gerelateerde kenmerken na stamcel transplantatie in het CZS van muizen te ontrafelen. Als voorbeeld beenmerg-afgeleide stromacellen, genetisch gemanipuleerd om de versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en vuurvlieg luciferase (fluctuaties), en voorzien van blauw fluorescerende microscopisch kleine ijzeroxide deeltjes (MPIOs) drukken, worden geënt in de CNS van immuun-competente muizen en het resultaat zal worden gecontroleerd door BLI, MRI en histologie (figuur 1).

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Gedurende het afgelopen decennium is er een groeiende belangstelling ontstaan voor stamceltransplantatie als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid aan ziekten, ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerde follow-up te bewerkstelligen van het in vivo gedrag van stamcellen die in de muizenhersenen zijn getransplanteerd. Dit wordt bereikt door eerst de uit het beenmerg afgeleide stromale cellen, die EGFP en luciferase co-expresseren, te labelen met fluorescerende micron-formaat ijzeroxidepartikels. De tweede stap is het correct injecteren van de met MPIO gelabelde BMC's in het hersenweefsel van de muis.Vervolgens worden het overleven en de lokalisatie van de celtransplantaten niet-invasief gevolgd met bioluminescentie-imaging en magnetische resonantie-imaging. De laatste stap is het valideren van de in vivo imaging-resultaten middels postmortale histologische analyse. Deze methoden kunnen inzicht bieden in het gedrag van stamcellen na transplantatie in de muizenhersenen, maar kunnen ook worden toegepast op andere systemen, zoals modelorganismen en ziektestudies.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het hanteren van de dieren moeilijk aan te leren zijn omdat intraveneuze en intracerebrale injecties lastig uit te voeren zijn en bepaalde risico's vormen voor het overleven van het

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Daynac, M., et. al. Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates time-lapse imaging of neural stem cells (NSCs) from a transgenic mouse brain using a confocal laser scanning microscope. NSCs fluoresce red during the G1 phase and are non-fluorescent in other cell-cycle phases. An adhered NSC culture is placed in the imaging chamber, imaging parameters are...

Time-Lapse Imaging of Mouse Neural Stem Cell Division Using Confocal Microscopy

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Implantatie van autologe en allogene bottransplantaten, vormen aanvaarde benaderingen tot grote craniofaciale botverlies te behandelen. Toch is het effect van transplantaat samenstelling op de interactie tussen neovascularisatie, celdifferentiatie en botvorming is onduidelijk. We presenteren een multimodale beeldvorming protocol gericht op de angiogenese-osteogenese afhankelijkheid van het transplantaat nabijheid helderen.

Computed Tomography en optische beeldvorming van Osteogenesis-angiogenese Koppeling te beoordelen Integratie van schedelbot Autografts en Allografts

Dit protocol demonstreert methodologieën voor een muismodel van open-schedel traumatisch hersenletsel en transplantatie van gekweekte menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen in de wond site. Gedrags-en histologische tests van uitkomsten van deze procedures worden ook in het kort beschreven.

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

Een methode voor het leveren van neurale stamcellen, aanpasbaar voor het injecteren van oplossingen of schorsingen, via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) na ischemische beroerte wordt gemeld. Geïnjecteerde cellen worden breed verspreid over de hersenen parenchyma en kan worden gedetecteerd tot 30 d na de bevalling.

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

De vertaling van de bevindingen van intravitale microscopie wordt uitgedaagd door de geringe dieptepenetratie in het weefsel. Hier beschrijven we een muismodel met dorsale vensterkamer dat co-registratie van intravitale microscopie en klinisch toepasbare beeldvormingsmodaliteiten (bijv. CT, MRI) mogelijk maakt voor directe ruimtelijke correlatie, waardoor de klinische vertaling van intravitale microscopiebevindingen mogelijk wordt gestroomlijnd.

Een dorsaal huidplooi raamkamer tumor muismodel voor gecombineerde intravitale microscopie en magnetische resonantie beeldvorming in translationeel kankeronderzoek

Leer multimodale beeldvorming van stamceltransplantatie in het centrale zenuwstelsel van muizen. Deze methode combineert bioluminescentie en MRI voor niet-invasieve opvolging van celoverleving en lokalisatie.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Meer video's verkennen