Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc Aplysia
July 15th, 2012
We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding van Aplysia. We beeld intracellulaire calcium met een fluorescerende kleurstof, Calcium Orange en induceren en synaptische transmissie controle met scherpe (intracellulair) elektroden.
Intracellulair calcium is betrokken bij verschillende mechanismen van synaptische plasticiteit. Deze ideeën kunnen worden getest door gelijktijdig veranderingen in calcium en veranderingen in synaptische efficiëntie te monitoren. Hier laten we zien hoe dit wordt bereikt door calciumbeeldvorming te combineren met intracellulaire opname.
Onze experimenten worden uitgevoerd met een ganglion van de weekdier Aplysia Cahora. Deze bereiding heeft een aantal voordelen, zoals grote geïdentificeerde neuronen, de lage temperaturen die natuurlijk zijn voor apia, langzame signalen en vergemakkelijken beeldvorming, maar de algemene technieken die we demonstreren, zijn gemakkelijk overdraagbaar naar andere systemen. Hallo, ik ben Colin Evans in het laboratorium van Elizabeth Cropper in de Fishburg Department of Neuroscience en het Freedman Brain Institute aan de Mount Sinai School of Medicine in New York City.
Vandaag gaan we gelijktijdige beeldvorming van veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en synaptische efficiëntie in het buccale ganglion van de weekdier Aplysia cahora demonstreren. Om intracellulair calcium te detecteren, zullen we een pre-synaptisch neuron injecteren met de cel IMP doorlatende calciumindicatorkleurstof calcium oranje. De bereiding wordt vervolgens onder de microscoop verplaatst en pre- en postsynaptische neuronen worden doorboord met scherpe elektroden.
Herhaalde presynaptische stimulatie resulteert in een verbeterde postsynaptische respons, zichtbaar als toenemende postsynaptische potentiaal of PSP amplitude. Het meten van het fluorescerende signaal van de calciumindicatorkleurstof zal ons in staat stellen om gelijktijdige veranderingen in presynaptisch intracellulair calcium te detecteren. Om te beginnen verdoven we een volwassen dier van ongeveer 150 gram door 75 milliliter isotone magnesiumchloride-oplossing te injecteren, spelden het verdoofde dier op een met was bedekte schaal, en maken vervolgens met grove pincetten en een schaar een insnijding in de voet van het dier en leggen de buccale massa bloot.
Het buccale ganglion ligt aan de ventrale kant van de buccale massa en bestaat uit twee verbonden hemiganglia. Het bevat enkele honderden neuronen die samen met neuronen in andere ganglia bijdragen aan de generatie en controle van het voedingsgedrag van het dier. Bevrijden we het ganglion zorgvuldig door alle gekrompen zenuwen met fijne schaar door te snijden en verwijderen het uit het dier.
Speld vervolgens het bevrijde ganglion aan de basis van een met silbergeschikt beklede schaal gevuld met kunstmatig zeewater. Het ganglion is gewikkeld in een mantel van bindweefsel, die moet worden verwijderd om de individuele neuronen bloot te leggen. Gebruik verifiërende pincetten, irisschaar en uiterste zorg om deze mantel weg te snijden.
Om schade aan neuronen te voorkomen, stabiliseren we het demantelde ganglion met ongeveer 15 minuten pincet, omdat elke beweging problematisch zal zijn tijdens beeldvorming. Om scherpe elektroden voor intracellulaire opname en kleurstofinjectie voor te bereiden, trekken we capillaire buisjes met een micro-elektrodetrekker. We gebruiken dunne wandfilamentboa silicaatglas met een buitendiameter van één millimeter.
De opnameelektroden moeten een weerstand hebben van ongeveer 10 mega wanneer gevuld met drie molaire kaliumacetaat, en dus passen we de trekker aan om de D-elektroden te vullen. Dompel de achterkant van de getrokken elektrode in een 10 millimolair oplossing van de calcium oranje kleurstof capillaire actie langs het glasfilament in de elektrode zal kleurstof naar de punt trekken, vul vervolgens de elektrode met 200 millimolair kaliumchloride om een goede elektrische contact te garanderen. We gebruiken een op maat gemaakte Bela om de elektrode-eigenschappen te verbeteren en de weerstand van de opname-elektrode te verlagen tot ongeveer vijf mega.
De elektrode wordt op een hoek van 45 graden in een stroom van een aluminiumoxidesuspensie gehouden. Het mengen van natriumchloride in de suspensie en het aansluiten van een omemeter maakt het mogelijk om de weerstand van de elektrode te bewaken. Tijdens het beitelproces brengen we de schaal met de bedrieglijke gesneden bundels naar een elektrofysiologie-opstelling en lokaliseren we de neuronen van belang door ze te doorboren met elektroden en hun identiteit te verifiëren.
Om neuronen voor calciumbeeldvorming voor te bereiden, steken we eerst een kleurstof gevulde elektrode in de cel soma en laden we de kleurstof elektrotheoretisch met 30 minuten hyperpolariserende 15 nano amp stroompulsen. Terwijl de D calcium oranje de cel binnenkomt, zal de SOR een zwakke roze kleur krijgen. We trekken vervolgens voorzichtig de opname-elektroden terug en laten de bereiding minimaal 30 minuten zitten om de kleurstof in de fijne processen van de neuronen te laten diffunderen.
Breng vervolgens de schaal met de bereiding over naar een fluorescentiemicroscoop. We gebruiken een 10 keer NA 0,3 waterimmersielens op een rechte vaste microscoop, die focust door de lens te verplaatsen en niet door de tafel. Dit maakt het gemakkelijker om manipulatoren te monteren.
Selecteer voor de opname-elektroden een geschikte filterblok. Een SI drie filterblok zal de juiste excitatie- en emissiefilters voor calcium oranje bieden, pas de cameraparameters en de verlichtingsintensiteit aan met neutraal dichtheidsfilters en het velddiafragma. Meer licht zal resulteren in minder ruis, maar kan mogelijk de bereiding bleken.
De cool snap CCD-camera kan een veld van 500 bij 300 pixels vastleggen met een framesnelheid van ongeveer 30 frames per seconde en een goede signaal-ruisverhouding. Minimaliseer de verlichting van de fil neuronen door de sluiter van de lichtbronnen zo vaak mogelijk gesloten te houden. Selecteer in de beeldvormingssoftware regio's van belang of R ois.
Deze regio's definiëren waar de software intensiteitsmetingen zal doen. We beelding algemeen primaire, secundaire en tertiaire takken van het presynaptische neuron. Plaats een extra ROI naast de difi neuron om een achtergrondwaarde te verkrijgen die later wordt afgetrokken van alle andere datapunten.
Intracellulaire opname-elektroden in de pre- en post-synaptische neuronen worden gebruikt om synaptische transmissie te induceren en te monitoren. U kunt synchronisatie tussen elektrofysiologisch en beeldvormingsgegevensverwerving borgen als u het trigger-frame-signaal van de camera gebruikt om de gegevensverwervingssoftware te starten. Een andere manier om synchronisatie te garanderen, is om een LED
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie toont de gelijktijdige monitoring van de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische efficiëntie in een ganglionpreparaat van Aplysia. Met behulp van Calcium Orange voor beeldvorming en scherpe intracellulaire elektroden voor synaptische transmissie, benadrukt het onderzoek de relatie tussen calciumdynamica en synaptische plasticiteit.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Synaptische plasticiteit
- Calciumbeeldvorming
Achtergrond
- Intracellulair calcium speelt een cruciale rol in synaptische plasticiteitsmechanismen.
- Gelijketijdige monitoring van calcium en synaptische efficiëntie kan inzicht geven in deze mechanismen.
- Aplysia ganglionpreparaat biedt voordelen voor dergelijke studies.
- De gedemonstreerde technieken kunnen worden aangepast aan andere systemen.
Doel van de studie
- Om de rol van intracellulair calcium in synaptische transmissie te onderzoeken.
- Om een methode te demonstreren voor gelijktijdige monitoring van calcium en synaptische efficiëntie.
- Om Aplysia te gebruiken als modelorganisme voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Gebruikte methoden
- Calciumbeeldvorming met behulp van de fluorescerende kleurstof Calcium Orange.
- Intracellulaire opname met scherpe elektroden om synaptische transmissie te monitoren.
- Experimenten uitgevoerd op een ganglion van de weekdier Aplysia.
- Gebruik van grote geïdentificeerde neuronen voor effectieve beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gelijktijdige monitoring van calciumconcentratie en synaptische efficiëntie.
- De relatie tussen calciumdynamica en synaptische transmissie werd aangetoond.
- De voordelen van het gebruik van Aplysia voor dergelijke studies werden benadrukt.
- Een methodologie werd geboden die toepasbaar is op andere biologische systemen.
Conclusies
- Intracellulair calcium is essentieel voor het begrijpen van synaptische plasticiteit.
- De gecombineerde beeldvormings- en opnametechnieken zijn effectief voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Aplysia dient als een waardevol model voor het bestuderen van synaptische mechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic link between intracellular calcium dynamics and synaptic efficacy is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. This approach enables predictive confidence in pathway modulation by directly linking a key second messenger to functional synaptic output. The Aplysia ganglion model provides a disease-relevant system for probing conserved plasticity mechanisms with high signal-to-noise and experimental stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether modulating intracellular calcium alters synaptic transmission in identified neurons.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of calcium flux and postsynaptic potential changes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by establishing causal relationships between calcium signaling and synaptic efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with normal ion channel distribution and stable synaptic connections for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers ratiometric-free fluorescence intensity changes correlated with electrophysiological readouts for high-content analysis.
- Scalability: Uses long-wavelength dye Calcium Orange requiring no filter wheel, simplifying imaging setup and increasing throughput potential.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic plasticity mechanisms applicable to neuropsychiatric and neurodegenerative disorder targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism probing with preclinical validation through standardized calcium-synaptic readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how target modulation affects both calcium dynamics and functional synaptic output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking target engagement (via calcium modulation) to functional phenotypic outcomes (synaptic efficacy), supporting lead identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about calcium-dependent signaling pathways in synaptic plasticity using direct perturbation and dual-readout measurement.
- Screening: Enables assay standardization through stable preparations, low phototoxicity dyes, and synchronized electrophysiology-imaging data collection.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ΔF/F fluorescence and PSP amplitude) that allow comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating intracellular calcium changes with synaptic efficacy in a disease-relevant invertebrate model of conserved neural mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing calcium-dependent synaptic mechanisms across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in calcium-synapse relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dye loading, electrode preparation, and synchronization via LED trigger.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets implicated in synaptic dysfunction.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on dual-modality readouts of target engagement and functional effect.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intracellular sharp electrode recording and calcium imaging techniques.
- Depends on fluorescence microscopy capable of 30 fps imaging and electrophysiology rigs with LED synchronization.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for synchronized data acquisition.
- Involves adaptation considerations when transferring the Aplysia ganglion preparation to other model systems with different neuronal sizes or synaptic properties.
- Limited by the inability of Calcium Orange to provide absolute calcium concentrations due to non-ratiometric nature and dye diffusion variables.
